用于产生具有改变的生物碱水平的烟草植物和制品的方法及其组合物与流程

用于产生具有改变的生物碱水平的烟草植物和制品的方法及其组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年12月3日提交的美国临时申请62/942,957的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
3.序列表的并入
4.命名为“p34775wo00_sl.txt”、283,115字节(在中测量)并且于2020年12月2日创建的文件中含有的序列表与本技术一起以电子方式提交并且通过引用以其整体并入。
技术领域
5.本公开包括烟草植物以及由所述烟草植物生产的烟草制品，所述烟草植物具有改变的总生物碱和烟碱水平和商业上可接受的叶等级的，它们通过育种或转基因方法培育。


背景技术：

6.烟碱是在烟叶中积累的主要生物碱。烟碱和其它少量生物碱(例如，降烟碱，假木贼碱和新烟草碱)也是烟草特异性亚硝胺(tsna)的前体。需要培育具有较低烟碱水平的烟草栽培品种。
7.在商业烟草栽培品种中，烟碱占总生物碱库(pool)的90-95％或总叶干重的2-5％。烟碱在根中合成，并通过木质部转移到植物的地上部分，在那里它在叶中积累并通过毛状体响应昆虫吸食而渗出。
8.需要鉴定可被工程化以减少生物碱的基因，更具体地，减少烟碱而不影响叶表型的基因，以及培育含有改变的烟碱水平(例如，减少的烟碱)同时维持(如果不产生更优异的)烟草叶质量的烟草植物和制品。


技术实现要素：

9.一方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其包含在基因中的遗传修饰并下调所述基因的表达或活性，其中所述基因编码与选自由seq id nos:19-36组成的组的多核苷酸序列具有至少80％的同一性的核酸序列。
10.一方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其包含在基因中的遗传修饰并下调所述基因的表达或活性，其中所述基因编码与选自由seq id nos:19-36组成的组的多核苷酸序列具有至少80％的同一性的核酸序列。
11.另一方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其包含在与选自由seq id nos:1-36组成的组的多核苷酸序列具有至少80％同一性的多核苷酸中的非天然突变。
12.一方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含可操作地连接到编码非编码rna分子的多核苷酸的异源启动子，其中所述非编码rna分子能够结合与选自由seq id nos:19-36组成的组的多核苷酸序列具有至
少80％的同一性的mrna。
13.另一方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其包含在基因中的遗传修饰并下调所述基因的表达或活性，其中所述基因编码与选自由seq id nos:37-54组成的组的多核苷酸序列具有至少80％的同一性或相似性的多肽。
14.一方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其包含靶向基因的遗传修饰并下调所述基因的表达或活性，其中所述基因编码与选自由seq id nos:37-54组成的组的多核苷酸序列具有至少80％的同一性或相似性的多肽。
15.一方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其在多核苷酸中包含非天然突变，所述多核苷酸具有编码与选自由seq id nos:37-54组成的组的氨基酸序列具有至少80％的同一性或相似性的多肽的核酸序列。
16.另一方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与编码非编码rna分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码rna分子能够结合编码与选自由seq id nos:37-54组成的组的氨基酸序列具有至少80％的同一性或相似性的多肽的rna，其中所述非编码rna分子抑制所述多肽的表达。
17.一方面，本公开提供了本文所述的烟草植物群体、来自本文所述的烟草植物的熟化烟草材料、以及再造烟草、烟草混合物和由熟化烟草材料制成的烟草制品。
18.另一方面，本公开提供了用于产生低生物碱的烟草植物的方法，所述方法包括：(a)下调基因的表达或活性，所述基因编码(i)核酸序列，所述核酸序列与选自由seq id nos:1-36组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性，或(ii)氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自由seq id nos:37-54组成的组的多肽序列具有至少90％的同一性或相似性；以及(b)从所述烟草植物收获叶或种子。
附图说明
19.图1a：dixie杯中的体外nicotiana tabacum(普通烟草)小植株是在固体murashige和skoog琼脂培养基上种子萌发并初始生长后获得的，所述培养基补充有维生素和30gl-1
蔗糖。将幼苗在24℃下保持16/8h光周期。图1b：在dixie杯中生长约5周之后，将生根的转化体转移到温室中的土壤中，并在环境阳光条件下自养培养。
20.图2：用包含用于本工作的rnai构建体的农杆菌(agrobacterium)转化体体对普通烟草(烟草)叶进行体外农杆菌浸润后的瞬时表达。每个农杆菌转化体至少三片叶，包括野生型对照，通过将带有农杆菌混合物的3ml无菌注射器的尖端压入叶的背面来浸润。在农杆菌浸润后48小时收集样品用于分析。
21.图3：来自普通烟草(烟草)的总生物碱叶提取物的分光光度测定。(上部)在350-550nm区域测定的含生物碱溶液的吸收光谱，定义为415nm吸收峰。(下部)415nm处最大吸光度的校准曲线，作为400μl测定溶液中烟碱浓度的函数。
22.图4：用配备有火焰离子化检测器(fid)的shimadzu gc-2014气相色谱装置进行的gc-fid分析显示具有不同烟碱浓度的样品的信号振幅。后者在所采用的实验条件下具有10.2分钟的保留时间。分析显示设备对烟碱浓度的线性响应和12.5μg/ml烟碱的检测极限。
23.图5：转录水平作为t1 rnai转化体烟草叶中基因表达的评价。结果显示衍生自
adc，aic，ao和odc rnai转化体的所有独立事件品系的转录水平显著较低。arg和sams转化体品系表现出混合和/或不一致的结果，其中一些品系具有与野生型可比的转录水平，而其它品系表现出较低的水平。每个样品以一式三份进行。mrna水平的基因表达水平报告为，与对照的那些相比，在rnai构建体存在下每个基因转录物的百分比。
24.图6：来自36个独立的转化体品系的叶的总生物碱含量，所述转化体品系具有6种不同的t1植物rnai构建体，加上早期生长期的野生型对照，而幼苗仍在实验室的dixie杯中。注意到在该早期营养阶段，只有ao1 rnai和一些odc rnai品系显示出比野生型(wt)显著更低的总生物碱含量。相反，所有ao2和sams rnai系显示出比野生型(wt)显著更高的生物碱含量值。在冻干已知重量的新鲜材料(fw)并随后测量所得干生物质(dw)的重量时测量多个样品的平均干重。后者被发现占幼苗叶中的鲜重的约39.5％(
±
2.0％)。
25.图7：在温室中从36个独立的转化体品系收获的叶的总生物碱含量，所述转化体品系具有6种不同的t1植物rnai构建体，加上早期出芽阶段后的野生型对照。在该植物发育阶段，大多数转基因品系中总生物碱的含量与对照(wt)相比更低，而一些ao2和adc品系继续显示出显著更高的值。在冻干已知重量的新鲜材料(fw)并随后测量所得干生物质(dw)的重量时测量多个样品的平均干重。发现后者为温室培育叶鲜重的约34.5％(
±
2.7％)。
26.图8：来自在温室生长的t1植物的叶的烟碱含量。该试验包括36个独立的转化体品系，所述转化体品系具有6种不同的t1植物rnai构建体，加上早期出芽阶段后的野生型对照。与对照(wt)相比，表达ao1-rnai和ao2-rnai的转化体具有最低的烟碱含量。下一个在odc-rnai品系1，13，14和15中观察到烟碱含量的最显著的抑制。并且，adc-rnai具有至少两个具有比野生型低的烟碱含量的品系。相反，品系aic-rnai，arg-rnai和sams2-rnai与野生型对照相比不显示显著差异。
27.图9：在本研究中检测的每种rnai品系中腐胺(a)，亚精胺(b)和尸胺(c)的平均含量。与野生型相比，adc-rnai和odc-rnai品系具有显著更低的腐胺含量，而aic-rnai，arg-rnai和sams-rnai品系具有与对照(wt)中测量的水平可比的腐胺水平。rnai转化体的亚精胺和尸胺含量与对照相比在统计学上是不变的。
28.图10：aic-rnai(a)和ao1-rnai(b)品系中较老叶的表型突变。在所有aic-rnai品系(a)中，完全扩展和最老的叶显示出早期衰老样变色的迹象。类似地，在一些ao1-rnai品系(b)中，完全扩展的和较老的(较低的)叶也显示早期衰老样变色的症状。显示这种表型的品系(ao1品系7，10和11)是具有最低水平烟碱含量的品系。应当注意，与野生型对照相比，这些“早期”着色变化影响转化体的最老的叶，而为了生物碱和烟碱分析而收获的从顶部起第3和第4片叶具有正常绿色色素沉着和其它健康表型，非常类似于野生型对照。这种现象局限于下面的叶，似乎不会影响这些植物的上面的叶，包括那些用于生物碱，烟碱和多胺分析的样品。
29.图11：普通烟草中假定的生物碱生物合成途径示意图。显示了精氨酸和脯氨酸代谢，生物碱生物合成以及烟酸酯和烟酰胺代谢途径，它们可能参与本工作中所述的分析。
30.序列说明
31.seq id nos:1-18列出了生物碱生物合成中涉及的各种基因的基因组dna序列(包括诸如启动子，5'utr，内含子，3'utr和终止子的区域)。
32.seq id nos:19-36列出了生物碱生物合成中涉及的各种基因的cdna序列。
33.seq id nos:37-54列出了生物碱生物合成中涉及的各种基因的多肽序列。
34.seq id nos:55-64列出了示例性rnai序列，所述rnai序列靶向生物碱生物合成中涉及的各种基因。
35.seq id nos:65-84列出了示例性引物序列。
36.各种序列可包括核苷酸序列中的“n”或氨基酸序列中的“x”。“n”可以是任何核苷酸，例如a，t，g，c，或一个或多个核苷酸的缺失或插入。在某些情况下，示出了“n”的串。“n”的数量不一定与该位置上未测定的核苷酸的实际数量相关。实际的核苷酸序列可以比所示的“n”片段更长或更短。类似地，“x”可以是任何氨基酸残基或一个或多个氨基酸的缺失或插入。同样，“x”的数量不一定与该位置上未测定的氨基酸的实际数量相关。实际的氨基酸序列可以比所示的“x”片段更长或更短。尽管在描述序列表中的任何seq id中使用了a，t，g，c(与a，u，g，c相比)，根据提及seq id的上下文，seq id也可以指rna序列。
具体实施方式
37.除非另外定义，否则在此所用的技术性和科学性术语具有与本领域中技术人员通常所理解的相同含义。本领域的技术人员将认识到，在本公开的实践中可以使用许多方法。实际上，本公开决不限于所述的方法和材料。在以单数形式提供术语的情况下，发明人还考虑了由所述术语的复数形式描述的本发明的方面，反之亦然。在通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义存在差异的情况下，本技术中使用的术语应具有本文给出的定义。所使用的其它技术术语具有其在所使用的技术领域中的普通含义，如由各种特定领域的词典所例示，例如“the americanscience dictionary”(editors of the americanheritage dictionaries,2011,houghton mifflin harcourt,boston and new york)，“mcgraw-hill dictionary of scientific and technical terms”(6th edition,2002,mcgraw-hill,new york)或“oxford dictionary of biology”(6th edition,2008,oxford university press,oxford and new york)。
38.本文引用的任何参考文献，包括例如所有专利和出版物，都通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物，专利或专利申请被具体地和单独地通过引用并入。
39.当出现一组备选方案时，特别设想了组成该备选方案组的成员的任何和所有组合。例如，如果项目选自由a、b、c和d组成的组，则本发明人明确地设想了每个单独的替代方案(例如，单独的a、单独的b等)，以及诸如a、b和d；a和c；b和c等的组合。术语“和/或”在两个或多个项目的列表中使用时是指所列项目中的任何一个单独或与任何一个或更多个其他所列项目组合。例如，表述“a和/或b”旨在表示a和b之一或两者-即单独的a、单独的b或a和b的组合。表述“a、b和/或c”旨在表示单独的a、单独的b、单独的c、a和b的组合、a和c的组合、b和c的组合，或a、b和c的组合。
40.当本文提供数值范围时，该范围应理解为包括该范围的边界以及该范围的限定边界之间的任何数值。例如，“1-10”包括在1和10之间的任何数字，以及数字1和数字10。
41.除非上下文另外清楚地指示，否则在此所使用的单数形式“一个/种(a/an)”和“该”包括复数指代。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包含多种化合物，包含其混合物。
42.本文使用的术语“约”意指大约、大致、左右或在
…
的范围中。当术语“约”与数值范
围结合使用时，所述术语通过将边界延伸到所给出的数值之上和之下来修改所述范围，并且应理解为意指加或减10％。例如，“约100”将包括90至110。
43.为了避免任何疑问，本文使用的术语或短语，诸如“约”、“至少”、“至少约”、“至多”、“小于”、“大于”、“在
……
以内”等，当后面跟着一系列百分比数列表时，此类术语或短语被认为修饰系列或列表中的每个百分比数，无论副词、介词或其它修饰短语是否在每个成员之前再现。
44.如本文所用，烟草的“低生物碱品种”(也称为“la品种”)是指包含一种或多种遗传修饰的烟草品种，所述遗传修饰将总生物碱(通过干重测量)降低至低于除了所述一种或多种遗传修饰之外具有基本相似遗传背景的对照烟草品种中的总生物碱水平的25％。作为非限制性实例，ky171可作为低生物碱品种laky171的对照。非限制性地，低生物碱烟草品种包括laburley 21，lafc53，lnb&w和lnky171。类似地，烟草的“低烟碱品种”(也称为“ln品种”)是指包含一种或多种遗传修饰的烟草品种，所述遗传修饰将将烟碱(通过干重测量)降低至低于除了所述一种或多种遗传修饰之外具有基本相似遗传背景的对照烟草品种中烟碱水平的25％。
45.如本文所用，“遗传修饰”是指植物或植物基因组的遗传组成的改变。可以通过包括但不限于诱变，基因组编辑，遗传转化或其组合的方法引入遗传修饰。遗传修饰包括例如基因中的突变(例如非天然突变)或靶向基因的转基因(例如精氨酸脱羧酶(adc)转基因靶向adc基因)。如本文所用，“靶向”是指直接上调或直接下调基因的表达或活性。如本文所用，在影响基因表达或活性的转基因的上下文中，“直接”是指通过基因(例如，启动子区或utr区)或其中编码的产物(例如，mrna分子或多肽)与转基因编码的产物(例如，小的非编码rna分子或蛋白质，如转录因子或显性失活多肽变体)之间的物理接触或化学相互作用对基因施加的影响。一方面，转基因影响靶基因的表达或活性而不涉及转录因子(例如，转基因不编码转录因子和/或不抑制转录因子的表达或活性，所述转录因子进而调节靶基因)。
46.如本文所用，“突变”是指被引入基因以改变由基因的参考序列编码的产物的表达或活性的可遗传的遗传修饰。特定基因中的突变，例如精氨酸脱羧酶(adc)称为adc突变体。该修饰可以在基因的任何序列区域中，例如在启动子、5'utr、外显子、内含子、3'utr或终止子区域中。一方面，突变减少，抑制或消除基因产物的表达或活性。另一方面，突变增加，提高，强化或增加基因产物的表达或活性。一方面，突变不是存在于特定烟草品种或栽培品种中的天然多态性。应当理解，当鉴定突变时，参考序列应当来自相同的烟草品种或背景。例如，如果包含突变的经修饰的烟草植物来自品种tn90，则相应的参考序列应当是内源tn90序列，而不是来自不同烟草品种(例如，k326)的同源序列。一方面，突变是“非天然的”或“非天然存在的”突变。如本文所用，“非天然的”或“非天然存在的”突变是指不是并且不对应于在没有人为干预的情况下产生的自发突变的突变。人类干预的非限制性实例包括诱变(例如，化学诱变，电离诱变诱变)和靶向遗传修饰(例如，基于crispr的方法、基于talen的方法、基于锌指的方法)。非天然突变和非天然发生的突变不包括天然产生的自发突变(例如，通过植物种系中的异常dna复制)。
47.如本文所用，烟草植物可来自烟草属的任何植物，所述烟草属包含但不限于普通烟草(nicotiana tabacum)、抱茎烟草(nicotiana amplexicaulis)pi 271989；本氏烟草(nicotiana benthamiana)pi 555478；毕氏烟草(nicotiana bigelovii)pi 555485；迪勃
纳氏烟草(nicotiana debneyi)；木丝烟草(nicotiana excelsior)pi 224063；粘毛烟草(nicotiana glutinosa)pi 555507；古特斯比氏烟草(nicotiana goodspeedii)pi 241012；野生烟草(nicotiana gossei)pi 230953；西烟草(nicotiana hesperis)pi 271991；奈特氏烟草(nicotiana knightiana)pi 555527海滨烟草(nicotiana maritima)pi 555535；麦格鲁希凤烟草(nicotiana megalosiphon)pi 555536；裸茎烟草(nicotiana nudicaulis)pi 555540；野生烟草(nicotiana paniculata)pi 555545；皱叶烟草(nicotiana plumbaginifolia)pi 555548；残波烟草(nicotiana repanda)pi 555552；黄花烟草(nicotiana rustica)；芳香烟草(nicotiana suaveolens)pi 230960；林烟草(nicotiana sylvestris)pi 555569；绒毛烟草(nicotiana tomentosa)pi 266379；茸毛烟草(nicotiana tomentosiformis)；以及三角叶烟草(nicotiana trigonophylla)pi 555572。一方面，这里描述的烟草植物是普通烟草植物。
48.一方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含上调或下调编码精氨酸脱羧酶(adc)，天冬氨酸氧化酶(ao)或鸟氨酸脱羧酶(odc)的一种或多种基因的表达或活性的遗传修饰。如本文所用，通过比较具有遗传修饰的植物与相应的不具有遗传修饰的对照植物来确定遗传修饰对基因的上调或下调。
49.植物
50.一方面，本公开提供经修饰的烟草植物或其部分，其包含在基因中或靶向基因的遗传修饰，其中所述基因编码与选自由seq id nos:19-36组成的组的多核苷酸序列具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的同一性的核酸序列。一方面，本公开提供经修饰的烟草植物或其部分，其包含在基因中或靶向基因的遗传修饰并下调所述基因的表达或活性，其中所述基因编码与选自由seq id nos:19-36组成的组的多核苷酸序列具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:19-36组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:19，20，23-26，29和30组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:19和20组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:23-26组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:25和26组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:29和30组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:19-36组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:19，20，23-26，29和30组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:19和20组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:23-26组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:25和26组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:29和30组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:19-36组成的组的多核苷酸序列具有
100％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:19，20，23-26，29和30组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:19和20组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:23-26组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:25和26组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性的核酸序列。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:29和30组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性的核酸序列。
