抗CD19抗体和多特异性结合蛋白的制作方法

本发明涉及抗cd19抗体和结合cd19、cd3和任选的血清白蛋白的多特异性结合蛋白。此外，本发明涉及包含这些抗体或多特异性结合蛋白的药物组合物、用于制备这些抗体或多特异性结合蛋白的表达载体和宿主细胞，以及使用这些抗体或多特异性结合蛋白治疗癌症的方法。

背景技术：

1、双特异性分子如(双特异性t细胞衔接器)构建体是由两个灵活连接的抗体衍生的结合结构域制成的重组蛋白构建体。构建体的一个结合结构域特异于靶细胞上选定的肿瘤相关表面抗原，第二个结合结构域特异于cd3，即t细胞上t细胞受体复合物的亚基。通过这种设计，构建体可以将t细胞与靶细胞瞬时连接，同时有效地激活t细胞对靶细胞的固有溶细胞潜能。

2、cd3受体复合物是由四条多肽链组成的蛋白质复合物。在哺乳动物中，该复合物包含一条cd3γ(gamma)链、一条cd3δ(delta)链和两条cd3ε(epsilon)链。cd3γ(gamma)、cd3δ(delta)和cd3ε(epsilon)链是高度相关的免疫球蛋白超家族的细胞表面蛋白，包含单个细胞外免疫球蛋白结构域。这些链与t细胞受体(tcr)结合形成tcr-cd3复合物，并在抗原结合后在t淋巴细胞中生成激活信号。约95％的t细胞表达αβtcr，其含有α(alpha)链和β(beta)链。两条tcrξ(zeta)链也存在于tcr-cd3复合物中。αβtcr负责识别主要组织相容性复合体(mhc)呈递的抗原。当tcr与抗原肽和mhc复合体结合时，t淋巴细胞通过由相关酶、共受体、特化衔接分子和激活或释放的转录因子介导的一系列生化事件而激活。

3、cd19，也称为b细胞表面抗原b4或leu-12，是在b淋巴细胞和滤泡树突细胞上表达的跨膜蛋白。cd19是b淋巴细胞上b细胞抗原受体复合物的共受体(参见carter等人(2002)science,256:105-07；van zelm等人(2006)n.eng.j.med.,354:1901-12)。cd19与b细胞受体(bcr)共同调节对b细胞克隆扩增和体液免疫至关重要的内在和抗原受体诱导的信号传导阈值。cd19是人b细胞表面标志物，从前b细胞发育的早期阶段直到终末分化为浆细胞均有表达。其也在许多非霍奇金淋巴瘤(nhl)细胞和某些白血病上表达。已经开发了结合cd19的抗体，并在针对淋巴起源的癌症如b细胞恶性肿瘤的临床研究中进行了测试(参见，例如，hekman等人(1991)cancer immunol.immunother.,32:364-72；vlasfeld等人(1995)cancerimmunol.immunother.,40:37-47；corny等人(1995)j.immunother.emphasis tumorimmunol.,18:231-41；以及manzke等人(2001)int.j.cancer，91：516-22)。此外，名为博纳吐单抗(blinatumomab)的构建体已被开发用于临床。

4、据信构建体会从机体中快速清除。因此，虽然它们能够快速渗透机体的许多区域，并且快速产生且易于处理，但它们的体内应用可能会受到它们在体内的短暂持久性的限制。由于博纳吐单抗和索利托单抗(solitomab)的短的体内半衰期，可能需要通过连续静脉内输注延长施用来实现其治疗效果。然而，这样的连续静脉内输注对患者来说是不方便的并且可能增加治疗成本。

5、尽管在构建抗cd19抗体和多特异性结合蛋白方面取得了重大进展，但仍然需要具有足够治疗功效、易于制备的形式和有利的药代动力学特性如更长的半衰期的新型有用蛋白用于治疗癌症。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明部分基于结合cd19的新型抗体的开发。还提供了多特异性结合蛋白，其包含结合cd19(例如，人cd19)的第一结构域、结合cd3(例如，人cd3)的第二结构域和任选的半衰期延长结构域，其可以是结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的第三结构域，其中第一结构域衍生自这些新型抗体。这些结构域以特定方式连接以获得有利的治疗功效和体内半衰期。抗cd19抗体和多特异性结合蛋白可用于治疗与表达cd19的异常细胞相关的疾病和病症，如某些b细胞血液系统恶性肿瘤。