51.另一方面，本公开提供经修饰的烟草植物或其部分，其在多核苷酸中包含非天然突变，所述多核苷酸与选自由seq id nos:1-36组成的组的多核苷酸序列具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:1，2，5-8，11，12，19，20，23-26，29和30组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:1，2，19和20组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:1和2组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:5-8和23-26组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:7-8和25-26组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:7-8组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:11，12，29和30组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:11和12组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:1，2，5-8，11，12，19，20，23-26，29和30组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自seq id nos:1，2，19和20的多核苷酸序列具有至少95％同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:1和2组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:5-8和23-26组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:7-8和25-26组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:7-8组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:11，12，29和30组成的组的多核苷酸序列具有至少95％同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变的多核苷酸与选自由seq id nos:11和12组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:1，2，5-8，11，12，19，20，23-26，29和30组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:1，2，19和20组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:1和2组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:5-8和23-26组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:7-8和25-26组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:7-8组成的组的
多核苷酸序列具有100％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:11，12，29和30组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性。一方面，在多核苷酸中的非天然突变与选自由seq id nos:11和12组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性。
52.一方面，本公开提供经修饰的烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与编码非编码rna分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码rna分子能够结合与选自由seq id nos:19-36组成的组的多核苷酸序列具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的同一性的mrna，其中所述非编码rna分子抑制mrna的水平或翻译。一方面，非编码rna分子抑制与选自由seq id nos:19，20，23-26，29和30组成的组的多核苷酸序列具有至少90％的同一性的mrna的水平或翻译。一方面，非编码rna分子抑制与选自由seq id nos:19，20，23-26，29和30组成的组的多核苷酸序列具有至少95％的同一性的mrna的水平或翻译。一方面，非编码rna分子抑制与选自由seq id nos:19，20，23-26，29和30组成的组的多核苷酸序列具有100％的同一性的mrna的水平或翻译。
53.另一方面，本公开提供经修饰的烟草植物或其部分，其包含在基因中或靶向基因的遗传修饰，其中所述基因编码与选自由seq id nos:37-54组成的组的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的同一性或相似性的多肽。另一方面，本公开提供经修饰的烟草植物或其部分其包含在基因中或靶向基因的遗传修饰，并下调所述基因的表达或活性，其中所述基因编码与选自由seq id nos:37-54组成的组的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的同一性或相似性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:37，38，41-44，47和48组成的组的氨基酸序列具有至少90％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:37和38组成的组的氨基酸序列具有至少90％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:41-44组成的组的氨基酸序列具有至少90％同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:43-44组成的组的氨基酸序列具有至少90％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:47-48组成的组的氨基酸序列具有至少90％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:37，38，41-44，47和48组成的组的氨基酸序列具有至少95％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:37和38组成的组的氨基酸序列具有至少95％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:41-44组成的组的氨基酸序列具有至少95％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:43-44组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:47-48组成的组的氨基酸序列具有至少95％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:37，38，41-44，47和48组成的组的氨基酸序列具有100％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:37和38组成的组的氨基酸序列具有100％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:41-44组成的组的氨基酸序列具有100％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:43-44组成的组的氨基酸序列具有100％的同一性的多肽。一方面，下调的基因编码与选自由seq id nos:47-48组成的组的氨基酸序列具有100％的同一性的多肽。
54.一方面，本公开提供经修饰的烟草植物或其部分，其在多核苷酸中包含非天然突
变，所述多核苷酸具有编码与选自由seq id nos:37-54组成的组的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的同一性或相似性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:37，38，41-44，47和48组成的组的氨基酸序列具有至少90％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:37和38组成的组的氨基酸序列具有至少90％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:41-44组成的组的氨基酸序列具有至少90％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:43-44组成的组的氨基酸序列具有至少90％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:47-48组成的组的氨基酸序列具有至少90％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:37，38，41-44，47和48组成的组的氨基酸序列具有至少95％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:37和38组成的组的氨基酸序列具有至少95％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:41-44组成的组的氨基酸序列具有至少95％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:43-44组成的组的氨基酸序列具有至少95％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:47-48组成的组的氨基酸序列具有至少95％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:37，38，41-44，47和48组成的组的氨基酸序列具有100％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:37和38组成的组的氨基酸序列具有100％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:41-44组成的组的氨基酸序列具有100％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:43-44组成的组的氨基酸序列具有100％的同一性的多肽的核酸序列。一方面，在多核苷酸中的非天然突变具有编码与选自由seq id nos:47-48组成的组的氨基酸序列具有100％的同一性的多肽的核酸序列。
55.另一方面，本公开提供经修饰的烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与编码非编码rna分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码rna分子能够结合编码与选自由seq id nos:37-54组成的组的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的同一性或相似性的多肽的rna，其中所述非编码rna分子抑制所述多肽的表达。一方面，被抑制的多肽与选自由seq id nos:37，38，41-44，47和48组成的组的氨基酸序列具有至少90％的同一性或相似性。一方面，被抑制的多肽与选自由seq id nos:37，38，41-44，47和48组成的组的氨基酸序列具有至少95％的同一性或相似性。一方面，被抑制的多肽与选自由seq id nos:37，38，41-44，47和48组成的组的氨基酸序列具有100％的同一性或相似性。低生物碱烟草
56.一方面，烟草植物包含使烟碱水平降低的遗传修饰，例如编码精氨酸脱羧酶(adc)，天冬氨酸氧化酶(ao)或鸟氨酸脱羧酶(odc)的一个或多个基因中的遗传修饰。一方面，包含本文所述的遗传修饰的烟草植物是低生物碱品种或植物。一方面，本公开的烟草植
物包含nic1突变，nic2突变或两者。一方面，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含水平低于对照植物的烟碱水平的1％，2％，5％，8％，10％，12％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％或80％的烟碱，其中除了赋予低烟碱的突变或转基因之外，所述对照植物与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。另一方面，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含水平低于对照植物的烟碱或总生物碱水平的1％，2％，5％，8％，10％，12％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％或80％的烟碱或总生物碱。另一方面，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含的总生物碱水平选自对照植物的烟碱水平的小于3％，小于2.75％，小于2.5％，小于2.25％，小于2.0％，小于1.75％，小于1.5％，小于1.25％，小于1％，小于0.9％，小于0.8％，小于0.7％，小于0.6％，小于0.5％，小于0.4％，小于0.3％，小于0.2％，小于0.1％和小于0.05％，其中除了赋予低烟碱的突变或转基因之外，所述对照植物与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。另一方面，当在相似的生长条件下生长时，烟草植物包含的烟碱或总生物碱水平选自对照植物的烟碱或总生物碱水平的小于3％，小于2.75％，小于2.5％，小于2.25％，小于2.0％，小于1.75％，小于1.5％，小于1.25％，小于1％，小于0.9％，小于0.8％，小于0.7％，小于0.6％，小于0.5％，小于0.4％，小于0.3％，小于0.2％，小于0.1％和小于0.05％。
57.一方面，包含在一种或多种adc，ao或odc中或靶向一种或多种adc，ao或odc的遗传修饰的烟草植物还包含直接抑制一种或多种，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，六种或更多种，七种或更多种，八种或更多种，九种或更多种，十种或更多种，十一种或多种，十二种或更多种，十三种或更多种，十四种或更多种，十五种或更多种，十六种或更多种，十七种或更多种，十八种或更多种，十九种或更多种，二十种或更多种或全部二十一种基因或基因座的表达或活性的转基因或品种，所述基因或基因座编码选自下组的蛋白：胍丁胺脱亚胺酶(aic)，精氨酸酶，二胺氧化酶，甲基腐胺氧化酶(mpo)，nadh脱氢酶，邻氨基苯甲酸核糖异构酶(prai)，腐胺n-甲基转移酶(pmt)，精氨酸酶喹啉酸磷酸核糖转移酶(qpt)，s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)，a622，nbb1，小檗碱桥酶样(bbl)，myc2，nic1_erf，nic2_erf，乙烯应答因子(erf)转录因子，烟碱摄取通透酶(nup)和mate转运蛋白。参见dewey and xie,molecular genetics of alkaloid biosynthesis in nicotiana tabacum,phytochemistry 94(2013)10
–
27。
58.一方面，包含在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因的遗传修饰的烟草植物还包含nic2基因座的erf基因(nic2_erf)中的突变。一方面，包含在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因的遗传修饰的烟草植物还包含在一种或多种，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，六种或更多种，七种或更多种，八种或更多种，九种或更多种或全部十个基因中的一个或多个突变，所述基因选自下组：erf32，erf34，erf39，erf189，erf115，erf221，erf104，erf179，erf17和erf168。参见shoji et al.,plant cell,(10):3390-409(2010)；和kajikawa et al.,plant physiol.2017,174:999-1011。一方面，烟草植物还包含erf189，erf115或两者中的一个或多个突变。一方面，包含在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因的遗传修饰的烟草植物还包含一个或多个转基因，所述转基因靶向并抑制编码一种或多种，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，六种或更多种，七种或更多种，八种或更多种，九种或更多种或全部十种选自下组的蛋白质的基因：
erf32，erf34，erf39，erf189，erf115，erf221，erf104，erf179，erf17和erf168。
59.一方面，包含在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因的遗传修饰的烟草植物还包含nic1基因座的erf基因(nic1_erf)(或如wo/2019/140297中的nic1b基因座)中的突变。还参见wo/2018/237107。一方面，包含在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因的遗传修饰的烟草植物包含选自由以下组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或七种或更多种基因的一种或多种突变：erf101，erf110，erfnew，erf199，erf19，erf130，erf16，erf29，erf210和erf91l2。参见shoji et al.,plant cell,(10):3390-409(2010)；and kajikawa et al.,plant physiol.2017,174:999-1011。一方面，包含在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因的遗传修饰的烟草植物还包含选自由以下组成的组的一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或全部六种基因的一种或多种突变：erfnew，erf199，erf19，erf29，erf210和erf91l2。一方面，包含在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因的遗传修饰的烟草植物还包含一种或多种转基因，所述转基因靶向并抑制编码一种或多种，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，六种或更多种或七种或更多种选自下组的基因的基因：erf101，erf110，erfnew，erf199，erf19，erf130，erf16，erf29，erf210和erf91l2。
60.一方面，本文提供的烟草植物包含第一基因组修饰，其包含编码选自下组的蛋白质的基因或基因座中的突变：天冬氨酸氧化酶，胍丁胺脱亚胺酶(aic)，精氨酸酶，二胺氧化酶，精氨酸脱羧酶(adc)，甲基腐胺氧化酶(mpo)，nadh脱氢酶，鸟氨酸脱羧酶(odc)，磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(prai)，腐胺n-甲基转移酶(pmt)，喹啉酸磷酸核糖转移酶(qpt)和s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)，a622，nbb1，bbl，myc2，nic1_erf，nic2_erf，亚乙基响应因子(erf)转录因子，烟碱摄取通透酶(nup)和mate转运蛋白，并且还包含靶向一个或多个adc，ao或odc基因的第二遗传修饰。一方面，本文提供的烟草植物包含第一基因组修饰，所述第一基因组修饰包含靶向和抑制编码选自下组的蛋白质的基因或基因座的转基因：天冬氨酸氧化酶，胍丁胺脱亚胺酶(aic)，精氨酸酶，二胺氧化酶，精氨酸脱羧酶(adc)，甲基腐胺氧化酶(mpo)，nadh脱氢酶，鸟氨酸脱羧酶(odc)，磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(prai)，腐胺n-甲基转移酶(pmt)，喹啉酸磷酸核糖转移酶(qpt)和s-腺苷-甲硫氨酸合成酶(sams)，a622，nbb1，bbl，myc2，nic1，nic2，亚乙基响应因子(erf)转录因子，烟碱摄取通透酶(nup)和mate转运蛋白，并且还包含靶向一个或多个adc，ao或odc基因的第二遗传修饰。
61.叶质量/分级
62.一方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因的遗传修饰，具有商业上可接受的叶质量。本公开还提供具有改变的烟碱水平而对其他烟草性状(例如，叶等级指数值)没有负面影响的adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物。一方面，低烟碱adc，ao或odc突变体或转基因烟草品种提供商业上可接受等级的熟化烟草。
63.基于包括但不限于以下的因素评估烟草等级：叶柄位置、叶大小、叶颜色、叶均匀性和完整性、成熟度、质地、弹性、光泽(与叶的强度和着色深度以及光亮相关)、吸湿性(烟叶吸收并保持环境水分的能力)、绿色细微差别或落叶病(cast)。例如，可以使用美国农业
部农业营销服务部公布的官方标准等级(7u.s.c.
§
511)来确定叶等级。参见例如officialstandard grades for burley tobacco(u.s.type 31and forei gn type93),1990年11月5日生效(55f.r.40645)；official standard grades for flue-cured tobacco(u.s.types 11,12,13,14 and foreigntype 92),1989年3月27日生效(54f.r.7925)；official standard grades for pennsylvaniseedleaf tobacco(u.s.type 41),1965年1月8日生效(29f.r.16854)；official standard grades for ohio cigar-leaf tobacco(u.s.types 42,43,and 44),1963年12月8日生效(28f.r.11719 and 28 f.r.11926)；official standard grades for wisconsin cigar-binder tobacco(u.s.types 54and55),1969年11月20日生效(34f.r.17061)；official standard grades for wisconsincigar-binder tobacco(u.s.types 54 and 55),1969年11月20日生效(34f.r.17061)；official standard grades for georgiand floridshade-grown cigar-wrappertobacco(u.s.type 62),1971年4月生效。usda等级指数值可根据行业认可的等级指数确定。参见例如bowman等,tobacco science,32:39-40(1988)；legacy tobacco documentlibrary(bates document#523267826-523267833,1988年7月1日,memorandum on theproposed burley tobacco grade index)；和miller等,1990,tobacco intern.,192:55-57(所有前述参考文献的全文通过引用并入本文)。或者，可以通过高光谱成像确定叶的等级。参见例如wo 2011/027315(2011年3月10日公开，其全文通过引用并入本文)。
64.一方面，本文所述的adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物在熟化时能够产生usda等级指数值为选自由以下组成的组的叶：55或更大，60或更大，65或更大，70或更大，75或更大，80或更大，85或更大，90或更大和95或更大。另一方面，烟草植物在熟化时能够产生具有与在相似条件下生长并熟化的对照植物可比的usda等级指数值的叶，其中除了赋予低烟碱的靶向adc，ao或odc的突变或转基因之外，所述对照植物与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。另一方面，烟草植物在熟化时能够产生具有当在相似条件下生长时对照植物的usda等级指数值的至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约98％的usda等级指数值的叶，其中除了赋予低烟碱的突变或转基因之外，所述对照植物与所述烟草植物具有基本相同的遗传背景。另一方面，烟草植物在熟化时能够产生具有对照植物的usda等级指数值的65％至130％，70％至130％，75％至130％，80％至130％，85％至130％，90％至130％，95％至130％，100％至130％，105％至130％，110％至130％，115％至130％，或120％至130％的usda等级指数值的叶。另一方面，烟草植物在熟化时能够产生具有对照植物的usda等级指数值的70％至125％，75％至120％，80％至115％，85％至110％或90％至100％的usda等级指数值的叶。
65.另一方面，本文所述的adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物在熟化时能够产生usda等级指数值为选自由以下组成的组的叶：55或更大，60或更大，65或更大，70或更大，75或更大，80或更大，85或更大，90或更大和95或更大。另一方面，烟草植物在熟化时能够产生usda等级指数值选自下组的叶：50-95，55-95，60-95，65-95，70-95，75-95，80-95，85-95，90-95，55-90，60-85，65-80，70-75，50-55，55-60，60-65，65-70，70-75，75-80，80-85，85-90和90-95。另一方面，烟草植物在熟化时能够产生usda等级指数值为对照植物的usda等级指数值的至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约98％的叶。另一方面，烟草植物在熟化时能够产生usda等级指数值为对照
植物的usda等级指数值的65％至130％，70％至130％，75％至130％，80％至130％，85％至130％，90％至130％，95％至130％，100％至130％，105％至130％，110％至130％，115％至130％，或120％至130％的叶。另一方面，烟草植物在熟化时能够产生usda等级指数值为对照植物的usda等级指数值的70％至125％，75％至120％，80％至115％，85％至110％或90％至100％的叶。
66.一方面，本公开进一步提供adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物或其部分，其包含选自由以下组成的组的烟碱或总生物碱水平：小于3％，小于2.75％，小于2.5％，小于2.25％，小于2.0％，小于1.75％，小于1.5％，小于1.25％，小于1％，小于0.9％，小于0.8％，小于0.7％，小于0.6％，小于0.5％，小于0.4％，小于0.3％，小于0.2％，小于0.1％和小于0.05％，其中所述烟草植物在熟化时能够产生usda等级指数值为50或更大，55或更大，60或更大，65或更大，70或更大，75或更大，80或更大，85或更大，90或更大，和95或更大的叶。另一方面，该adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物包含小于2.0％的烟碱水平并且能够产生在熟化时具有70或更高的usda等级指数值的叶。在进一步的方面，该adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物包含小于1.0％的烟碱水平并且能够产生在熟化时具有70或更高的usda等级指数值的叶。
67.一方面，本公开还提供adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物或其部分，其包含adc，ao或odc突变或转基因，其中当在相似的生长条件下生长时，adc，ao或odc突变或转基因将烟草植物的烟碱或总生物碱水平降低至对照植物的烟碱水平的1％以下，2％以下，5％以下，8％以下，10％以下，12％以下，15％以下，20％以下，25％以下，30％以下，40％以下，50％以下，60％以下，70％以下或80％以下，其中烟草植物在熟化时能够产生usda等级指数值与对照植物的usda等级指数值可比可比的叶，并且其中除了adc，ao或odc突变或转基因之外，对照植物与烟草植物具有基本相同的遗传背景。
68.la叶表型
69.la burley 21(也称为la bu21)是通过将来自古巴雪茄品种的一个或多个低生物碱基因借助于若干次回交结合到burley 21中的低总生物碱烟草品系。与其亲本burley 21的约3.5％(干重)相比，burley 21的总生物碱(干重)为大约0.2％。labu21的叶等级远低于商业上可接受的标准。la bu21还表现出其它不利的叶表型，其特征是产量较低、成熟和衰老延迟、对昆虫食草性的敏感性较高，以及熟化后的最终产品质量差。la bu21叶进一步表现出如多胺含量高、叶绿素含量高、单位叶面积叶肉细胞多等性状。关于la bu21叶表型的更多表征，参见us2019/0271000。
70.一方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含赋予低烟碱或低生物碱的突变或转基因(例如，在一种或多种adc，ao或odc中或靶向一种或多种adc，ao或odc的遗传修饰)，并且相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶，能够产生包含可比水平的一种或多种多胺的叶。一方面，一种或多种多胺的可比水平在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中的水平的20％，17.5％，15％，12.5％，10％，7.5％，5％，2.5％或1％内。一方面，一种或多种多胺的可比水平为不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中水平的0.5％至1％，1％至2％，2％至3％，3％至4％，4％至5％，5％至6％，7％至8％，8％至9％，9％至10％，11％至12％，12％至13％，13％至14％，15％至16％，15％至17％，17％至18％，18％至19％，或19％至20％。另一方面，一种或多种多胺的可比水平为不包含相同突变或转
基因的对照植物的可比叶中水平的0.5％至5％，5％至10％或10％至20％。
71.一方面，本公开提供adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物或其部分，其能够产生相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶包含可比叶绿素水平的叶。一方面，可比叶绿素水平在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中的水平的20％，17.5％，15％，12.5％，10％，7.5％，5％，2.5％或1％内。一方面，可比叶绿素水平为不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中水平的0.5％至1％，1％至2％，2％至3％，3％至4％，4％至5％，5％至6％，7％至8％，8％至9％，9％至10％，11％至12％，12％至13％，13％至14％，15％至16％，16％至17％，17％至18％，18％至19％或19％至20％。另一方面，可比叶绿素水平为不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中水平的0.5％至5％，5％至10％或10％至20％。
72.一方面，本公开提供adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物或其部分，其能够产生相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶，每单位叶面积包含可比数量的叶肉细胞的叶。一方面，每单位叶面积的可比叶肉细胞数量在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中的水平的20％，17.5％，15％，12.5％，10％，7.5％，5％，2.5％或1％内。一方面，每单位叶面积的叶肉细胞的可比数量为不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中的水平的0.5％至1％，1％至2％，2％至3％，3％至4％，4％至5％，5％至6％，7％至8％，8％至9％，9％至10％，11％至12％，12％至13％，13％至14％，15％至16％，16％至17％，17％至18％，18％至19％或19％至20％。另一方面，每单位叶面积的可比数量的叶肉细胞为不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中水平的0.5％至5％，5％至10％，或10％至20％。
73.一方面，本公开提供adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物或其部分，其能够产生相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶包含可比表皮细胞大小的叶。一方面，可比的表皮细胞大小在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中的水平的20％，17.5％，15％，12.5％，10％，7.5％，5％，2.5％或1％内。一方面，可比的表皮细胞大小为不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中水平的0.5％至1％，1％至2％，2％至3％，3％至4％，4％至5％，5％至6％，7％至8％，8％至9％，9％至10％，11％至12％，12％至13％，13％至14％，15％至16％，16％至17％，17％至18％，18％至19％，或19％至20％。另一方面，可比的表皮细胞大小是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中水平的0.5％至5％，5％至10％，或10％至20％。
74.一方面，本公开提供adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物或其部分，其能够产生相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶包含可比叶产量的叶。一方面，可比叶产量在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中的水平的20％，17.5％，15％，12.5％，10％，7.5％，5％，2.5％或1％内。一方面，可比叶产量为不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中水平的0.5％至1％，1％至2％，2％至3％，3％至4％，4％至5％，5％至6％，7％至8％，8％至9％，9％至10％，11％至12％，12％至13％，13％至14％，15％至16％，16％至17％，17％至18％，18％至19％或19％至20％。另一方面，可比叶产量是不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中水平的0.5％至5％，5％至10％或10％至20％。
75.一方面，本公开提供了adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物或其部分，其相对于不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶表现出可比的昆虫吸食易感性。一方面，可
比的昆虫食草易感性在不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中的水平的20％，17.5％，15％，12.5％，10％，7.5％，5％，2.5％或1％内。一方面，可比的昆虫食草易感性为不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中的水平的0.5％至1％，1％至2％，2％至3％，3％至4％，4％至5％，5％至6％，7％至8％，8％至9％，9％至10％，11％至12％，12％至13％，13％至14％，15％至16％，15％至17％，17％至18％，18％至19％，或19％至20％。另一方面，可比的昆虫食草敏感性为不包含相同突变或转基因的对照植物的可比叶中的水平的0.5％至5％，5％至10％或10％至20％。
76.昆虫食草敏感性水平可以通过本领域已知的方法测定，例如在昆虫摄食测定中。简而言之，将1/4英寸的0.7％琼脂水溶液层加入到100mmpetri培养皿中并使其固化。从petri培养皿盖上切下叶圆片，置于平板中并轻轻推入琼脂中。叶圆片取自4-5叶期的植物。从叶片取出圆片只是为了排除主要的中脉。。从植物的四片最大叶中的每片取单个圆片，每个植物产生4个复制品。对四株植物取样，共16个生物复制品测试线。将第二龄期的单芽夜蛾(例如实夜蛾属(heliothissp.)，夜蛾属(helicoverpasp.))加入到叶中并使其在环境温度下进食48小时。48小时后，称重芽虫幼虫并记录最终幼虫重量。
77.一方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包含：第一基因组修饰，其提供较低水平的烟碱或总生物碱(例如，在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因)；和第二基因组修饰，其提供可比水平的一种或多种性状，所述性状选自由以下组成的组：总叶多胺水平，总根多胺水平，总叶叶绿素水平，每叶面积单位的叶肉细胞数量和叶表皮细胞大小；并且其中所述对照植物不具有所述第一和第二基因组修饰。一方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包含：第一基因组修饰，其提供较低水平的烟碱或总生物碱(例如，在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因)；和第二基因组修饰，其提供可比水平的总叶多胺水平，其中对照植物不具有所述第一和第二基因组修饰。一方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包含：第一基因组修饰，其提供较低水平的烟碱或总生物碱(例如，在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因)；和第二基因组修饰，其提供可比水平的总根多胺水平，其中对照植物不具有所述第一和第二基因组修饰。一方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包含：第一基因组修饰，其提供较低水平的烟碱或总生物碱(例如，在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因)；和第二基因组修饰，其提供可比水平的总叶叶绿素水平，其中对照植物不具有所述第一和第二基因组修饰。一方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包含：第一基因组修饰，其提供较低水平的烟碱或总生物碱(例如，在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因)；和第二基因组修饰，其提供可比水平的每叶面积单位的叶肉细胞数量，其中对照植物不具有所述第一和第二基因组修饰。一方面，烟草植物或其部分相对于对照烟草植物包含：第一基因组修饰，其提供较低水平的烟碱或总生物碱(例如，在一个或多个adc，ao或odc基因中或靶向一个或多个adc，ao或odc基因)；和第二基因组修饰，其提供可比水平的叶表皮细胞大小，其中对照植物不具有所述第一和第二基因组修饰。一方面，第二基因组修饰位于或靶向adc，ao或odc基因。
78.一方面，第一基因组修饰，第二基因组修饰或两者都包含转基因，突变或两者。一方面，基因组修饰，第二基因组修饰或两者都包含转基因。一方面，第一基因组修饰，第二基因组修饰或两者都包含突变。一方面，第一基因组修饰，第二基因组修饰或两者都不是基于
转基因的。一方面，第一基因组修饰，第二基因组修饰或两者都不是基于突变的。
79.一方面，本文提供的烟草植物相对于对照烟草植物在叶中包含减少量的总缀合多胺。一方面，本文提供的烟草植物相对于对照烟草植物在根中包含减少量的总缀合多胺。本文所用的缀合多胺包括但不限于可溶性缀合多胺，例如包含由与一种或多种苯丙素类(例如阿魏酸，咖啡酸和咖啡酰酒石酸)缀合的游离多胺(例如腐胺，精胺和/或亚精胺)组成的主链的苯酰胺。缀合多胺还包括但不限于掺入结构聚合物(如木质素)中的不溶性缀合多胺。一方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在叶中包含减少量的总游离多胺(例如腐胺，精胺和亚精胺)。一方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在根中包含减少量的总缀合多胺。一方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在叶中包含减少量的一种或多种多胺的总缀合形式，所述多胺选自下组：腐胺，亚精胺和精胺。一方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在根中包含减少量的一种或多种多胺的总缀合形式，所述多胺选自下组：腐胺，亚精胺和精胺。一方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在叶中包含减少量的一种或多种多胺的总游离形式，所述多胺选自下组：腐胺，亚精胺和精胺。一方面，相对于对照烟草植物，本文提供的烟草植物在根中包含减少量的一种或多种多胺的总缀合形式，所述多胺选自下组：腐胺，亚精胺和精胺。
80.一方面，本文所述烟草植物的特征或性状在选自下组的时间测量：开花前即刻，打顶时，打顶后1周(wpt)，2wpt，3wpt，4wpt，5wpt，6wpt，7wpt，8wpt和收获时。一方面，本文提供的包含第一和第二基因组修饰的烟草植物能够产生具有与来自对照植物的叶可比的叶等级的叶。一方面，本文提供的包含第一和第二基因组修饰的烟草植物具有与对照植物可比的总叶产量。
81.化学测定
[0082]“生物碱”是天然存在于植物中的复杂的含氮化合物，并且对人和动物有药理作用。“烟碱”是商业化卷烟中的主要天然生物碱并且约占普通烟草中生物碱含量的约90％。烟草中的其它主要生物碱包含可替宁、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、假木贼碱和新烟草碱。次要的烟草生物碱包含烟碱-n-氧化物、n-甲基新烟草碱、n-甲基假木贼碱、假氧化烟碱、2,3-二吡啶基和其它。
[0083]
一方面，本文提供的adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物包含遗传修饰，当在相似的生长条件下生长时，与未经遗传修饰的对照烟草植物相比，所述遗传修饰提供较低水平的选自由以下组成的组的一种或多种生物碱：可替宁，降烟碱，麦斯明，烟碱，假木贼碱和新烟草碱的生物碱。一方面，较低的生物碱或烟碱水平是指生物碱或烟碱水平比对照烟草植物的生物碱或烟碱水平低1％，低于2％，低于5％，低于8％，低于10％，低于12％，低于15％，低于20％，低于25％，低于30％，低于40％，低于50％，低于60％，低于70％或低于80％。另一方面，较低的生物碱或烟碱水平是指生物碱或烟碱水平为对照烟草植物的生物碱或烟碱水平的约0.5％至1％，1％至2％，2％至3％，3％至4％，4％至5％，5％至6％，7％至8％，8％至9％，9％至10％，11％至12％，12％至13％，13％至14％，14％至15％，15％至17％，18％至19％，19％至20％，21％至22％，22％至23％，23％至24％，24％至25％，25％至26％，27％至28％，28％至29％或29％至30％。另一方面，较低的生物碱或烟碱水平是指生物碱或烟碱水平为对照烟草植物的生物碱或烟碱水平的约0.5％至5％，5％至10％，10％至20％，20％至30％。
[0084]
一方面，本文提供的adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物包含基于干重选自下组的平均烟碱或总生物碱水平：约0.01％，0.02％，0.05％，0.75％，0.1％，0.15％，0.2％，0.3％，0.35％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1％，1.1％，1.2％，1.3％，1.4％，1.5％，1.6％，1.7％，1.8％，1.9％，2％，2.1％，2.2％，2.3％，2.4％，2.5％，2.6％，2.7％，2.8％，2.9％，3％，3.1％，3.2％，3.3％，3.4％，3.5％，3.6％，3.7％，3.8％，3.9％，4％，5％，6％，7％，8％和9％。另一方面，本文提供的烟草植物包含基于干重选自下组的平均烟碱或总生物碱水平：约0.01％到0.02％之间、0.02％到0.05％之间、0.05％到0.75％之间、0.75％到0.1％之间、0.1％到0.15％之间、0.15％到0.2％之间、0.2％到0.3％之间、0.3％到0.35％之间、0.35％到0.4％之间、0.4％到0.5％之间、0.5％到0.6％之间、0.6％到0.7％之间、0.7％到0.8％之间、0.8％到0.9％之间、0.9％到1％之间、1％到1.1％之间、1.1％到1.2％之间、1.2％到1.3％之间、1.3％到1.4％之间、1.4％到1.5％之间、1.5％到1.6％之间、1.6％到1.7％之间、1.7％到1.8％之间、1.8％到1.9％之间、1.9％到2％之间、2％到2.1％之间、2.1％到2.2％之间、2.2％到2.3％之间、2.3％到2.4％之间、2.4％到2.5％之间、2.5％到2.6％之间、2.6％到2.7％之间、2.7％到2.8％之间、2.8％到2.9％之间、2.9％到3％之间、3％到3.1％之间、3.1％到3.2％之间、3.2％到3.3％之间、3.3％到3.4％之间、3.4％到3.5％之间和3.5％到3.6％之间。另一方面，本文提供的烟草植物包含基于干重选自下组的平均烟碱或总生物碱水平：约0.01％到0.1％之间、0.02％到0.2％之间、0.03％到0.3％之间、0.04％到0.4％之间、0.05％到0.5％之间、0.75％到1％之间、0.1％到1.5％之间、0.15％到2％之间、0.2％到3％之间和0.3％到3.5％之间。