2、相应地，在一方面，本公开提供了一种多特异性结合蛋白，其包含：(a)以5pm至1nm范围内的kd结合人cd19的第一抗原结合位点；和(b)以0.5nm至20nm范围内的kd结合人cd3的第二抗原结合位点。

3、在某些实施方案中，多特异性结合蛋白是包含第一和第二抗原结合位点的融合蛋白。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白进一步包含半衰期延长结构域。在某些实施方案中，半衰期延长结构域包含结合人血清白蛋白的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，半衰期延长结构域不位于多肽链中的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点之间。

4、在某些实施方案中，每个kd通过表面等离子共振测量。在某些实施方案中，第一抗原结合位点以5pm至0.1nm范围内的kd结合人cd19，并且第二抗原结合位点以0.5nm至10nm范围内的kd结合人cd3。在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合人cd3的kd与第一抗原结合位点结合人cd19的kd的比值在10:1至1,000:1的范围内。

5、在某些实施方案中，每个kd通过生物层干涉法测量。在某些实施方案中，第一抗原结合位点以50pm至1nm范围内的kd结合人cd19，并且第二抗原结合位点以1nm至20nm范围内的kd结合人cd3。在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合人cd3的kd与第一抗原结合位点结合人cd19的kd的比值在10:1至100:1的范围内。

6、在另一方面，本公开提供了结合人cd19的抗原结合位点，该抗体包含含有互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3的重链可变结构域(vh)和含有互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3的轻链可变结构域(vl)，其中hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含分别为seq idno:110、111、113、114、115和71的氨基酸序列，但不包含分别为seq id no:93、87、68、80、70和71的氨基酸序列。

7、在某些实施方案中，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含分别为seq idno:110、117、119、114、120和71的氨基酸序列，但不包含分别为93、87、68、80、70和71的氨基酸序列。在某些实施方案中，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含分别为seq idno:65、66、68、69、70和71的氨基酸序列。在某些实施方案中，vh包含与seq id no:62至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且vl包含与seq id no:63至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含seq id no:72的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点以低于或等于1nm的kd结合人cd19。

8、在另一方面，本公开提供了结合人cd19的抗原结合位点，该抗体包含含有互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3的vh和含有互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3的vl，其中hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含分别为seq id no:53、54、56、57、58和59的氨基酸序列，但不包含分别为seq id no:4、23、17、18、19和10的氨基酸序列。在某些实施方案中，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含分别为seq id no:53、54、56、57、60和59的氨基酸序列，但不包含分别为seq id no:4、23、17、18、19和10的氨基酸序列。在某些实施方案中，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含分别为seq id no:53、61、56、57、60和59的氨基酸序列，但不包含分别为seq id no:4、23、17、18、19和10的氨基酸序列。在某些实施方案中，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含分别为seq id no:4、5、7、8、9和10的氨基酸序列。在某些实施方案中，vh包含与seq id no:1至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且vl包含与seq id no:2至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含seq id no:11的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点以低于或等于0.3nm的kd结合人cd19。

9、在另一方面，本公开提供了一种抗体，其包含如本文公开的结合cd19的抗原结合位点。

10、在另一方面，本公开提供了一种多特异性结合蛋白，其包含：(a)如本文所公开的结合人cd19的第一抗原结合位点；和(b)结合人cd3的第二抗原结合位点。

11、在某些实施方案中，多特异性结合蛋白进一步包含半衰期延长结构域。在某些实施方案中，半衰期延长结构域包含结合人血清白蛋白的第三抗原结合位点。

12、在某些实施方案中，第三抗原结合位点包含含有互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3的vh，其中hcdr1、hcdr2和hcdr3包含分别为seq id no:184、409和411的氨基酸序列，但不包含分别为seq id no:129、133和135的氨基酸序列。

13、在某些实施方案中，第三抗原结合位点的hcdr1、hcdr2和hcdr3包含分别为seq idno:184、185和187的氨基酸序列，但不包含分别为seq id no:129、133和135的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三抗原结合位点的hcdr1、hcdr2和hcdr3包含分别为seq id no:189、190和192的氨基酸序列，但不包含分别为seq id no:129、133和135的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三抗原结合位点的hcdr1、hcdr2和hcdr3包含分别为seq id no:189、193和195的氨基酸序列，但不包含分别为seq id no:129、133和135的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三抗原结合位点的hcdr1、hcdr2和hcdr3包含分别为seq id no:123、124和126的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三抗原结合位点的vh包含与seq id no:121至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三抗原结合位点以低于或等于10nm的kd结合人血清白蛋白。在某些实施方案中，第三抗原结合位点以低于或等于2nm的kd结合蛋白a。在某些实施方案中，第三抗原结合位点具有高于或等于60℃的解链温度。