[0085]
除非另有说明，否则本文提到的烟草植物、品种、栽培品种或品系的生物碱、多胺或烟碱水平(或另一种烟叶化学物或特性表征)或叶等级指数值的测量值是指平均测量值，包含例如单个代表性植物的多叶的平均值或来自单个品种、栽培品种或品系的烟草植物的代表性群体的平均测量值。除非另有说明，否则此处所述的烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在打顶后两周在从打顶后的叶号3、4和5采集到的混合烟叶样品中测量的。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在对烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)最高的烟叶打顶后测量的。一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平是打顶后在叶号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中测量的。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在打顶后在具有选自由以下叶号组成的组的连续叶号的两个或更多个烟叶的池中测量的：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在打顶后在具有选自由以下组成的组的叶号的叶中测量的：介于1与5之间、6与10之间、11与15之间、16与20之间、21与25之间以及26与30之间。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在打顶后在具有选自由以下组成的组的叶号的两个或更多个烟叶的池中测量的：介于1与5之间、6与10之间、11与15之间、16与20之间、21与25之间以及26与30之间。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)是在打顶后在具有选自由以下叶号组成的组的叶号的三个或更多个烟叶的池中测量的：介于1与5之间、6与10之间、11与15之间、16与20之间、21与25之
间以及26与30之间。
[0086]
生物碱水平可以通过本领域已知的方法检测，例如通过基于气液色谱、高效液相色谱、放射免疫分析和酶联免疫吸附分析的定量检测。例如，烟碱生物碱水平可以通过基于coresta推荐方法7号，1987和iso标准(iso tc 126n 394e)的gc-fid方法进行测量。还参见hibi等人,《植物生理学(plant physiology)》100:826-35(1992)使用配备有毛细管柱和fid检测器的气液色谱的方法。除非另有说明，否则此处描述的所有生物碱水平都使用根据2005年2月coresta方法第62号通过气相色谱分析测定烟草和烟草制品中的烟碱以及疾病控制和预防中心的无烟烟草制品中的烟碱、总水分和ph分析方案中定义的方法进行测量，如《联邦公报》1999年3月23日第64卷第55期(并且如2009年1月7日第74卷第4期修订)中发布。
[0087]
可替代地，烟草总生物碱可以使用分段流动比色法进行测量，所述方法开发用于分析如由skalar instrument co(宾夕法尼亚州西切斯特)改编并且由collins等人描述，《烟草科学(tobacco science)》13:79-81(1969)的烟草样品。简言之，在分析总生物碱和还原糖之前，对烟草样品进行干燥、研磨和提取。所述方法然后采用乙酸/甲醇/水萃取和木炭以进行脱色。总生物碱的测定基于氯化氰与烟碱生物碱在存在芳香胺的情况下反应以形成在460nm下测量的有色络合物。除非另有说明，否则本文所示的总生物碱水平或烟碱水平是以干重为基础的(例如，总生物碱百分比或烟碱百分比)。
[0088]
如本文所用，烟叶编号基于烟草茎上的烟叶位置，其中叶号1是打顶后最新鲜的烟叶(在顶部)，并且最高的叶号分配给最老的烟叶(在底部)。
[0089]
用于测定平均测量值(例如，生物碱或烟碱水平或叶等级)的烟草植物群体或烟叶集合可以是任何大小，例如，5、10、15、20、25、30、35、40或50。遵循行业公认的标准协议来测定平均测量值或等级指数值。
[0090]
如本文所用，“打顶”是指当烟草植物接近营养成熟时和生殖生长要开始时，除去茎尖，包含sam、花和多大几片相邻叶。通常，烟草植物在纽扣阶段(在花开始出现后不久)打顶。例如，当50％的温室或田间生长的烟草植物出现至少有一朵开放的花时，可以对所述植物打顶。对烟草植物打顶会导致顶端优势的丧失，并且还会诱导生物碱产生的增加。
[0091]
通常，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)在打顶后约2周测量。也可以使用其它时间点。一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)在打顶后约1、2、3、4或5周测量。另一方面，烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一种烟叶化学物或特性特征)在打顶后约3、5、7、10、12、14、17、19或21天测量。
[0092]
如本文所用，“相似的生长条件”是指用于生长并且在两种或更多种基因型之间进行有意义的比较使得环境条件或农艺措施均不会造成或解释在所述两种或更多种基因型之间观察到的任何差异的类似环境条件和/或农艺措施。环境条件包含例如光、温度、水(湿度)和营养(例如，氮和磷)。农艺措施包含例如，播种、修剪、挖底、移植、打顶和吸干。参见《烟草生产、化学和技术(tobacco,production,chemistry and technology)》,davis&nielsen,编辑,牛津布莱克韦尔出版社(1999),第70-103页的4b和4c章节。
[0093]
如本文所用，“可比叶”是指具有相似大小，形状，年龄和/或茎位置的叶。
[0094]
香味/风味
[0095]
一方面，与在相似的生长条件下生长时的对照烟草植物相比，本文提供的adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物包含类似水平的一种或多种烟草香气化合物，所述一种或多种烟草香气化合物选自由以下组成的组：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、二萜、西松烷内酯、糖酯和还原糖。
[0096]
如本文所用，烟草香气化合物是与烟草烟雾的风味和香气相关联的化合物。这些化合物包括但不限于3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、西松烷内酯和二萜和糖酯。烟草香气化合物的浓度可以通过本领域中任何已知的代谢物分析方法来测量，包括但不限于气相色谱质谱法(gc-ms)、核磁共振波谱法、液相色谱联用质谱法。参见weckwerth和kahl编辑的《植物代谢组学手册》(wiley-blackwell)(2013年5月28日)。
[0097]
如本文所用，“还原糖”是具有游离或潜在游离的醛基或酮基的任何糖(单糖或多糖)。葡萄糖和果糖通过降低烟雾的ph值并有效降低“游离的”未质子化烟碱的量，在香烟烟雾中充当烟碱缓冲剂。降低糖可以平衡烟雾风味，例如，通过改变烟碱和其他烟草生物碱的感官影响。据报道，对于各种烟草品种，由于种植条件的不同，同一品种内以及同一株系内的糖含量与生物碱含量之间存在反比关系。降低的糖水平可以使用由skalar instrument co(宾夕法尼亚州西切斯特)改编并由davis,《烟草科学》20:139-144(1976)描述的，用于分析烟草样品而开发的分段流比色法来测量。例如，将样品在碳酸钠溶液中透析。将铜新亚铜试剂添加到样品中并将溶液加热。在糖存在的情况下，铜新亚铜试剂螯合物被还原，导致形成在460nm处被测量到的有色络合物。
[0098]
tsna
[0099]
另一方面，所提供的烟草植物还包含在编码烟碱脱甲基酶(例如cyp82e4、cyp82e5、cyp82e10)的一个或多个基因座中的一个或多个突变，与在编码烟碱脱甲基酶的一个或多个基因座中缺少一个或多个突变的对照植物相比，其赋予减少的降烟碱量(参见美国专利号8,319,011；8,124,851；9,187,759；9,228,194；9,228,195；9,247,706)。一方面，当在类似的条件下生长并熟化时，与对照植物相比，所描述的经修饰的烟草植物还包含降低的烟碱脱甲基酶活性。另一方面，提供的烟草植物还包含一种或多种突变或转基因，其提供升高水平的一种或多种抗氧化剂(参见美国专利号2018/0119163和wo2018/067985)。另一方面，提供的烟草植物进一步包含一种或多种突变或转基因，其提供降低水平的一种或多种烟草特异性亚硝胺(tsna)(例如n
′‑
亚硝基降烟碱(nnn)，4-甲基亚硝基氨基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk)，n
′‑
亚硝基新烟草碱(nat)n
′‑
亚硝基假木贼碱(nab))。
[0100]
突变类型
[0101]
一方面，本公开提供烟草植物或其部分，其在adc，ao或odc基因中包含非天然突变(例如，如在“adc突变体”，“ao突变体”或“odc突变体”中)。一方面，非天然突变包含选自下组的一种或多种突变类型：无义突变，错义突变，移码突变，剪接位点突变及其任何组合。如本文所用，“无义突变”是指通过核酸序列将过早终止密码子引入氨基酸序列的核酸序列突变。如本文所用，“错义突变”是指核酸序列的突变，其导致由核酸序列编码的氨基酸序列内的取代。如本文所用，“移码突变”是指对核酸序列的插入或缺失，其移码以将核酸序列翻译成氨基酸序列。。“剪接位点突变”是指核酸序列中的突变，其导致内含子被保留用于蛋白质翻译，或可选地，导致外显子从蛋白质翻译中被排除。剪接位点突变可引起无义，错义或移码突变。
[0102]
当突变的信使rna(mrna)被翻译成蛋白质或多肽时，基因编码区中的突变(例如外显子突变)可产生截短的蛋白质或多肽。一方面，本公开提供了导致蛋白质或多肽截短的突变。如本文所用，与内源对照蛋白质或多肽相比，“截短的”蛋白质或多肽包含至少少一个氨基酸。例如，如果内源蛋白a包含100个氨基酸，蛋白a的截短形式可包含1-99个氨基酸。
[0103]
不受任何科学理论的限制，引起蛋白质或多肽截短的一种方式是通过在内源基因的mrna转录物中引入过早终止密码子。一方面，本公开提供了导致内源基因的mrna转录物中过早终止密码子的突变。如本文所用，“终止密码子”是指mrna转录本中发出蛋白质翻译终止信号的核苷酸三联体。“过早终止密码子”是指在内源mrna转录物中比正常终止密码子位置更早(例如，在5'端)定位的终止密码子。不受限制地，本领域已知几种终止密码子，包括“uag”，“uaa”，“uga”，“tag”，“taa”和“tga”。
[0104]
一方面，本文提供的突变包含无效突变。如本文所用，“无效突变”是指赋予由包含突变的基因编码的蛋白质完全丧失功能的突变，或者赋予由基因组基因座编码的小rna完全丧失功能的突变。无效突变可导致mrna转录产物的缺乏，小rna转录产物的缺乏，蛋白质功能的缺乏或其组合。
[0105]
本文提供的突变可以位于内源基因的任何部分。一方面，本文提供的突变位于内源基因的外显子内。另一方面，本文提供的突变位于内源基因的内含子内。另一方面，本文提供的突变位于内源基因的5'-非翻译区(utr)内。又另一方面，本文提供的突变位于内源基因的3'-utr内。另一方面，本文提供的突变位于内源基因的启动子内。另一方面，本文提供的突变位于内源基因的终止子内。
[0106]
一方面，与缺乏突变的内源基因相比，内源基因中的突变导致表达水平降低。另一方面，与缺乏突变的内源基因相比，内源基因中的突变导致表达水平增加。
[0107]
一方面，与对照烟草植物中基因的表达相比，非天然突变导致表达水平降低。一方面，与对照烟草植物中基因的表达相比，非天然突变导致表达水平增加。
[0108]
另一方面，与由缺乏突变的内源基因编码的蛋白质或多肽相比，内源基因中的突变导致由具有突变的内源基因编码的蛋白质或多肽活性水平降低。另一方面，与由缺乏突变的内源基因编码的蛋白质或多肽相比，内源基因中的突变导致由具有突变的内源基因编码的蛋白质或多肽的活性水平增加。
[0109]
一方面，与由缺乏非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽相比，非天然突变导致由包含非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽的活性水平降低。另一方面，与缺乏非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽相比，非天然突变导致由包含非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽的活性水平增加。
[0110]
一方面，本文提供的突变提供了激活目的基因(例如一种或多种adc，ao或odc基因)的表达或提高其活性的显性突变体。
[0111]
本领域常规研究基因表达水平。作为非限制性实例，可以使用定量逆转录酶pcr(qrt-pcr)，rna测序或northern印迹测量基因表达。一方面，使用qrt-pcr测量基因表达。另一方面，使用northern印迹测定基因表达。另一方面，使用rna测序测量基因表达。
[0112]
adc，ao或odc突变体烟草植物可以通过本领域已知的任何方法制备，包括随机或靶向诱变方法。这种诱变方法包括但不限于用甲基硫酸乙酯(ems)处理种子(hildering and verkerk,in,the use of induced mutations in plant breeding.pergamon press,
pp 317-320,1965)或uv-诱变，x-射线和快中子诱变(参见，例如，verkerk,neth.j.agric.sci.19:197-203,1971；和poehlman,breeding field crops,van nostrand reinhold,new york(3.sup.rd ed),1987)，转座子标记(fedoroff et al.,1984；u.s.pat.no.4,732,856 and u.s.pat.no.5,013,658)，以及t-dna插入方法(hoekema et al.,1983；u.s.pat.no.5,149,645)。ems诱导的诱变由化学诱导基因组长度上的随机点突变组成。快中子诱变包括将种子暴露于中子轰击，其通过双链dna断裂导致大的缺失。转座子标记包括在内源基因内插入转座子以减少或消除基因的表达。烟草基因中可能存在的突变类型包括例如点突变，缺失，插入，复制和倒位。该突变理想地存在于烟草基因的编码区中；但是，烟草基因的启动子区和内含子或非翻译区中的突变也可能是期望的。
[0113]
此外，使用变性的hplc或选择的pcr产物的选择性核酸内切酶消化来筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法tilling(靶向基因组中的诱导的局部病变)也适用于本公开。参见mccallum et al.(2000)nat.biotechnol.18:455-457。可以使用本领域众所周知的方法来确定影响基因表达或干扰基因功能的突变。基因外显子的插入突变通常会导致无效突变。保守性残基中的突变在抑制蛋白质功能方面可以是特别有效的。一方面，烟草植物包含在美国临时申请第62/616,959号和第62/625,878号中描述的一个或多个ncg基因中的无义(例如，终止密码子)突变，这两个申请以全文引用的方式并入本文中。
[0114]
在一个方面，本公开还提供了烟碱水平被改变同时保持了商业上可接受的烟叶质量的烟草品系。在一个方面，可以通过精确的基因组工程技术引入一个或多个adc、ao或odc基因突变来产生该品系，例如，转录激活子样效应子核酸酶(talens)、巨核酸酶、锌指核酸酶和规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)/cas9系统、crispr/cpf1系统、crispr/csm1系统及其组合(参见例如美国专利申请公布2017/0233756)。参见例如gaj et al.,trends in biotechnology,31(7):397-405(2013)。主要的编辑方法由anzalone等人描述，其使用与rna可编程切口酶(例如，修饰的cas9)融合的逆转录酶(描述于“search-and-replace genome editing without double-stranded breaks or donor dna,”nature,21 october 2019(doi[dot]org/10.1038/s41586-019-1711-4))，也可用于将突变引入一个或多个adc、ao或odc基因。。
[0115]
诱变烟草植物的筛选和选择可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行。筛选和选择方法的实例包括但不限于：southern分析、用于检测多核苷酸的pcr扩增、northern印迹、rnase保护、引物延伸、用于检测rna转录的rt-pcr扩增、sanger测序、下一代测序技术(例如，illumina、pacbio、ion torrent、454)、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶测定，以及蛋白质凝胶电泳、western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定，以检测多肽。其他技术，如原位杂交、酶染色和免疫染色也可以用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于执行所有引用技术的方法是已知的。
[0116]
一方面，本文提供的烟草植物或植物基因组通过选自由以下组成的组的核酸酶被突变或被编辑：巨核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应子核酸酶(talen)、crispr/cas9核酸酶、crispr/cpf1核酸酶或crispr/csm1核酸酶。
[0117]
如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指内源植物基因组核酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个核苷酸的靶向诱变，或者内源植物基因组核酸序列的去除或替换。一方面，所提供的经编辑的核酸
序列与内源核酸序列具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。另一方面，所提供的经编辑的核酸序列与seq id nos:1-36及其片段具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。
[0118]
巨核酸酶、zfn、talen、crispr/cas9、crispr/cas9、crispr/csm1和crispr/cpf1在基因组序列的靶向位点诱导双链dna断裂，然后通过同源重组(hr)或非同源末端连接(nhej)的天然过程修复。然后，在切割位点进行序列修饰，这可以包括在nhej的情况下的导致基因破坏的缺失或插入，或通过hr对供体核酸序列的整合。一方面，所提供的方法包括用所提供的核酸酶编辑植物基因组以用供体多核苷酸经由hr使植物基因组中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或超过10个核苷酸突变。一方面，所提供的突变是使用核酸酶通过基因组编辑引起的。另一方面，所提供的突变是通过非同源末端连接或同源重组引起的。
[0119]
通常在微生物中被鉴定的巨核酸酶是独特的酶，具有高活性和长识别序列(》14bp)，导致靶向dna的位点特异性消化。天然存在的巨核酸酶的工程设计版本通常具有扩展的dna识别序列(例如14到40bp)。巨核酸酶的工程设计可比zfn和talen更具挑战性，因为巨核酸酶的dna识别和切割功能交织在单个域中。诱变和高通量筛选的专门方法已用于创建识别独特序列并具有改进的核酸酶活性的新型巨核酸酶变体。
[0120]
zfn是由融合到foki限制性核酸内切酶切割域的工程化的锌指dna结合域组成的合成蛋白质。可以设计zfn来切割几乎任何长链的双链dna，以修饰锌指dna结合域。zfn从由融合到被工程化为与靶向dna序列结合的锌指阵列上的foki核酸内切酶的非特异性dna切割域组成的单体形成二聚体。
[0121]
zfn的dna结合域通常由3-4个锌指阵列组成。在相对于锌指∞-螺旋起点的有助于与靶向dna的位点特异性结合的位置-1、+2、+3和+6处的氨基酸可以被改变和定制以适配特定的靶向序列。其他氨基酸形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的zfn。选择zfn的靶向序列的规则是本领域已知的。
[0122]
foki核酸酶域需要二聚化以切割dna，因此需要两个带有c端区的zfn才能结合切割位点的相对dna链(相距5-7bp)。如果两个zf结合位点是回文的，则zfn单体可以切割靶向位点。如本文所用，术语zfn是宽泛的并且包括可以在没有另一zfn帮助的情况下切割双链dna的单体zfn。术语zfn也用于指被工程化为共同作用以在同一位点切割dna的一对zfn的一个或两个元件。
[0123]
不受任何科学理论的限制，因为原则上可以使用多种方法之一来重新工程化锌指域的dna结合特异性，所以理论上可以构建定制zfn以靶向几乎任何基因序列。公开可用的工程化锌指域的方法包括相邻装配法(coda)、寡聚体化序列设计策略(open)和模块化组装(modular assembly)。
[0124]
talen是通过将转录激活子样效应子(tale)dna结合域与foki核酸酶域融合而产生的人工限制性酶。当talen对的每个元件与靶向位点侧翼的dna位点结合时，foki单体二聚化并在靶向位点处引起双链dna断裂。如本文所用，术语talen是宽泛的并且包括单体
被定义为本领域已知或本文描述的降低目标基因产物(例如靶向基因产物)的表达或功能的任何方法。“抑制”可以在两种植物之间进行比较的背景下进行，例如，遗传改造的植物与野生型植物。或者，靶向基因产物的表达或功能的抑制可以在相同植物内或不同植物之间的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物部分之间进行比较的背景下进行，并且包括在同一植物或植物部分内的发育阶段或时间阶段之间的比较或者植物或植物部分之间的比较。“抑制”包括目标基因产物的功能或产生的任何相对降低，直至并包括完全消除该基因产物的功能或产生。术语“抑制”涵盖下调靶向基因产物的翻译和/或转录或靶向基因产物的功能活性的任何方法或组合物。一方面，经修饰的植物中一种或多种基因的mrna或蛋白质水平是在非突变体或未经遗传修饰以抑制所述基因表达的植物中相同基因的mrna或蛋白质水平的小于95％，小于90％，小于80％，小于70％，小于60％，小于50％，小于40％，小于30％，小于20％，小于10％，小于5％，小于4％，小于3％，小于2％或小于1％。
[0134]
术语“多核苷酸”的使用不旨在将本公开限制于包含dna的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。该脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本公开的多核苷酸还涵盖序列的所有形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。
[0135]
一方面，本公开提供重组dna构建体，其包含在烟草细胞中起作用并且可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码能够结合至编码多肽的rna的rna分子，所述多肽具有与选自由seq id nos:37-54以及其片段组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的氨基酸序列，并且其中，rna分子抑制多肽的表达。一方面，rna分子选自由microrna、sirna和反式sirna组成的组。另一方面，重组dna构建体编码双链rna。还提供了转基因烟草植物或其部分、熟化烟草材料或包含这些重组dna构建体的烟草制品。一方面，与没有重组dna构建体的对照烟草植物相比，这些转基因植物、熟化烟草材料或烟草制品包含较低水平的烟碱。还提供了降低烟草植物的烟碱水平的方法，该方法包括用这些重组dna构建体中的任一种转化烟草植物。
[0136]
如本文所用，“可操作地连接”是指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目标多核苷酸与调节序列(例如启动子)之间的可操作地连接是允许目标多核苷酸进行表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。
[0137]
如本文所用并且在参考序列使用时，“异源”是指源自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则通过有意的人为干预从其在组合物和/或基因组位点中的天然形式进行实质性修饰的序列。该术语也适用于核酸构建体，在本文中也被称为“多核苷酸构建体”或“核苷酸构建体”。以这种方式，“异源”核酸构建体意指源自外来物种的构建体，或者如果来自相同物种，则通过有意的人为干预从其在组合物和/或基因组位点中的天然形式进行实质性修饰的构建体。异源核酸构建体包括但不限于例如经由转化方法或随后将转基因植物与另一目标植物育种而引入植物或其植物部分中的重组核苷酸构建体。一方面，所使用的启动子与通过该启动子驱动的序列是异源的。另一方面，所使用的启动子与烟草是异源的。另一方面，所使用的启动子对烟草是天然的。
[0138]
一方面，描述的经修饰的烟草植物是顺基因植物。如本文所用，“同源转基因”或“顺基因”是指植物、植物细胞或植物基因组的遗传修饰，其中，所有组分(例如，启动子、供体核酸、选择基因)仅具有植物来源(即，没有使用非植物来源组分)。一方面，所提供的经修
饰的植物、植物细胞或植物基因组是顺基因的。所提供的顺基因植物、植物细胞和植物基因组可以产生即用型烟草品系。另一方面，所提供的经修饰的烟草植物不包含非烟草遗传材料或序列。
[0139]
如本文所用，“基因表达”是指基因产物的生物合成或产生，包括基因产物的转录和/或翻译。
[0140]
一方面，重组dna构建体或表达盒还可以包括用于选择转基因细胞的可选择的标记物基因。可选择的标记物基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶ii(neo)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)的基因，以及赋予除草化合物抗性的基因，如草铵膦、溴氧腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸酯(2,4-d)。其他可选择的标记物包括表型标记物，如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(gfp)。
[0141]
一方面，所提供的烟草植物还包括与烟碱生物合成或运输有关的基因的活性的增加或减少的表达。涉及烟碱生物合成的基因包括但不限于精氨酸脱羧酶(adc)、甲基腐胺氧化酶(mpo)、nadh脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(odc)、磷酸核糖基邻氨基苯甲酸酯异构酶(prai)、腐胺n-甲基转移酶(pmt)、喹啉酸磷酸核糖转移酶(qpt)和s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)。尽管已经提出了两种候选基因(a622和nbb1)，但尚未阐明可催化烟碱酸衍生物和甲基吡咯啉阳离子之间的缩合步骤的烟碱合成酶。参见us 2007/0240728 a1和us 2008/0120737a1。a622编码异黄酮还原酶样蛋白质。另外，几种转运蛋白可以参与烟碱的转运。已经克隆并表征了被称为mate的转运蛋白基因(morita et al.,pnas 106:2447-52(2009))。
[0142]
一方面，与对照烟草植物相比，所提供的烟草植物还包含一种或更多种基因的增加或降低水平的mrna、蛋白质或两者，所述基因编码选自由pmt、mpo、qpt、adc、odc、prai、sams、bbl、mate、a622和nbb1组成的组的产物。另一方面，所提供的烟草植物还包含直接抑制一种或更多种基因的表达的转基因，所述基因编码选自由pmt、mpo、qpt、adc、odc、prai、sams、bbl、mate、a622和nbb1组成的组的产物。另一方面，所提供的烟草植物还包含抑制一种或更多种基因的表达或活性的转基因或突变，所述基因编码选自由pmt、mpo、qpt、adc、odc、prai、sams、bbl、mate、a622和nbb1组成的组的产物。另一方面，所提供的烟草植物还包含过表达一种或更多种基因的转基因，所述基因编码选自由pmt、mpo、qpt、adc、odc、prai、sams、bbl、mate、a622和nbb1组成的组的产物。
[0143]
还公开了使用本领域已知的任何合适的转化方法描述的用重组构建体或表达盒转化烟草植物。将多核苷酸序列引入烟草植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导方法。“稳定转化”是指其中被引入植物的目标核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且能够被其后代遗传的转化。“瞬时转化”意指将序列引入植物中并且仅在植物中临时表达或仅瞬时存在。
[0144]
将多核苷酸引入本公开的植物细胞中的合适方法包括微量注射(crossway等人(1986)《生物技术》4:320-334)、电穿孔(shillito等人(1987)meth.enzymol.153:313-336；riggs等人(1986)proc.natl.acad.sci.美国83:5602-5606)、《农杆菌介导的转化》(美国专利no.5,104,310、5,149,645、5,177,010、5,231,019、5,463,174、5,464,763、5,469,976、4,762,785、5,004,863、5,159,135、5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(paszkowski等人(1984)embo j.3:2717-2722)和《弹道粒子加速》(参见，例如，美国专利no.4,945,050、5,141,131、5,886,244、5,879,918和5,932,782；tomes等人(1995)《植物细胞、组织和器官培
养基本方法》，编辑gamborg和phillips(施普林格出版公司，柏林)；mccabe等人(1988)《生物技术》6:923-926)。另参见weissinger等人(1988)ann.rev.genet.22:421-477；christou等人(1988)《植物生理学》87:671-674(大豆)；mccabe等人(1988)《生物/技术》6:923-926(大豆)；finer和mcmullen(1991)in vitro cell dev.biol.27p：175-182(大豆)；singh等人(1998)theor.appl.genet.96:319-324(大豆)；de wet等人(1985)《卵子组织的实验操纵》编辑chapman等人(朗曼出版社，纽约)，第197-209页(花粉)；kaeppler等人(1990)《植物细胞报告》9:415-418和kaeppler等人(1992)theor.appl.genet.84:560-566(晶须介导的转化)；d'halluin等人(1992)《植物细胞》4:1495-1505(电穿孔)。
[0145]
另一方面，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将重组构建体或表达盒引入植物中。通常，这样的方法涉及将本公开的表达盒掺入病毒dna或rna分子内。公认的是，用于表达盒的启动子也涵盖用于病毒rna聚合酶转录的启动子。用于将多核苷酸引入植物并表达其中编码的涉及病毒dna或rna分子的蛋白质的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利no.5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和porta等人(1996)《分子生物技术》5:209-221。
[0146]
可以随后使用克隆方法繁殖的任何植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生，都可以用重组构建体或表达盒进行转化。所谓“器官发生”意指从分生组织中心依次生长出芽和根的过程。“胚胎发生”意指从体细胞或配子以一致的方式(而不是依次地)一起生长芽和根的过程。适用于所描述的各种转化方案的示例性组织包括但不限于愈伤组织、现有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)、下胚轴、子叶、叶盘、花粉、胚胎等。
[0147]
启动子
[0148]
一方面，本公开提供烟草植物或其部分，其包含靶向一个或多个adc，ao或odc基因的转基因(例如，如在“adc转基因植物”，“ao转基因植物”或“odc转基因植物”中)。各种类型的启动子可用于本文所述的adc，ao或odc转基因或重组核酸中，其根据与可操作地连接至启动子的编码序列或基因(包括转基因)的表达模式相关的多种标准分类，例如组成型，发育型，组织特异型，组织优先型，诱导型等。在植物的所有或大部分组织中起始转录的启动子称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段启动转录的启动子称为“发育型”启动子。相对于其它植物组织，其表达在植物的某些组织中增强的启动子被称为“组织增强型”或“组织优先型”启动子。因此，“组织优先型”启动子在植物的特定组织中引起相对较高或优选的表达，但在植物的其它组织中具有较低水平的表达。在植物的特定组织中表达，在其它植物组织中很少表达或不表达的启动子称为“组织特异型”启动子。在植物的某一细胞类型中表达的启动子被称为“细胞型特异型”启动子。“诱导型”启动子是响应环境刺激(如冷，干旱，热或光)，或其它刺激(如创伤或化学应用)而启动转录的启动子。本文还使用了根据其来源分类的启动子，例如异源的，同源的，嵌合的，合成的等。“异源”启动子是相对于其相关的可转录序列，编码序列或基因(或转基因)具有不同来源的启动子序列，和/或非天然存在于待转化的植物物种中的启动子序列。术语“异源”更广泛地包括两个或多个dna分子或序列的组合，当这种组合在自然界中通常不存在时。例如，如果两个或多个dna分子或序列通常存在于不同基因组中或相同基因组中的不同位点，或者如果它们在自然界中不相同地组合，则它们彼此是异源的。
[0149]
一方面，本文描述的重组dna构建体或表达盒(或包含该构建体或盒的植物)包含选自由组成型启动子、诱导型启动子和组织优先型启动子(例如，叶特异型或根特异型启动子)组成的组的启动子。示例性组成型启动子包括美国专利no.6,072,050中公开的rsyn7启动子的核心启动子和其他组成型启动子；核心camv 35s启动子(odell等人(1985)《自然》313：810-812)；泛素(christensen等人(1989)plant mol.biol.12：619-632和christensen等人(1992)plant mol.biol.18：675-689)；pemu(last等人(1991)theor.appl.genet.81:581-588)；mas(velten等人(1984)embo j 3:2723-2730)；als启动子(美国专利no.5,659,026)等。示例性的化学诱导型启动子包括由水杨酸激活的烟草pr-1a启动子其他目标化学诱导型启动子包括类固醇响应性启动子(参见，例如，schena等人(1991)proc.natl.acad.sci.美国88:10421-10425和mcnellis等人(1991)植物j.14(2):247-257中的糖皮质激素诱导性启动子)和四环素诱导性启动子(参见，例如，gatz等人(1991)mol.gen.genet.227:229-237，和美国专利no.5,814,618和5,789,156)。可以使用的其他示例性启动子是负责以下的启动子：热调节基因表达、光调节基因表达的(例如，豌豆rbcs-3a；玉米rbcs启动子；豌豆中的叶绿素alb结合蛋白基因；或arabssu启动子)、激素调节基因表达(例如，小麦em基因的脱落酸(aba)响应序列；大麦和拟南芥的aba诱导的hva1和hva22以及rd29a启动子；和伤口诱导的基因表达(例如，wunl的表达)、器官特异性基因表达(例如，块茎特异性贮藏蛋白基因的表达；来自描述的玉米的23-kda玉米醇溶蛋白基因；或薯角豆(β-菜豆素基因)或病原体诱导性启动子(例如pr-1、prp-1或(β-1,3葡聚糖酶启动子、小麦的真菌诱导性wirla启动子和分别为烟草和欧芹的线虫诱导性启动子tobrb7-5a和hmg-1)。
[0150]
一方面，adc，ao或odc转基因包含诱导型启动子。一方面，诱导型启动子是打顶诱导型启动子。一方面，诱导型启动子也是组织特异型或组织优先型的启动子。一方面，组织特异型或组织优先型启动子对于选自由芽，根，叶，茎，花，烟杈，根尖，叶肉细胞，表皮细胞和脉管系统组成的组的一种或多种组织或器官是特异的或优选的。另一方面，打顶诱导型启动子包含来自烟草烟碱脱甲基酶基因的启动子序列，例如cyp82e4，cyp82e5或cyp82e10。一方面，诱导型启动子提供根特异或优先表达。示例性的根特异或优先诱导型启动子可以在美国专利申请号2019/0271000中找到。一方面，诱导型启动子提供叶特异或优先表达。示例性的叶特异或优先诱导型启动子可以在美国专利申请公开号2019/0271000中找到，其通过引用整体并入本文。
[0151]
一方面，诱导型启动子与可操作地连接的可转录dna序列是异源的。一方面，可转录的dna序列编码选自由微小rna(mirna)，反义rna，小干扰rna(sirna)，反作用sirna(ta-sirna)和发夹rna(hprna)组成的组的非编码rna。一方面，非编码rna包含与选自由seq id nos:1-36，55-64及其任何部分组成的组的序列具有100％，至少99.9％，至少99.5％，至少99％，至少98％，至少97％，至少96％，至少95％，至少94％，至少93％，至少92％，至少91％，至少90％，至少85％，至少80％或至少75％同一性或互补性的核苷酸序列。
[0152]
一方面，非编码rna包含至少18个，至少19个，至少20个，至少21个，至少22个，至少23个，至少24个，至少25个，至少26个，至少27个，至少28个，至少29个，至少30个，至少31个，至少32个，至少33个，至少34个或至少35个核苷酸。一方面，非编码rna序列包含与选自由seq id nos:1-36和55-64组成的组的序列的至少18个，至少19个，至少20个，至少21个，至
少22个，至少23个，至少24个，至少25个，至少26个，至少27个，至少28个，至少29个，至少30个，至少31个，至少32个，至少33个，至少34个或至少35个连续核苷酸的至少80％互补性。一方面，非编码rna序列包含与选自由seq id nos:1-36和55-64组成的组的序列的至少18个，至少19个，至少20个，至少21个，至少22个，至少23个，至少24个，至少25个，至少26个，至少27个，至少28个，至少29个，至少30个，至少31个，至少32个，至少33个，至少34个或至少35个连续核苷酸的至少90％互补性。一方面，非编码rna序列包含与选自由seq id nos:1-36和55-64组成的组的序列的至少18个，至少19个，至少20个，至少21个，至少22个，至少23个，至少24个，至少25个，至少26个，至少27个，至少28个，至少29个，至少30个，至少31个，至少32个，至少33个，至少34个或至少35个连续核苷酸的至少95％互补性。一方面，非编码rna序列包含与选自由seq id nos:1-36和55-64组成的组的序列的至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25，至少26，至少27，至少28，至少29，至少30，至少31，至少32，至少33，至少34或至少35个连续核苷酸的100％互补性。
[0153]
烟草类型
[0154]
一方面，所提供的烟草植物是选自由烤制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色晾制熟化烟草、深色明火烤制熟化烟草、烟草和东方烟草组成的组的烟草类型。另一方面，所提供的烟草植物是来自选自由以下组成的组的烟草类型：白肋烟、马里兰烟和深色烟。
[0155]
在一方面，所提供的烟草植物处于烤制熟化烟草的背景中或表现出此处所述的一种或更多种烤制熟化烟草的特征。烤制熟化烟草(也被称为弗吉尼亚烟草或亮烟草)约占世界烟草产量的40％。烤制熟化烟草通常也被称为“亮烟草”，因为它在熟化过程中达到金黄色到深橙色。烤制熟化烟草具有淡淡的、明亮的香气和味道。烤烟一般含糖量高而含油量低。烤烟的主要种植国是阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美国。一方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自由表1中列出的品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种组成的组的烤烟的品种。参见wo2004/041006a1。另一方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自由k326，k346和nc196组成的组的烤烟的品种。
[0156]
表1.烤制熟化烟草品种
[0157]
[0158][0159]
[0160]
一方面，所提供的烟草植物处于晾制熟化烟草的背景或表现出此处所述的一种或更多种晾制熟化烟草的特征。晾制熟化烟草包括白肋烟、马里兰烟和深色烟。与晾制熟化烟草相关的共同因素是熟化主要在没有人工热源和湿度源的情况下进行。白肋烟的颜色为浅棕色至深棕色、含油量高且含糖量低。白肋烟在谷仓中晾干。白肋烟的主要种植国是阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。
[0161]
马里兰烟非常蓬松、燃烧性能好、烟碱低并且香气中性。马里兰主要的种植国包括美国和意大利。
[0162]
一方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自由表2中列出的品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种组成的组的白肋烟品种。另一方面，本文提供的经修饰的烟草植物或种子是选自由tn90，kt209，kt206，kt212和hb4488组成的组的白肋烟品种。
[0163]
表2.白肋烟品种
[0164]
[0165][0166]
另一方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是马里兰烟草品种，其选自由表3中所列的品种和基本上衍生自前述品种中任一种的品种组成的组的任何烟草品种。
[0167]
表3.马里兰烟草品种
[0168][0169][0170]
一方面，所提供的烟草植物处于深色晾制熟化烟草的背景或表现出一种或更多种此处描述的深色晾制熟化烟草的特征。深色晾制熟化烟草与其他类型的区别主要在于其熟化过程，该熟化过程使深色晾制熟化烟草具有中褐色至深褐色的颜色并具有独特的香气。
深色晾制熟化烟草主要用于嚼烟和鼻烟的生产。一方面，所提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子处于选自由sumatra、jatim、dominican cubano、besuki、one sucker、green river、virginisun-cured和paraguan passado和基本上衍生自任何一种前述品种的任何品种组成的组的深色晾制熟化烟草的背景。
[0171]
一方面，所提供的烟草植物处于深色明火烤制熟化烟草的背景或表现出此处所述的一种或多种深色明火烤制熟化烟草的特征。通常，在封闭的熟化室地板上上，用低燃烧木火将深色明火烤制熟化烟草熟化。深色明火烤制熟化烟草用于制造管烟(pipe blends)、卷烟、嚼烟、鼻烟和烈性雪茄。深色明火烤制熟化烟草的主要种植区域是美国的田纳西、肯塔基和弗吉尼亚。一方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自由在表4中列出的烟草品种和基本上衍生自前述品种中的任一种的任何品种组成的组的深色烤制熟化品种。
[0172]
表4.深色烤制熟化烟草品种
[0173]
[0174][0175]
一方面，所提供的烟草植物处于东方烟草的背景或表现出此处所述的一种或更多种东方烟草的特征。由于东方烟草通常生长在地中海东部地区，如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马尼亚，因此也被称为希腊烟草、香气和土耳其烟草。东方烟草品种株型小、叶型小和独特的香气特性是它们适应生长它们的贫瘠土壤和恶劣的气候条件的结果。一方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自由表5中列出的烟草品种和基本上衍生自前述品种中的任一种的任何品种组成的组的东方烟草品种。
[0176]
表5.东方烟草品种。
[0177]
[0178][0179]
一方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自由表6中所列的烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种组成的组的雪茄烟品种。
[0180]
表6.雪茄烟品种
[0181][0182]
一方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自由表7中列出的烟草品种，和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种组成的组的烟草品种。
[0183]
表7.其他烟草品种
[0184]
chocoa(ti 319)hoja parada(ti 1089)hoja parado(galpoa)(ti 1068)perique(st.james parrish)perique(tc 556)
perique(ti 1374)sylvestris(ti 984)ti 179
[0185]