14、在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含单条多肽链。在某些实施方案中，第三抗原结合位点不位于多肽链中的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点之间。

15、在某些实施方案中，第三抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点和第二抗原结合位点的n端。在某些实施方案中，第三抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点的n端，并且第一抗原结合位点位于多肽链中第二抗原结合位点的n端。在某些实施方案中，第三抗原结合位点位于多肽链中第二抗原结合位点的n端，并且第二抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点的n端。

16、在某些实施方案中，第三抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点和第二抗原结合位点的c端。在某些实施方案中，第一抗原结合位点位于多肽链中第二抗原结合位点的n端，并且第二抗原结合位点位于多肽链中第三抗原结合位点的n端。在某些实施方案中，第二抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点的n端，并且第一抗原结合位点位于多肽链中第三抗原结合位点的n端。

17、在某些实施方案中，第一抗原结合位点位于多肽链中第三抗原结合位点的n端，并且第三抗原结合位点位于多肽链中第二抗原结合位点的n端。在其他实施方案中，第二抗原结合位点位于多肽链中第三抗原结合位点的n端，并且第三抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点的n端结合蛋白。

18、在某些实施方案中，第一抗原结合位点包含单链可变片段(scfv)。在某些实施方案中，第三抗原结合位点包含单结构域抗体(sdab)。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含scfv。

19、在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合人cd3ε。在某些实施方案中，第二抗原结合位点以1-100nm范围内的kd结合人cd3ε。

20、在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3的vh和含有互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3的vl，其中hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含分别由seq id no:415、416、418、419、420和421所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，vh包含与seq id no:412至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且vl包含与seq id no:413至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含seq id no:422或423的氨基酸序列。

21、在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3的vh和含有互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3的vl，其中hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含分别由seq id no:415、416、426、419、420和421所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，vh包含与seq id no:424至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且vl包含与seq id no:413至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含seq id no:427或428的氨基酸序列。

22、在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3的vh和含有互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3的vl，其中hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含分别由seq id no:415、431、418、419、420和432所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，vh包含与seq id no:429至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且vl包含与seq id no:430至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含seq id no:433或434的氨基酸序列。

23、在某些实施方案中，至少两个相邻的抗原结合位点通过肽接头连接。在某些实施方案中，每个相邻的抗原结合位点通过肽接头连接。在某些实施方案中，肽接头包含seq idno:298、299或302的氨基酸序列。在某些实施方案中，肽接头由seq id no:298、299或302的氨基酸序列组成。

24、在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含选自seq id no:694-710的氨基酸序列。

25、在某些实施方案中，多特异性结合蛋白不包含抗体fc区。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的分子量为至少65kd。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的血清半衰期为至少24、36、48或60小时。

26、在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含：(a)本文公开的多特异性结合蛋白或抗体；和(b)药学上可接受的载剂。

27、本公开还提供了编码本文公开的多特异性结合蛋白或抗体的分离的多核苷酸。此外，本公开提供了包含本文公开的多核苷酸的载体，以及包含本文公开的多核苷酸或载体的重组宿主细胞。

28、本公开还提供了产生多特异性结合蛋白或抗体的方法，该方法包括在允许多特异性结合蛋白或抗体表达的合适条件下培养本文公开的宿主细胞。在某些实施方案中，该方法进一步包括分离多特异性结合蛋白或抗体。在某些实施方案中，该方法进一步包括将分离的多特异性结合蛋白或抗体与药学上可接受的载剂共同配制。

29、此外，本公开提供了刺激针对表达cd19的细胞的免疫应答的方法，该方法包括将所述细胞和t淋巴细胞暴露于本文公开的多特异性结合蛋白、抗体或药物组合物。

30、本公开还提供了在有需要的受试者中治疗血液癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的多特异性结合蛋白、抗体或药物组合物。在某些实施方案中，血液癌症是b细胞血液系统恶性肿瘤。

31、此外，本公开提供了一种复合物，其包含表达cd3的t细胞、表达cd19的b细胞和本文公开的多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白同时结合t细胞和b细胞。在某些实施方案中，复合物进一步包含血清白蛋白。