一方面，本文所述的经修饰的烟草植物，种子或细胞来自选自由表1，表2，表3，表4，表5，表6和表7中所列的烟草品种组成的组。
[0186]
一方面，低生物碱或低烟碱烟草植物，种子，杂种，品种或品系基本上衍生自或处于以下遗传背景中：bu 64，cc 101，cc 200，cc 27，cc 301，cc 400，cc 500，cc 600，cc 700，cc 800，cc 900，coker 176，coker 319，coker 371gold，coker 48，cu 263，df911，galpao tobacco，gl 26h，gl 350，gl 600，gl 737，gl 939，gl 973，hb 04p，k 149，k 326，k 346，k 358，k394，k 399，k 730，kdh 959，kt 200，kt204lc，ky 10，ky 14，ky 160，ky 17，ky 171，ky 907，ky907lc，kty14 x l8 lc，little crittenden，mcnair 373，mcnair 944，msky 14xl8，narrow leaf madole，nc 100，nc 102，nc 2000，nc 291，nc 297，nc 299，nc 3，nc 4，nc 5，nc 6，nc7，nc 606，nc 71，nc 72，nc 810，nc bh 129，nc 2002，neal smith madole，oxford 207，`perique`tobacco，pvh03，pvh09，pvh19，pvh50，pvh51，r 610，r 630，r 7-11，r 7-12，rg 17，rg 81，rg h51，rgh 4，rgh 51，rs 1410，speight 168，speight 172，speight 179，speight 210，speight 220，speight 225，speight 227，speight 234，speight g-28，speight g-70，speight h-6，speight h20，speight nf3，ti 1406，ti 1269，tn 86，tn86lc，tn 90，tn 97，tn97lc，tn d94，tn d950，tr(tom rosson)madole，va 309，or va359，maryland 609，hb3307plc，hb4488plc，kt206lc，kt209lc，kt210lc，kt212lc，r610lc，pvh2310，nc196，ktd14lc，ktd6lc，ktd8lc，pd7302lc，pd7305lc，pd7309lc，pd7318lc，pd7319lc，pd7312lc，shireylc或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业烟草品种。
[0187]
上面提到的所有深色晾干的白肋、马里兰、深色火烤的或东方型的特定品种仅出于示例性目的列出。在本技术中还考虑了任何其他的深色晾制熟化，白肋，马里兰，深色明火烤制熟化，东方品种。
[0188]
还提供了所描述的烟草植物的种群。一方面，烟草植物种群的种植密度为每英亩约5,000到约8000株之间、约5,000到约7,600株之间、约5,000到约7,200株之间、约5,000到约6,800株之间、约5,000到约6,400株之间、约5,000到约6,000株之间、约5,000到约5,600株之间、约5,000到约5,200株之间、约5,200到约8,000株之间、约5,600到约8,000株之间、约6,000到约8,000株之间、约6,400到约8,000株之间、约6,800到约8,000株之间、约7,200到约8,000株之间或约7,600到约8,000株之间。另一方面，烟草植物种群种植在具有低至中等肥力的土壤类型中。
[0189]
还提供来自所描述的烟草植物的种子的容器。本公开的烟草种子的容器可以容纳任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可以容纳至少或大于约100颗、200颗、300颗、400颗、500颗、600颗、700颗、800颗、900颗、1000颗、1500颗、2000颗、2500颗、3000颗、3500颗、4000颗或更多颗种子。或者，容器可以容纳至少或大于约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000克或更重的种子。烟草种子的容器可以是本领域中可获得的任何容器。作为非限制性实例，容器可以是盒子、袋子、小包、小袋、带卷、管或瓶。
[0190]
熟化/制品
[0191]
还提供由所描述的低生物碱或低烟碱烟草植物制成的熟化烟草材料。还提供由所描述的烟草植物制成的熟化烟草材料，其具有较高水平的总生物碱或烟碱。
[0192]“熟化”是一种老化过程，可减少水分并破坏叶绿素，使烟草叶呈金色并将淀粉转化为糖。因此，与收获的绿叶相比，经熟化的烟草具有较高的还原糖含量和较低的淀粉含量。一方面，所提供的绿叶烟草可以使用常规方式进行熟化，例如，熏烤、轻度熟化、火烤、晾干或晒干。对于不同类型的熟化方法的描述，参见，例如，tso(1999，《烟草、生产、化学和技术》davis&nielsen编辑，第1章，blackwell出版社，牛津)。经熟化的烟草通常在压缩条件下在木桶(例如，大木桶)或纸板箱中老化数年(例如，2到5年)，水分含量为10％到约25％之间。参见美国专利no.4,516,590和5,372,149。经过熟化和老化的烟草然后可以被进一步加工。进一步的加工包括在引入或不引入不同温度的蒸汽、进行或不进行巴氏灭菌以及发酵或不发酵的情况下在真空下调节烟草。发酵的典型特征是具有高的初始水分含量、发热以及干重损失10％到20％。参见，例如，美国专利no.4,528,993、4,660,577、4,848,373、5,372,149；美国公布no.2005/0178398；和tso(1999，《烟草、生产、化学和技术》第1章，davis&nielsen编辑，blackwell出版社，牛津)。经熟化、老化和发酵的烟草可以被进一步加工(例如，生切、切碎、膨化或混合)。参见，例如，美国专利no.4,528,993号；4,660,577；和4,987,907。一方面，本公开的经熟化烟草材料是晒干的。另一方面，本公开的熟化烟草材料是烤制熟化的、晾制熟化的或明火烤制熟化的。
[0193]
从本公开的烟草品系、品种或杂交体获得的烟草材料可以用于制作烟草制品。如本文所用，“烟草制品”被定义为旨在供人类使用或消费的由烟草制成或衍生自烟草的任何制品。
[0194]
所提供的烟草制品包括但不限于香烟制品(例如，香烟和比迪烟)、雪茄制品(例如，雪茄包装的烟草和小雪茄烟)、烟斗烟制品、衍生自烟草的制品、衍生自烟草的烟碱制品、无烟雾烟草制品(例如，湿鼻烟、干鼻烟和嚼烟)、薄膜、咀嚼片、标签，成形部件、凝胶、消耗单元、不溶性基质、空心形状、再造烟草、膨化烟草等。参见，例如，美国专利公布no.us 2006/0191548。
[0195]
如本文所用，“香烟”是指具有“杆”和“填充物”的烟草制品。香烟“杆”包括香烟纸、过滤嘴、卷烟纸(用于容纳过滤材料)、将香烟纸(包括填充物)保持在过滤嘴上的水松纸，以及将这些组分保持在一起的所有胶水。“填充物”包括：(1)所有烟草，包括但不限于重构和膨化烟草，(2)非烟草替代品(包括但不限于草药、非烟草植物材料和可以随烟草卷入香烟纸中的其他佐料)，(3)肠衣，(4)调味剂和(5)所有其他添加剂(混合到烟草和替代品中并卷成香烟)。
[0196]
如本文所用，“再造烟草”是指由烟草粉尘和其他烟草屑材料制成的一部分烟草填充物，被加工成片的形式并被切成条状以类似于烟草。除了节省成本外，再造烟草对于其通过利用氨与糖之间的反应来处理风味而产生的香烟味道也非常重要。
[0197]
如本文所用，“膨化烟草”是指烟草填充物的一部分，其通过合适的气体的进行膨化处理，以使烟草被“抽吸”，从而导致密度降低且填充能力更大。其减轻了香烟中使用的烟草的重量。
[0198]
衍生自本公开的植物的烟草制品还包括香烟和其他吸烟制品，特别是包括过滤元
件的那些吸烟制品，其中可吸烟材料的杆包括在烟草混合物中的经熟化的烟草。一方面，本公开的烟草制品选自由以下组成的组：小雪茄、不通风凹槽过滤嘴香烟、通风凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、叶烟、水烟、烟碎和烟丝。另一方面，本公开的烟草制品是无烟雾烟草制品。无烟雾烟草制品不燃烧，并且包括但不限于嚼烟、潮湿的无烟雾烟草、唇烟(snus)和干鼻烟。嚼烟是粗略划分的烟叶，通常装在较大的袋状包装中，并以塞子或旋拧的形式使用。潮湿的无烟雾烟草是一种湿润的、细分程度更高的烟草，以散装形式或袋装形式提供，通常包装在圆罐中，并且用作一撮或放在成年烟草消费者的脸颊和口香糖之间的袋中。唇烟是经过热处理的无烟雾烟草。干鼻烟是放在口中或经鼻使用的细磨烟草。在另外的方面，本公开的烟草制品选自由散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟组成的组。又一方面，本公开的烟草制品选自由电加热的香烟、电子烟、电子蒸发装置组成的组。
[0199]
一方面，本公开的烟草制品可以是混合烟草制品。一方面，混合烟草制品包含熟化烟草材料。一方面，熟化烟草材料构成烟草混合物中的熟化烟草的约至少10重量％，至少15重量％，至少20重量％，至少25重量％，至少30重量％，至少35重量％，至少40重量％，至少45重量％，至少50重量％，至少55重量％，至少60重量％，至少65重量％，至少70重量％，至少75重量％，至少80重量％，至少85重量％，至少90重量％或至少95重量％。一方面，熟化烟草材料构成烟草混合物中熟化烟草的约至少10体积％，至少15体积％，至少20体积％，至少25体积％，至少30体积％，至少35体积％，至少40体积％，至少45体积％，至少50体积％，至少55体积％，至少60体积％，至少65体积％，至少70体积％，至少75体积％，至少80体积％，至少85体积％，至少90体积％或至少95体积％。
[0200]
一方面，本公开的烟草制品可以是低烟碱烟草制品。另一方面，本公开的烟草制品可以包含小于约3mg/g的水平的降烟碱。例如，该制品中的降烟碱含量可以为3.0mg/g、2.5mg/g、2.0mg/g、1.5mg/g、1.0mg/g、750pg/g、500pg/g、250pg/g、100pg/g、75pg/g、50pg/g、25pg/g、10pg/g、7.0pg/g、5.0pg/g、4.0pg/g、2.0pg/g、1.0pg/g、0.5pg/g、0.4pg/g、0.2pg/g、0.1pg/g、0.05pg/g、0.01pg/g或无法检测到。
[0201]
一方面，所提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自由以下组成的组的平均烟碱或总生物碱水平：以干重计，约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。另一方面，所提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自由以下组成的组的平均烟碱或总生物碱水平：以干重计，约0.01％到0.02％之间、0.02％到0.05％之间、0.05％到0.75％之间、0.75％到0.1％之间、0.1％到0.15％之间、0.15％到0.2％之间、0.2％到0.3％之间、0.3％到0.35％之间、0.35％到0.4％之间、0.4％到0.5％之间、0.5％到0.6％之间、0.6％到0.7％之间、0.7％到0.8％之间、0.8％到0.9％之间、0.9％到1％之间、1％到1.1％之间、1.1％到1.2％之间、1.2％到1.3％之间、1.3％到1.4％之间、1.4％到1.5％之间、1.5％到1.6％之间、1.6％到1.7％之间、1.7％到1.8％之间、1.8％到1.9％之间、1.9％到2％之间、2％到2.1％之间、2.1％到2.2％之间2.2％到2.3％之间、2.3％到2.4％之间、2.4％到2.5％之间、2.5％到2.6％之间、2.6％到2.7％之间、2.7％到2.8％之间、2.8％到2.9％之间、2.9％到3％之间、3％到3.1％之间、3.1％到3.2％之间、3.2％到
3.3％之间、3.3％到3.4％之间、3.4％到3.5％之间、3.5％到3.6％之间。另一方面，所提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自由以下组成的组的平均烟碱或总生物碱水平：以干重计，约0.01％到0.1％之间、0.02％到0.2％之间、0.03％到0.3％之间、0.04％到0.4％之间、0.05％到0.5％之间、0.75％到1％之间、0.1％到1.5％之间、0.15％到2％之间、0.2％到3％之间、0.3％到3.5％之间。
[0202]
本公开进一步提供了制造烟草制品的方法，所述烟草制品包含来自所公开的烟草植物的烟草材料。一方面，该方法包括调节处理由烟草植物制成的陈化烟草材料，以将其含水量从介于约12.5％与约13.5％之间增加到约21％，从而混合经调节处理的烟草材料以产生期望的混合物。一方面，制造烟草制品的方法进一步包括对混合物进行包装加工或调味。通常，在包装加工期间，向混合物添加包装材料或酱料，以通过平衡化学组成来提高混合物的质量，并形成某些期望的风味特征。包装加工的另外的细节可以在《烟草生产、化学和技术》中找到，由l.davis和m.nielsen编辑，布莱克威尔科学，1999中找到。
[0203]
所提供的烟草材料还可以使用包含但不限于以下的方法进行加工：热处理(例如，烹饪、熟化)、调味、酶处理、膨胀和/或熟化的方法进行加工。发酵和非发酵烟草两者都可以使用这些技术加工。合适的经加工烟草的实例包含深色晾制熟化烟、深色明火烤制熟化烟、白肋烟、烤制熟化烟和雪茄填充料或包装纸，以及来自全叶填塞操作的制品。一方面，烟草纤维包含以鲜重计高达70％的深色烟草。例如，如美国公开号2004/0118422或2005/0178398所描述的，可以通过加热、渗出水分和/或巴氏灭菌步骤来处理烟草。
[0204]
所提供的烟草材料可以经历发酵。发酵的典型特征是初始含水分高、发热以及干重损失10％-20％。参见例如美国专利号4,528,993；4,660,577；4,848,373；和5,372,149。除了改变叶的香气，发酵还可以改变叶的颜色和质地中任意一种或两者。而且，在发酵过程期间，可以产生气体排出，可以吸收氧气，可以改变ph，并且可以改变保留的水量。参见例如美国公开号2005/0178398和tso(1999,《烟草生产、化学和技术》第1章，davis和nielsen编辑,牛津布莱克威尔出版社)。在掺入到口腔制品中之前，可以进一步加工(例如，切割、膨胀、混合、碾磨或粉碎)经熟化的烟草或经熟化并发酵的烟草。在一些情况下，烟草是在与共聚物和任选的香料和其它添加剂混合之前，烘箱挥发物含量介于48重量％与50重量％之间的长切发酵熟化潮湿烟草。
[0205]
一方面，所提供的烟草材料可以加工为期望尺寸。一方面，烟草纤维可以加工为平均纤维尺寸小于200微米。一方面，烟草纤维介于75微米与125微米之间。另一方面，烟草纤维加工为大小为75微米或更小。一方面，烟草纤维包含长切烟草，其可以被切割或切碎成宽度为约10切/英寸到约110切/英寸并且长度为约0.1英寸到约1英寸。双切烟草纤维可以具有一定范围的粒径，使得大约70％的双切烟草纤维落入-20目与80目的目径之间。
[0206]
所提供的烟草植物可以处理为烘箱总挥发物含量为约10重量％或更高；约20重量％或更高；约40重量％或更高；约15重量％到约25重量％；约20重量％到约30重量％；约30重量％到约50重量％；约45重量％到约65重量％；或者约50重量％到约60重量％。本领域的技术人员将理解，“潮湿”烟草通常是指烘箱挥发物含量介于约40重量％与约60重量％之间(例如，约45重量％到约55重量％，或约50重量％)的烟草。如本文所用，“烘箱挥发物”是通过计算样品在110℃的预热强制通风烘箱中干燥3.25小时后的重量损失百分比来确定。口腔制品的烘箱总挥发物含量不同于用于制造口腔制品的烟草纤维的烘箱挥发物含量。所
述的加工步骤可以减少或增加烘箱挥发物含量。
[0207]
育种
[0208]
本公开还提供用于培育包括期望的总生物碱或烟碱水平(例如，低烟碱或无烟碱)的烟草品系、栽培品种或品种的方法。可以通过任何已知过程执行育种。在标记物辅助选择(mas)育种程序中，可以使用dna指纹、snp图谱、单倍型作图或类似技术以将期望的性状或等位基因转移到烟草植物中或在烟草植物中育种。例如，育种者可以使用f1杂交植物在f2或回交代中产生分离群体，或者进一步使f1杂交植物与具有农学上期望的基因型的其它供体植物杂交。f2代或回交代的植物可以使用本领域已知的或本文列出的技术之一筛选出期望的农艺性状或期望的化学特征。根据期望的遗传模式或所使用的mas技术，可以在每个回交周期之前对所选植物进行自花授粉，以辅助鉴定期望的单个植物。可以重复回交程序或其它育种程序，直到恢复轮回亲本的期望表型。本公开中的轮回亲本可以是烤制熟化品种、白肋品种、深色晾制熟化品种、深色明火烤制熟化品种或东方品种。可以在例如以下中找到其它育种技术：wernsman,e.a.,和rufty,r.c.1987.第十七章《烟草》第669-698页，栽培品种培育作物物种。w.h.fehr(编辑),麦克米伦出版公司,inc.,new york,n.y.，其通过引用以其整体并入本文。
[0209]
使用所描述的烟草植物的植物育种计划的结果包含本公开的有用品系、栽培品种、品种、后代、近交体和杂交体。如本文所用，术语“品种”是指具有使其与同一物种的其它植物分开的恒定特征的植物群体。品种通常是(虽然不总是)商业销售的。虽然具有一个或多个独特的特征，但品种进一步表征为所述品种内个体之间的总体差异非常小。“纯系”品种可以通过若干代自花授粉和选择，或使用组织或细胞培养技术从单个亲本进行营养繁殖而产生。品种可以基本衍生自另一个品系或品种。如由《国际植物新品种保护公约(international convention for the protection of new varieties of plants)》(1961年12月2日，于1972年11月10日、1978年10月23日、1991年3月19日在日内瓦修订)所定义的，在以下情况下，品种“基本衍生”自初始品种：a)所述品种主要衍生自初始品种，或衍生自主要衍生自初始品种的品种，同时保留由初始品种的基因型或基因型组合产生的基本特征的表达；b)所述品种与初始品种明显不同；以及c)除了由衍生行为导致的差异外，所述品种在由初始品种的基因型或基因型组合导致的基本特征的表达方面符合初始品种。基本衍生的品种可以通过例如选择天然的或诱导的突变体、体细胞克隆变体、来自初始品种植物的品种个体、回交或转化而获得。第一烟草品种和第一品种所基本衍生的第二个烟草品种被视为具有基本相同的遗传背景。区别于品种的“品系”通常指一组非商业用途的植物，例如用于植物研究中。品系通常显示个体之间的一个或多个感兴趣的特征的总体变化很小，但是个体之间的其它特征可能存在一些变化。
[0210]
应当理解，本公开的任何烟草植物可以进一步包含额外的农艺上所需的性状，例如，通过使用本领域已知的技术用遗传构建体或转基因进行转化。非限制性地，所需性状的实例是除草剂抗性、抗虫性、抗病性；高产；高等级指数值；可熟化性；熟化质量；机械收获性能；耐熟能力；叶质量；高度、植物成熟(例如早熟、早熟到中熟、中熟、中晚熟或晚熟)；茎的大小(例如小的、中等的或大的茎)；或每株植物的叶数(例如少的(例如5-10叶)、中等的(例如11-15叶)或多的(例如16-21)叶数)或任意组合。在一些方面，本文公开的低烟碱或无烟碱的烟草植物或种子包含表达一种或多种杀虫蛋白的一种或多种转基因，所述杀虫蛋白例
如苏云金杆菌(bacillus thuringiensis)的晶体蛋白或来自蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)的营养型杀虫蛋白，诸如vip3(例如，参见estruch等.(1997)nat.biotechnol.15:137)。在其它方面，本文公开的烟草植物进一步包含赋予对棕色茎腐病的抗性(美国专利号5,689,035)或对抗囊胞线虫的抗性(美国专利号5,491,081)的导入性状。
[0211]
本公开还提供烟草植物，所述烟草植物包括经改变的烟碱水平或总生物碱水平，但产量与没有这种烟碱水平改变的相应初始烟草植物的产量可比。一方面，低烟碱或无烟碱的烟草品种提供了选自由以下组成的组的产量：约1200到3500lbs/英亩之间、1300到3400lbs/英亩之间、1400到3300lbs/英亩之间、1500到3200lbs/英亩之间、1600到3100lbs/英亩之间、1700到3000lbs/英亩之间、1800到2900lbs/英亩之间、1900到2800lbs/英亩之间、2000到2700lbs/英亩之间、2100到2600lbs/英亩之间、2200到2500lbs/英亩之间、2300到2400lbs/英亩。另一方面，低烟碱或无烟碱的烟草品种提供了选自由以下组成的组的产量：约1200到3500lbs/英亩之间、1300到3500lbs/英亩之间、1400到3500lbs/英亩之间、1500到3500lbs/英亩之间、1600到3500lbs/英亩之间、1700到3500lbs/英亩之间、1800到3500lbs/英亩之间、1900到3500lbs/英亩之间、2000到3500lbs/英亩之间、2100到3500lbs/英亩之间、2200到3500lbs/英亩之间、2300到3500lbs/英亩、2400到3500lbs/英亩之间、2500到3500lbs/英亩之间、2600到3500lbs/英亩之间、2700到3500lbs/英亩之间、2800到3500lbs/英亩之间、2900到3500lbs/英亩之间、3000到3500lbs/英亩之间、3100到3500lbs/英亩之间。另一方面，低烟碱或无烟碱的烟草植物提供为对照植物的产量的65％至130％，70％至130％，75％至130％，80％至130％，85％至130％，90％至130％，95％至130％，100％至130％，105％至130％，110％至130％，115％至130％，或120％至130％的产量，除了提供低烟碱或无烟碱性状的遗传修饰之外，所述对照植物具有基本相同的遗传背景。另一方面，低烟碱或无烟碱的烟草植物提供为对照植物的产量的70％至125％，75％至120％，80％至115％，85％至110％，或90％至100％的产量，除了提供低烟碱或无烟碱性状的遗传修饰之外，所述对照植物具有基本相同的遗传背景。
[0212]
一方面，adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物表现出一种或多种，两种或更多种，三种或更多种或所有选自下组的性状：与低生物碱背景对照相比的产量增加，与低生物碱背景对照相比的加速成熟和衰老，与低生物碱背景对照相比的对昆虫食草性的更低敏感性，以及与低生物碱背景对照相比的打顶后多胺含量降低。一方面，在低生物碱背景中的adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物表现出一种或多种，两种或更多种，三种或更多种或所有选自下组的性状：与la bu21相比的产量增加，与la bu21相比的加速成熟和衰老，与la bu21相比的对昆虫食草性的更低敏感性，以及与la bu21相比的打顶后多胺含量降低。
[0213]
一方面，adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物(例如，低烟碱，无烟碱或低生物碱烟草品种)不表现出一种或多种，两种或更多种，三种或更多种或全部la bu21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶面积叶肉细胞较多和熟化后最终制品质量差。一方面，所公开的烟草植物(例如，低烟碱，无烟碱或低生物碱烟草品种)不表现出两种或更多种la bu21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶面积叶肉细胞较多和熟化后最终制品
质量差。一方面，所公开的烟草植物(例如，低烟碱，无烟碱或低生物碱烟草品种)不表现出三种或更多种la bu21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶面积叶肉细胞较多和熟化后最终制品质量差。一方面，所公开的烟草植物(例如，低烟碱，无烟碱或低生物碱烟草品种)与la bu21，lafc53或lnky171相比表现出较低水平的一种或多种，两种或更多种，三种或更多种或全部la bu21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶面积叶肉细胞较多和熟化后最终制品质量差。一方面，所公开的烟草植物(例如，低烟碱，无烟碱或低生物碱烟草品种)与la bu21，lafc53或lnky171相比以更低的水平表现出两种或更多种la bu21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶面积叶肉细胞较多和熟化后最终制品质量差。一方面，所公开的烟草植物(例如，低烟碱，无烟碱或低生物碱烟草品种)与la bu21，lafc53或lnky171相比表现出较低水平的三种或更多种或全部la bu21性状，所述性状选自由以下组成的组：产量较低、成熟延迟和衰老、对昆虫食草性的更高敏感性、打顶后多胺含量增加、叶绿素较高、单位叶面积叶肉细胞较多和熟化后最终制品质量差。
[0214]
一方面，经修饰的烟草植物(例如，低烟碱，无烟碱或低生物碱烟草品种)包含adc，ao或odc遗传修饰和赋予所需性状(例如，低烟碱，无烟碱或低生物碱)而基本上不影响选自由以下组成的组的性状：产量、成熟和衰老、对昆虫食草性的易感性、打顶后多胺含量、叶绿素水平、单位叶面积叶肉细胞数和熟化后最终制品质量。
[0215]
一方面，adc，ao或odc突变体或转基因烟草植物包含赋予所需性状(例如低烟碱，无烟碱或低生物碱)的修饰，并且还包含与未经修饰的对照植物基本上可比的性状，其中所述性状选自下组：产量，成熟和衰老，对昆虫食草的敏感性，打顶后的多胺含量，叶绿素水平，每单位叶面积的叶肉细胞数和熟化后的终产物质量。
[0216]
一方面，所提供的烟草植物是杂交植物。可以通过以下产生杂交体：阻止第一品种的母本植物(例如，种子亲本)的自花授粉，从而允许来自第二品种的父本植物的花粉使母本植物受精，并且允许f1杂交种子在母本植物上形成。可以通过在花发育的早期去雄来阻止雌株的自花授粉。或者，可以使用一种雄性不育的形式来阻止母本植物上的花粉形成。例如，雄性不育可以通过雄性不育(ms)、其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成的转基因雄性不育产生或自交不亲和产生。含有ms的母本植物特别有用。在母本植物是ms的方面，可以从雄性可育植物中收获花粉，并将所述花粉人工施加到ms母本植物的柱头上，并且收获所得到的f1种子。
[0217]
可以使用植物来形成单交烟草f1杂交体。将来自父本植物的花粉人工转移到去雄的母本植物或雄性不育的母本植物中以形成f1种子。或者，可以进行三向杂交，其中单交f1杂交体用作母本并与不同的父本杂交。作为另一种替代方案，可以产生双杂交，其中两个不同单交的f1后代本身是杂交的。当形成双杂交杂交体时，自交不亲和性可以用于特别有利地阻止母本的自花授粉。
[0218]
一方面，低烟碱或无烟碱的烟草品种是雄性不育的。另一方面，低烟碱或无烟碱的烟草品种是胞质雄性不育的。可以通过本领域已知的任何方法产生雄性不育烟草。以下描述了产生雄性不育烟草的方法：wernsman,e.a.,和rufty,r.c.1987.第十七章《烟草》第
669-698页，栽培品种培育作物物种。w.h.fehr(编辑),麦克米伦出版公司,inc.,new york,n.y.第761页。
[0219]
在另外的方面，所提供的烟草植物包含但不限于叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、荚果、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、芽、细胞和原生质体。一方面，所提供的烟草植物不包含种子。一方面，本公开提供了烟草植物细胞、组织和器官，其是非生殖材料的并且不介导植物的自然繁殖。另一方面，本公开还提供了烟草植物细胞、组织和器官，其是生殖材料的并且介导植物的自然繁殖。另一方面，本公开提供不能通过光合作用维持自身的烟草植物细胞、组织和器官。另一方面，本公开提供烟草植物体细胞。与生殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
[0220]
所提供的细胞、组织和器官可以来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、茎、茎、荚、花、花序、茎、花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部、维管组织。另一方面，本公开提供烟草植物叶绿体。在另外的方面，本公开提供表皮细胞、气孔细胞、叶或根毛、贮藏根或块茎。另一方面，本公开提供烟草原生质体。
[0221]
本领域技术人员理解烟草植物通过种子自然繁殖，而不是通过无性繁殖或营养繁殖。一方面，本公开提供烟草胚乳。另一方面，本公开提供烟草胚乳细胞。另一方面，本公开提供雄性或雌性不育烟草植物，其在没有人干预的情况下不能繁殖。本领域技术人员还理解，熟化烟草不构成活生物体并且不能生长或繁殖。
[0222]
核酸/多肽
[0223]
一方面，本公开提供核酸分子，其包含与选自由seq id nos:1-36及其片段的序列组成的组的序列具有至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性。一方面，本公开提供多肽或蛋白质，其包含与选自由seq id nos:37-54组成的组的氨基酸序列具有至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性或相似性。另一方面，本公开提供了蛋白质的生物活性变体，其具有选自由seq id nos:37-54组成的组的氨基酸序列。本公开的蛋白质的生物活性变体可以与所述蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基、少至10个、少至9个、少至8个、少至7个、少至6个、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个或少至1个氨基酸残基。还提供包含选自由seq id nos:1-54组成的组的序列的基因或蛋白的直向同源基因或蛋白。“直向同源物”是衍生自共同的始祖基因并且作为物种形成的结果存在于不同物种中的基因。直向同源物可以在核苷酸序列和/或蛋白质序列水平上具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性或相似性。直向同源物的功能在物种间通常是高度保守的。
[0224]
如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中是指当在指定的比较窗口上进行最大对应性比对时在两个序列中相同的残基。当参照蛋白质使用序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，因此不改变分子的功能性质。当序列的保守取代不同时，可向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性。由于这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。对于
本文提供的任何蛋白质序列，还考虑了由于一个或更多个众所周知的保守氨基酸取代而在一个或更多个氨基酸上不同的功能同源蛋白质，例如缬氨酸是丙氨酸的保守取代，苏氨酸是丝氨酸的保守取代。天然序列中氨基酸的保守取代可选自天然存在的氨基酸所属类别的其它成员。这些不同类别中的代表性氨基酸包括但不限于：(1)酸性(带负电荷)氨基酸，诸如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷)氨基酸，诸如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，诸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非极性(疏水性)氨基酸，诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。天然氨基酸序列中氨基酸的保守取代物可以选自天然存在的氨基酸所属的组中的其它成员。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。天然保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本公开的另一个方面包括由于在天然序列中缺失或插入一个或更多个氨基酸而在一个或更多个氨基酸上与所述蛋白质序列不同的蛋白质。
[0225]
提供的核酸分子、多肽或蛋白质可以是分离的或基本上纯化的。“分离的”或“纯化的”核酸分子、多肽、蛋白质或其生物活性部分实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与多核苷酸或蛋白质伴随或相互作用的组分。例如，分离或纯化的多核苷酸或蛋白质当通过重组技术产生时基本上不含其它细胞物质或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。
[0226]
现在已经一般性地描述了本公开内容，通过参考以下实施例将更容易地理解本公开内容，除非另有说明，否则以下实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本公开内容。
[0227]
实施例
[0228]
实施例1：rnai途径
[0229]
植物生物碱包括广泛分布于植物界的一大类含氮代谢物。普通烟草(nicotiana tabacum l.)(烟草)的生物碱，尤其是烟碱的生物碱，是次生代谢物，自很久以前以来，已在生物学，商业，社会和医学中引起广泛关注(tso和jeffrey 1961；leete 1977；waller和nowacki 1978；baldwin1989；dewey和xie 2013；patra等，2013)。商业烟草栽培品种通常产生水平在总干生物质重量的2-6％之间的生物碱。在典型的商业烟草植物中，烟碱占总生物碱库的约90％(tayoub等人，2015；moghbel等人，2017)，由次生生物碱降烟碱(烟碱的脱甲基化衍生物)，新烟草碱和假木贼碱构成主要的剩余部分(saitoh等人，1985；sisson和severson 1990)。最近在测序和分子生物学方面的进展导致对编码负责这些次生代谢物的生物合成的酶的大多数基因的表征(dewey和xie2013)。
[0230]
烟草基因组序列的可得性和许多涉及烟碱生物合成途径的结构和调节基因的知识(kajikawa等人，2017)提供了操纵烟草基因表达以干扰生物合成途径，并由此改变叶生物碱含量的可能性。例如，kajikawa等人(2017)关于系统发育和表达分析的报道揭示了烟碱生物合成途径的一系列结构基因，其形成调节子并在茉莉酮酸酯响应性亚乙基响应因子
(erf)转录因子的控制下操作。
[0231]
认为腐胺(一种重要的多胺前体)通过鸟氨酸脱羧酶(odc)的活性衍生自鸟氨酸，并且可能通过精氨酸脱羧酶(adc)的活性衍生自精氨酸。腐胺可用作反应物以在普通烟草和相关物种中产生烟碱的吡咯烷环。为测试普通烟草中的精氨酸生物合成途径，tabacum，chintapakorn和hamill(2007)使用烟草的发根培养系统的反义方法，以下调转化体植物中的adc活性。他们发现在它们各自的大部分培养周期中，反义-adc和对照品系中的烟碱浓度是可比的，除了在发育的后期，当反义-adc品系的烟碱含量比对照中的低～20％时(chintapakorn和hamill(2007)。他们发现，与对照相比，在培养周期的后期，在两个adc-反义品系中的新烟草碱(其是典型地在普通烟草中的第二丰富的生物碱)的水平略微升高。他们的工作表明adc介导的腐胺途径在提供用于烟碱合成的吡咯烷环中起作用，但不是最重要的。
[0232]
为了测试普通烟草中的鸟氨酸生物合成途径，deboer等人(2011)使用rnai方法，还使用毛状根培养系统以下调普通烟草中的odc转录物水平。他们观察到对转基因组织的生物碱分布的显著影响，odc转录物下调导致培养的毛状根和完整温室生长的植物中更低的烟碱和增加的新烟草碱水平。他们得出结论，在烟碱生物合成和定义普通烟草中烟碱:新烟草碱比率方面，鸟氨酸代谢物和odc催化的腐胺生物合成途径比adc介导的途径更重要。这些发现由deboer等人(2013)进一步验证。结果表明，rnai介导的粉兰烟草(nicotiana glauca)中鸟氨酸脱羧酶(odc)表达的下调阻碍了众所周知的对烟碱和假木贼碱的生物合成和积累的创伤应激刺激。
[0233]
在此，进行系统性工作以应用rnai技术并下调烟草中几种生物碱生物合成相关基因的表达，包括精氨酸脱羧酶，胍丁胺脱亚胺酶，天冬氨酸氧化酶，精氨酸酶，鸟氨酸脱羧酶和s'腺苷-l:-甲硫氨酸(sam)合酶(s'adenosyl-l:-methionine(sam)synthase)。这项工作有助于更全面地理解烟碱生物合成中这些不同基因和途径之间的相互作用。
[0234]
实施例2：植物材料
[0235]
本研究中采用的植物材料是普通烟草，cvk326-alcs3(野生型烟草)。在种子萌发并在补充有维生素和30gl-1
蔗糖的固体murashige和skoog(ms；1962)琼脂培养基上初始生长后，获得dixie杯中的体外幼苗。将幼苗在24℃下保持16/8-h光周期(图1a)。
[0236]
为了稳定转化，将这些烟草幼苗的1cm
×
1cm叶碎片用转基因根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)感染，将叶浸入含有1gl-1
酵母提取物，5gl-1
肉提取物，5gl-1
细菌蛋白胨，5gl-1
蔗糖，492.8mgl-1
mgso4·
7h2o，以及0.2mm乙酰丁香酮，ph6.8的25mlyeb细胞悬浮液中5分钟。yeb培养基中的根癌(a.tumefaciens)细胞的光密度(od
600
)在0.8和1之间。浸泡后，用无菌whatman纸轻轻吸干叶碎片，然后转移到含有ms培养基的petri琼脂平板上，并在黑暗中培养2天。
[0237]
为了选择和再生，将处理过的叶碎片转移到含有补充有500mgl-1
头孢氨噻，150mgl-1
卡那霉素，1mgl-1 6-苄氨基嘌呤(ba)，1mgl-1
盐酸硫胺素和100mgl-1
肌醇的ms培养基的琼脂平板上。在此选择下的三轮转移足以使再生体生根，然后将再生体转移到含有500mgl-1
头孢噻肟和150mgl-1
卡那霉素的dixie杯中的ms琼脂培养基中。在卡那霉素存在下选择和再生这些步骤后获得的小植株被认为是t0转化体代。
[0238]
将在dixie杯中生长约5周之后的生根转化体转移到温室中的土壤中，并在环境阳
光条件下培养(图1b)。开花后，收集t1种子，灭菌，编目，在卡那霉素选择下发芽，并在150mgl-1
卡那霉素存在下在dixie杯中体外单独培养。之后，将这些t1小植株转移到温室，作为t1转化体代。
[0239]
当它们开始开花时，在温室中对t1烟草植物进行打顶。在该途径中，除去花头和从顶部向下至第一个完全展开的叶的芽。在进一步生长和叶扩张的两周后，收获来自顶部的第3和第4片叶用于分析。
[0240]
实施例3：细菌和质粒
[0241]
为了转化烟草植物，产生并使用9种根癌土壤杆菌lba4404：野生型对照和携带二元植物表达载体p45-2-7-1的8个工程化菌株，其各自的核苷酸编码rnai序列和抗生素选择序列(卡那霉素)作为细菌和植物转化体中的选择标记。这些序列之前是作为组成型启动子的木薯叶脉花叶病毒(csvmv)，之后是胭脂碱合酶基因(nos)终止子。
[0242]
rnai设计基于编码表8所列的蛋白质转录本序列。从内部nt3.1数据库中检索目的基因(鸟氨酸脱羧酶-odc，精氨酸脱羧酶-adc，天冬氨酸氧化酶-ao，s-腺苷甲硫氨酸合成酶-sams，胍丁胺脱亚胺酶-aic和精氨酸酶-arg)的编码区。上述基因的cdna序列、rnai构建体设计、和相应的核苷酸序列如表9所示。对于每个目标基因，选择约230bp至350bp的特定区域，并分别以正向和反向插入拟南芥肌动蛋白-11基因(genbank登录号#bt005593.1)的第二内含子。由于靶基因中的高序列相似性，odc-1a和odc-1b可被一种rnai构建体(odc-rnai)靶向。类似地，adc-1a和adc-1b可以被一种rnai构建体(adc-rnai)靶向。整个盒在genscript(piscataway，nj)合成并在木薯叶脉花叶病毒启动子和胭脂碱合酶终止子的控制下克隆。二元载体含有卡那霉素抗性基因nptii，用于转基因植物选择。使用2组引物通过pcr和sanger测序验证质粒序列：具有csvmv-f的内含子-r和具有nost-r的内含子-f(参见表10)。然后，将质粒转化到根癌土壤杆菌中，阳性克隆用于转化烟草。天冬氨酸氧化酶和sam合酶分别需要设计，构建和使用两个和三个rnai构建体。其它rnai构建体仅使用单一rnai构建体。
[0243]
表8生物碱生物合成基因的基因名称，genbank id和定位号。设计rnai构建体(请参见补充材料，第12页)，并通过根癌土壤杆菌转化将其输入烟草的核基因组中。
[0244][0245]
表9.此处使用的生物碱生物合成基因的基因名称和序列。基因组dna序列包括诸如启动子，5'utr，内含子，3'utr和终止子的区域。rnai序列是指用于产生反向重复rnai编码盒的基因特异性序列。如所示的，由于这些基因序列的高度相似性，某些rnai序列可以靶向多个基因。
[0246]
[0247][0248]
实施例4：农杆菌浸润
[0249]
在大约相同发育阶段，将大约15cm高温室栽培的烟草植物用于各种rnai构建体的瞬时表达实验。对于浸润，将具有在28℃下生长的细胞的根癌土壤杆菌的过夜培养物离心，并将细胞沉淀物再悬浮于土壤浸润缓冲液(10mm mes，ph＝5.7，10mm mgcl2和0.2mm乙酰丁香酮)中至最终od
600
＝0.5。将细胞在该培养基中温育3小时而不摇动。通过将具有农杆菌混合物的3ml无菌注射器的尖端压入叶的轴外侧，每种农杆菌类型(包括野生型对照)的至少三片叶被浸润(图2)。在温育两天后收获农杆菌浸润的叶，在液氮中冷冻，随后保持在-80℃直至准备使用。
[0250]
实施例5：生物碱提取
[0251]
对于本文的所有示例性数据，使用新鲜或冷冻的叶材料进行总叶生物碱提取。将1cm
×
1cm的新鲜叶或50mg冷冻干燥的叶材料浸于1ml100％甲醇中，并在该溶剂存在下温育2小时。在此期间，将样品置于超声冰水浴中。短暂离心沉淀碎片后，收集上清液并用500μl2％(v:v)h2so4酸化，并用chcl3(2x500μl)去除疏水性中性化合物。随后通过加入200μlnh4oh(25％)碱化剩余的极性级分，用chcl3(3
×
500μl)萃取生物碱。蒸发有机溶剂(chcl3)，并在气相色谱(gc)之前将样品溶解在纯甲醇中，或溶解在磷酸盐缓冲溶液(71.6gl-1
na2hpo3，ph 4.7)中用于比色分析。
[0252]
实施例6：总生物碱定量化
[0253]
对于本文的所有示例性数据，由patel et al.(2015),int j pharm pharm sci 7:249
–
251开发的分光光度法应用了一些修改。简言之，将从每个新鲜叶盘提取的生物碱或50mg冻干叶材料重悬于200μl磷酸盐缓冲溶液(ph4.7)中，与200μl溴甲酚绿溶液(bcg)(1mm储备液)混合，然后加入400μl氯仿以提取生物碱。最后，用uv-vis shimadzu uv-1800分光光度计在350-550nm区域测量溶液的吸收光谱(图3，上图)。校准曲线由在415nm处的最大吸光度构成，作为溶液中烟碱浓度的函数。烟碱被选为该校准曲线的首选分子，因为它是烟叶
中含量最多的生物碱。校准曲线作为标准，在400μl体积中包含0.375、0.75、1.50、3、6和12μg烟碱(图3，下图)。
[0254]
实施例7：烟碱的直接检测和定量
[0255]
对于本文的所有示例性数据，为了定量叶中烟碱的具体水平，使用配备有火焰离子化检测器(fid)的shimadzu gc-2014气相色谱设备对从50mg冻干材料中提取的生物碱进行gc-fid分析。使用30m，0.32mm内径和0.25μm膜厚度的熔融二氧化硅毛细管柱(rtx-5resteck)，以n2作为载气，流速为1mlmin-1
。温度分布为60℃，随后温度速率增加12℃min-1
直至290℃。注射器和检测器温度设定为290℃，注射体积为8μl，分流设定为20：1(图4)。该分析显示该装置对烟碱浓度的线性响应和12.5μg烟碱ml-1
的检测限。
[0256]
实施例8：基因组dna的pcr和rt-qpcr
[0257]
为了鉴定和验证阳性rnai转化体，通过基因组dna pcr使用phire plant direct pcr master mix(thermo scientific)测试卡那霉素选择标记的存在。pcr反应的实验条件为：95℃5min，然后35个循环，包括：95℃60s；60℃30s；72℃60s；和72℃5min。通过在琼脂糖凝胶(1％)中解析基因组dna的pcr产物来验证农杆菌浸润后烟草叶中目标基因的存在。延伸因子1a(ef-1a)用于表达标准化，作为核编码的参照基因。对于rt-qpcr，使用2μl的cdna并且每个样品一式三份地在以下条件下运行：95℃2min，然后35个循环，包括：95℃10s；60℃20s；72℃20s；72℃2min。
[0258]
使用tri(sigma-aldrich)分离来自植株材料的总rna。从用dnase i，无rna酶(thermo scientific)处理的1μg总rna制备cdna，并用m-mulv逆转录酶(new englandinc)合成。用cfx96 touch实时pcr检测系统(bio-rad)测试幼苗中的表达水平。用universal的qpcr预混液(neb)制备反应混合物，每个样品一式三份在以下条件下运行：95℃2min，然后40个循环，包括：95℃10s；60℃20s；72℃20s，随后是熔融曲线。对于这些实验，在primer-blast的辅助下设计对各种目的基因特异的引物(表10)。
[0259]
表10.对各种目的基因特异的引物和其它引物。引物id已编码。例如，odc_qpcr_fw代表在qpcr中用于odc基因的正向引物。设计引物使得所有同源基因被单对引物识别。
[0260]
引物id序列序列号odc_qpcr_fwacgtttccgacgactgtgtt65odc_qpcr_rvgcagctccggtaactggtaa66adc_qpcr_fwgtgtcacagagcgatagccc67adc_qpcr_rvtgcttgagcgtctcgaacat68ao_qpcr_fwtgttgtgccaacctggtagt69ao_qpcr_rvgttggcaacctctcgctttc70sam_qpcr_fwtgacttcaggcctggaatgat71sam_qpcr_rvccttgacagtctcccaggtg72aic_qpcr_fwggtacaaggcttgctgcttc73aic_qpcr_rvtctggaaacgccagtgagag74arg_qpcr_fwgcggtctctctttccgtgat75arg_qpcr_rvgcagtcatgccatcaacagt76
elongationf_fwtggtcaggagattgcgaaagagc77elongationf_rvacgcaaaacgctccaatggtg78kanr_fwcaagatggattgcacgcagg79kanr_rvtgatattcggcaagcaggca80csvmv-fccagaaggtaattatccaag81intron-racaaagccaagaaagggtact82intron-fagatcttcaacacctacaccatt83nost-ragttgctcgaggaattcccg84
[0261]
实施例9：多胺的提取和量化
[0262]
对于本文的所有示例性数据，为了提取游离多胺，将250mg新鲜叶匀浆，并与1ml5％高氯酸在冰上温育30分钟。将混合物在4℃下以12,000g离心10分钟，并将0.8ml上清液转移至新的2ml管中。将该上清液与0.8ml过饱和碳酸钠，40μl0.5mm 1,7-庚二胺(hdt)和10μl氯甲酸异丁酯混合。在35℃下温育30分钟后，加入200μl甲苯，充分混合，并以10,000g离心1分钟。将100μl有机层的等分试样用于gc-fid分析。
[0263]
gc-fid分析用如上所述的配备有火焰离子化检测器(fid)的shimadzu gc-2014气相色谱设备进行。在这种情况下的温度分布为110℃，随后温度速率以30℃min-1
增加直至320℃，保持13min。注射器和检测器温度设定为250℃，注射体积为8μl且分流设定为15：1。使用腐胺(put)，尸胺(cad)，hdt样内标，亚精胺(spd)和精胺(spm)进行校准曲线。对于这些化合物中的每一种，使用上述标准在10、5、2.5、1.25和0.625mm的浓度下测量校准曲线。
[0264]
实施例10：瞬时表达的评价
[0265]
为了评价rnai构建体对各自基因表达的影响，将来自相同发育阶段的烟草植物的叶农杆菌浸润，用于瞬时表达测量。用含有各自rnai构建体(表8)的9种不同的根癌土壤杆菌菌株(at-adc、at-aic、at-ao1、at-ao2、at-arg、at-odc、at-sams 1、at-sams 2和at-sams3)和对照菌株接种烟草植物。在用质粒温育2天后，收获接种的叶，在液氮中冷冻，并储存在-80℃下直至准备使用。从每个叶样品中提取总rna并进行rt-qpcr分析。mrna水平的基因表达水平报告为与对照的那些相比，在rnai构建体存在下每个基因转录物的百分比。记录以下水平(
±
平均值的标准误差)：adc＝88％(
±
10％)，aic＝33％(
±
28％)，ao1＝63％(
±
14％)，ao2＝67％(
±
30％)，arg＝84％(
±
15％)，odc＝62％(
±
15％)，sams1＝62％(
±
10％)，sams2＝70％(
±
16％)，sams3＝67％(
±
17％)。这些结果提供了rnai构建体对相应基因表达的影响的初步评估。
[0266]
实施例11：基因组转化体的筛选
[0267]
首先在实验室中体外培育约120个t0 rnai和对照植物，直到它们达到约10cm的高度。选择这些用于抗生素抗性，并通过pcr分析进一步测试rnai转基因的存在。将它们转移到温室中以在土壤中生长，并通过自花受精产生t1种子。收获t1种子，灭菌，并且首先在实验室中在卡那霉素存在下体外萌发。通过rt-qpcr测试来自散发的t1幼苗的叶样品以评价靶基因表达水平(图5)。转录水平以野生型中相应转录水平的分数(％)作图，从而提供t1 rnai转化体烟草植物中基因表达的评价，以及rnai方法对基因表达下调的功效的评价。结果显示，对于衍生自adc，aic，ao和odc rnai转化的所有独立事件系，转录物水平显著较低，低至野生型的1％(图5)。arg和sams转化体品系显示混合和/或不一致的结果，其中一些品
系具有与野生型可比的转录水平，而其它品系显示显著更低的水平。从每个转化事件中选择至少3株靶基因表达水平较低的植物用于温室中的进一步生长和后续分析。共评价了包含9个rnai构建体加上野生型的36个品系。每个rnai构建体的转化体的具体数量示于表11和图5中(rnai转化体细胞系)。对于adc，ao2和sams1，仅检查来自独立事件的三个品系，而对于odc rnai转化体，检查来自独立事件的六个品系。对于其它rnai转化体的情况，检查来自独立事件的中间数量的品系(表11)。
[0268]
在表11中引用的每个t1 dixie杯幼苗中进行总生物碱含量的初步测量。图6示出了被选择传送到温室的这36个品系的值。在该早期营养阶段，与野生型对照(wt)相比，只有ao1 rnai和一些odc rnai品系显示显著较低的总生物碱含量。相反，所有ao2和sams rnai品系显示出比野生型(wt)显著更高的生物碱含量值。随后的测量在较晚的发育阶段进行，成熟植物在早期出芽阶段后在温室中生长(图7)。在该植物发育阶段，除了一些ao2和adc品系(其继续显示显著更大的生物碱含量值)之外，大多数转基因品系中的总生物碱含量与对照(wt)相比更低。
[0269]
表11.在来自成熟烟草植物的完全扩增的叶中检测到具有最低转录水平的rnai构建体和rnai转化体品系。
[0270][0271]
实施例12：叶烟碱分析
[0272]
为了定量烟碱，除去花头和从顶部向下至第一片完全展开的叶的芽。打顶后两周，从顶部收获第3和第4片叶，除去中脉，将叶在液氮中冷冻并冻干。研磨样品并用于总生物碱提取。来自每个t1品系的三个生物复制品中叶的平均烟碱含量显示在图8中。与对照(wt)相比，表达ao1-rnai和ao2-rnai的所有转化体具有最低的烟碱值。后者具有3.9
±
1.3mgnct/gdw。ao1-rnai品系的烟碱含量范围在0和0.26mg nct/gdw之间变化。ao2-rnai品系的烟碱含量范围在0.30-0.64mg nct/gdw之间变化。在odc-rnai品系1，13，14和15中观察到烟碱含量的下一个最显著抑制。并且，adc-rnai具有至少两个具有比野生型低的烟碱含量的品系。相反，与野生型对照相比，品系aic-rnai，arg-rnai和sams2-rnai没有显著差异。
[0273]
实施例13：多胺分布
[0274]
与用于烟碱分析的样品的情况一样，用于多胺测定的样品取自打顶植物。图9a显示了各种rnai品系中的平均腐胺含量。与野生型相比，adc-rnai和odc-rnai品系具有显著更低的put含量，而aic-rnai，arg-rnai和sams-rnai品系具有与对照中测量的相同的腐胺
水平(图9a，wt)。adc-rnai中的腐胺水平似乎低于odc-rnai品系，然而，两次测量中的不确定性(误差条)会妨碍得出这种明确的结论。与对照相比，rnai转化体的亚精胺(图9b)和尸胺(图9c)含量在统计学上是不变的。
[0275]
实施例14：rnai转化体的叶表型
[0276]
注意到不同转化体和野生型对照之间叶表型的差异。在所有的aic-rnai品系中(图10a)，完全展开的和最老(下面)的叶显示出过早变成黄色，然后变成红棕色。它们最初会形成同心环状斑点，这些斑点会扩大并融合形成更大的组织叶区域，让人联想到衰老。通常，在表达aic-rnai构建体的植物中，成熟和最老(下面)的叶的光合作用生存力受到负面影响。这种现象局限于下面的叶，似乎不会影响这些植物的上面的叶，包括那些被取样用于生物碱，烟碱和多胺分析的叶。
[0277]
仅在一些ao1-rnai品系(图10b)中，完全展开且最老(下面)的叶也变黄，形成白斑，其随后变成红棕色。产生这种表型的品系(ao1品系7，10和11)是上部叶中烟碱含量水平最低的品系。有趣的是，没有ao-2-rnai植物发展出早期衰老表型。
[0278]
应当注意，上述这些着色变化影响这些转化体中最老的叶，而较高的上部叶，包括从顶部收获用于生物碱和烟碱分析的第3和第4片叶，具有正常绿色色素沉着和其它健康表型，非常类似于野生型对照。
[0279]
实施例15：植物数据结论
[0280]
上述例举的结果表明，在以rnai构型表达精氨酸脱羧酶(adc)，鸟氨酸脱羧酶(odc)和天冬氨酸氧化酶(ao)的植物中，烟叶中的烟碱含量减弱最多。odc的结果支持由鸟氨酸脱羧酶(odc)催化的鸟氨酸至腐胺的反应(图11)是生物碱和烟碱生物合成和积累中的重要步骤。在图11中示意性显示的推定过程中，结果还显示，烟酸酯和烟酰胺代谢途径在烟碱的合成和累积中也是重要的。相反，结果强化了精氨酸和脯氨酸代谢的步骤和相关的酶，包括胍丁胺脱亚胺酶(aic)和精氨酸酶(arg)(图11)在测定叶烟碱水平中不起重要作用的观点。在rnai介导的s'腺苷-l:-甲硫氨酸(sam)合酶下调时注意到了中间的烟碱减弱作用，表明甲硫氨酸至亚精胺再至腐胺也可有助于烟碱合成和累积。总之，本文提供的结果表明，由多种不同酶催化的多种不同生物合成途径可为商业烟草栽培品种中烟碱生物合成提供底物。
[0281]
实施例16：随机诱变
[0282]
使用甲磺酸乙酯(ems)诱变或快中子轰击进行烟草植物的随机诱变。ems诱变由化学诱导基因组长度上的随机点突变组成。快中子诱变包括将种子暴露于中子轰击，其通过双链dna断裂导致大的缺失。
[0283]
对于ems诱变，将1克(约10,000粒种子)tennessee 90烟草(tn90)种子在0.1％tween中洗涤15分钟，然后在30ml ddh2o中浸泡2小时。然后，将150μl的0.5％ems(sigma，目录号m-0880)混合到种子/ddh2o溶液中，并在室温(rt；约20℃)下在通风橱下温育8-12小时(以30rpm旋转)。然后，从种子中除去液体并混入1m氢氧化钠中过夜以净化和处理。然后，用100ml ddh2o洗涤种子2-4小时。然后，将洗涤的种子悬浮在0.1％琼脂溶液中。
[0284]
将在琼脂溶液中的ems处理的种子以～2000粒种子/平板均匀地铺展在平板中的水浸泡的carolina’s choice tobacco mix(carolina soil company，kinston，nc)上。然后，用塑料包裹物覆盖平板并置于生长室中。一旦幼苗从土壤中排出，将塑料包装刺穿以允
许湿度逐渐下降。两周后完全除去塑料包装。将平板移至温室并用npk肥料施肥。将幼苗重新插入浮盘并生长至移植大小。随后将植物移植到田地中。在生长过程中，植物自花授粉形成m1种子。在成熟阶段，从每株植物收获5粒蒴果(capsule)，并对来自每株植物的种子组给出单独的名称。这形成了m1群体。使来自每种m0植物的m1种子的组合物生长，并收集来自m1植物的叶用于dna提取。扩增靶基因并测序用于突变鉴定。在表8和9中列出的每个基因中鉴定突变，集中于所有adc，ao和odc基因。还产生较高阶突变组合以实现例如两个adc基因中的双重突变体，两个odc基因中的双重突变体或所有三个ao基因中的三重突变体。
[0285]
实施例17：靶向诱变
[0286]
通过精确的基因组工程技术，例如转录激活物样效应物核酸酶(talen)，大范围核酸酶，锌指核酸酶和crispr(cas9系统，cpf1系统或csm1系统)，通过将突变引入表8和9中所列的每个靶基因之中和周围，产生具有低烟碱的烟草品系。在商业烟草品种(如tn90，k326和窄叶madole)中进行基因组修饰。编辑表8和表9中所列的所有基因，特别关注adc，ao和odc基因。
[0287]
例如，设计并合成crispr向导rna以识别特异性靶序列。然后，将向导rna和编码cas9，cpf1或csm1蛋白的伴随核酸(作为dna质粒形式或作为mrna形式)用于转化烟草原生质体。crispr-cas9/cpf1/csm1核糖核蛋白复合物识别特定的ncg靶序列并引入双链断裂(dsb)。内源性非同源末端连接(nhej)dna修复系统固定dsb，其可引入核苷酸缺失，插入或取代并导致潜在的功能缺失突变。或者，将具有所需序列的供体核酸分子包含在原生质体转化中以用作模板分子以将所需序列引入crispr靶位点处或附近。
[0288]
从生长室中生长在magenta盒中的tn90烟叶中分离烟草原生质体。将来自3-4周龄植物的充分展开的叶(5cm)从叶的中部切成0.5-1mm的叶条。通过浸渍叶条的两侧，将叶条转移到制备的酶溶液(1％纤维素酶r10，0.25％浸解酶r10，0.4m甘露醇，20mm kcl，20mm mes(ph5.7)，10mm cacl2，0.1％bsa)中。使用干燥器将叶条在黑暗中真空渗透30分钟，在黑暗中继续消化4小时至在室温下过夜而不摇动。将原生质体在100μm尼龙过滤器中过滤并用3ml lymphoprep纯化。将原生质体离心并用w5n溶液(154mm nacl，125mm cacl2，5mm kcl，2mm mes，991mg/l ph5.7的葡萄糖)洗涤并以5
×
105/ml的浓度悬浮于w5n溶液中。将原生质体保持在冰上30分钟以通过重力沉降在管的底部。转移w5n溶液并在室温下将原生质体重悬浮于p2溶液中。将50μl dna(10-20μg质粒)，500μl原生质体(2
×
105原生质体)和550μl peg溶液(40％，v/v 10ml 4gpeg4000，0.2m甘露醇，0.1m cacl2)在15ml微量离心管中轻轻混合，并将混合物在室温下温育5分钟。
[0289]
将原生质体沉淀并用1ml 2x 8en1(8en1:ms盐(不含nh4no3，ms维生素，0.2％肌醇，4mm mes，1mg/l naa，1mg/l iaa，0.5m甘露醇，0.5mg/l bap，1.5％蔗糖)重新悬浮。转化的原生质体用等量的低分子量琼脂糖(lma)胶化，并滴加0.2ml原生质体-lam形成珠。将10ml8en1加入珠中，在7天内取出5ml 8en1并加入5ml 8en2(具有0.25m甘露醇的8en1)；再过7天(14天)后，取出10ml 8en2并加入10ml8en2；在另一个7天(21天)中，取出5ml 8en2并加入5ml 8en3(具有3％蔗糖且不含甘露醇的8en1)；再过7天(28天)后，取出10ml 8en3并加入10ml 8en3。将原生质体保持两周直到微愈伤组织生长。将愈伤组织转移到ncm固体培养基中直至其达到约5mm(通常约两周)。将愈伤组织转移到tom-kan固体培养基中以生长枝条，并使用本文所述的方法再生转化的烟草植物。对愈伤组织或再生植物进行测试并选择
在靶基因中具有所需突变的基因编辑事件。产生功能缺失等位基因(例如，早期终止密码子或移码)或其它类型的突变(例如，功能获得或新形态)。
[0290]
实施例18：相关参考文献
[0291]
baldwin it(1989)mechanism of damage-induced alkaloid production in wild tobacco.j chem ecol 15:1661-1680
[0292]
bai y,pattanaik s,patra b,werkman jr,xie ch,yuan l(2011)flavonoid-related basic helix-loop-helix regulators,ntan1a and ntan1b,of tobacco have originated from two ancestors and are functionally active.planta 234(2):363-75
[0293]
chintapakorny,hamill jd(2007)antisense-mediated reduction in adc activity causes minor alterations in the alkaloid profile of cultured hairy roots and regenerated transgenic plants of nicotiana tabacum.phytochemistry 68:2465
–
2479
[0294]
deboer kd,dalton hl,edward fj,hamill,jd(2011)rnai-mediated downregulation of ornithine decarboxylase(odc)leads to reduced nicotine and increased anatabine levels in transgenic nicotiana tabacum l.phytochemistry 72:344
–
355
[0295]
deboer kd,dalton hl,edward fj,ryan sm,hamill,jd(2013)rnai-mediated down-regulation of ornithine decarboxylase(odc)impedes wound-stress stimulation of anabasine synthesis in nicotiana glauca.phytochemistry 86:21
–
28
[0296]
dewey re,xie j(2013)molecular genetics of alkaloid biosynthesis in nicotiana tabacum.phytochemistry 94:10
–
27
[0297]
gray jc,kung sd,wildman sg,sheen sj(1974)origin of nicotiana tabacum l.detected by polypeptide composition of fraction i protein.nature 252,226
[0298]
henry jb,vann mc,lewis rs(2019)agronomic practices affecting nicotine concentration in flue-cured tobacco:a review.agronomy journal 111:1-9
[0299]
kajikawa m,sierro n,kawaguchi h,bakaher n,ivanov nv,hashimoto t,shoji t(2017)genomic insights into the evolution of the nicotine biosynthesis pathway in tobacco.plant physiol 174(2):999-1011
[0300]
kirst h,shen yx,vamvaka e,betterle n,xu dm,warek u,strickland ja,melis a(2018)downregulation of the cpsrp43 gene expression confers a truncated light-harvesting antenna(tla)and enhances biomass and leaf-to-stem ratio in nicotiana tabacum canopies.planta 248:139
–
154
[0301]
kung sd,sakano k,gray jc,wildman sg(1975)the evolution of fraction i protein during the origin of a new species of nicotiana.j mol evol.7(1):59-64
[0302]
leete e(1977)biosynthesis and metabolism of the tobacco alkaloids.proc.am.chem.soc.symp.173:365-388
[0303]
moghbel n,ryu b,ratsch,a,steadman kj(2017)nicotine alkaloid levels,
and nicotine to nornicotine conversion,in australian nicotiana species used as chewing tobacco.heliyon 3(11),e00469
[0304]
murashige t,skoog f(1962)a revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.physiol plant 15:473-497
[0305]
patra b,schluttenhofer c,wu y,pattanaik s,yuan l(2013)transcriptional regulation of secondary metabolite biosynthesis in plants.biochim biophys acta 1829(11):1236-1247
[0306]
patel rk,patel jb,trivedi pd(2015)spectrophotometric method for the estimation of total alkaloids in the tinospora cordifolia m.and its herbal formulations.int j pharm pharm sci 7:249
–
251
[0307]
payyavula rs,navarre da,kuhl jc,pantoja a,pillai ss(2012)differential effects of environment on potato phenylpropanoid and carotenoid expression.bmc plant biol.12:39.doi:10.1186/1471-2229-12-39.
[0308]
payyavula rs,navarre da,kuhl j,pantoja a(2013)developmental effects on phenolic,flavonol,anthocyanin,and carotenoid metabolites and gene expression in potatoes.j agric food chem.61(30):7357-7365
[0309]
saitoh f,nona m,kawashima n(1985)the alkaloid contents of sixty nicotiana species.phytochemistry 24:477
–
480f
[0310]
singh sk,wu,y ghosh js,pattanaik s,fisher c,wangy,lawson d,yuan l(2015)rna-sequencing reveals global transcriptomic changes in nicotiana tabacum responding to topping and treatment of axillary-shoot control chemicals.scientific reports 5:18148
[0311]
sisson va,severson rf(1990)alkaloid composition of the nicotiana species.beitr.tabakforsch 14:327
–
339
[0312]
tayoub g,sulaiman h,alorfi m(2015)determination of nicotine levels in the leaves of some nicotiana tabacum varieties cultivated in syria herba pol 61(4):23-30
[0313]
tso tc,jeffrey rn(1961)biochemical studies on tobacco alkaloids.iv.the dynamic state of nicotine supplied to n.rustica.arch biochem biophys 92:253-256
[0314]
waller gr,nowacki ek(1978)alkaloid biology and metabolism in plants.plenum press,new york.