本发明涉及一种生防菌株、制剂及其应用，特别是涉及一种用于防治花生褐斑病的解淀粉芽孢杆菌及应用，属于有益生防菌株制成的生防制剂技术领域。
背景技术：
花生(arachishypogaeal.)，蔷薇目蝶形花亚科落花生属一年生草本植物。作为重要的油料作物，其种植范围已经遍及全球100多个国家和地区。我国种植花生历史悠久，是世界上种植面积和产量最多的国家之一。我国是世界花生种植第一大国，种植面积大7500多万亩，产量大1700万吨，占世界中产量的约40％，其产值达1200亿元，居全国农作物的第四位。辽宁是花生种植大省，近几年，辽宁花生年均播种面积约530万亩，跃居全国第三位；年均总产114万吨，排在全国第四位。辽宁是花生种植大省，目前已成为继玉米和水稻之后的第三大种植作物。辽宁花生因品质好、口感佳、且不含黄曲霉毒素，享誉国内外。
花生褐斑病(cercosporaarachidicolahori)，又称早斑病，是全球范围内各花生产区发生与危害最重的叶部病害之一。花生褐斑病病原菌无性世代为cercosporaarachidicolahori，属半知菌亚门，丛梗孢目，尾孢菌属；有性世代为mycosphaerellaarachidis(hori)jenkins，属子囊菌亚门，座囊菌目，球腔菌属。该病主要发生在花生生育前期和中期，主要危害叶片。感染病害的花生，叶片布满病斑，光合作用面积锐减，叶绿素受到破坏，光合作用效能下降，植株生物产量大幅降低。随着大量病斑的产生而引起早期落叶，严重影响干物质积累、荚果饱满度和成熟度，空瘪果壳率增加。受害花生田一般减产10％～20％，严重时可达40％以上，是生产上亟待解决的问题。
目前，防治该病的最主要的措施仍然是使用化学农药，但长期频繁使用杀菌剂导致病原菌产生抗药性，农产品中农药残留超标和环境污染等一系列严峻问题，降低了花生品质，影响了人类健康，制约了花生产业的可持续发展。因此，人们亟待能有一种能防治花生褐斑病生防制剂的出现。
生防菌用于防治植物病害在生产中越来越受重视，具有对人畜和农作物安全，对于天敌和有益的生物都没有危害且环保，但是不同生防菌对植物表面的定殖能力不同，尤其是花生叶片具有光滑的表面使生物菌难以附着，同时花生真叶有“感夜运动”的特性，即日落或阴天后就会闭合，叶柄下垂，早晚阳光斜照，叶片竖起，因此生物菌需要快速附着在叶片、并在花生叶片正常生长状态发挥对病菌的防治作用。
目前的防治花生褐斑病的生物菌剂在花生叶片上的附着差，定殖慢，受花生叶片运动或雨水冲刷影响大，防治作用不稳定，造成防治效果低。因此，如何通过制备菌剂和调整施用方法获得叶片附着力强、定殖快的生防菌剂是目前花生种植中防治要解决的问题。
技术实现要素：
为了弥补上述现有技术的不同，本发明的目的是提出一种用于防治花生褐斑病的解淀粉芽孢杆菌及应用，所述解淀粉芽孢杆菌及菌剂对植物本身、环境及人畜安全，且其在发酵、生产加工及使用过程中均不产生有害物质，无毒副作用，同时该菌剂配方和施用方法提高了解淀粉芽孢杆菌在花生叶片上附着力和定殖速度，明显提高了防治效果。
本发明提出一种用于防治花生褐斑病的解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号为cgmccno.18748，保藏日期2019年10月28日，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)。
所述解淀粉芽孢杆菌的培养性状为：na培养基平板上，菌落形状呈乳白色圆形或近似圆形，菌落扁平，表面干燥粗糙有褶皱，边缘呈锯齿状，革兰氏染色呈阳性。生理生化反应中，淀粉水解试验、明胶液化试验、氧化酶反应、v-p反应、接触酶反应、硝酸盐还原反应等试验呈阳性；甲基红试验、h2s反应、吲哚试验为阴性；具有一定耐盐性，可以在≤10％的nacl培养基中可以正常生长。
本发明还提出一种用于防治花生褐斑病的解淀粉芽孢杆菌的生防菌剂制备方法，其技术要点是，包括以下步骤：
(1)活化解淀粉芽孢杆菌菌株
采用lb培养基进行解淀粉芽孢杆菌菌株活化培养，培养温度25-30℃，培养3d；所述lb培养基配方如下：蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠5g/l、琼脂粉12～15g/l、ph7.2～7.4；
(2)制备生防菌剂原液
配制母液：活化后的解淀粉芽孢杆菌，接于nb培养液中，25℃，150rpm震荡培养2d，配制成浓度为1-9×1010cfu/ml的孢子悬浮液，即为母液；所述nb培养液配方为：蛋白胨10g/l，牛肉膏3g/l，氯化钠5g/l，ph7.2～7.4；
(3)发酵培养
将上述母液加入发酵培养基中发酵培养；
所述发酵培养基配方为：花生粉20g/l，花生叶片(干)粉10g/l，蔗糖7.5g/l，牛肉膏3g/l，磷酸氢二钾5g/l，水ph7.2～7.4；
所述母液与发酵培养基100ml(v:v＝1:19)，置于250ml三角瓶中，发酵温度25℃，150rpm振荡发酵培养5d，获得生防菌剂原液；所述生防菌剂原液的孢子浓度为1-9×1010cfu/ml；
(4)制备生防菌剂
将原液稀释100-200倍，获得生防菌剂，所述生防菌剂的解淀粉芽孢杆菌孢子浓度为108～109cfu/ml。
本发明还提出所述解淀粉芽孢杆菌的生防菌剂的应用方法，其技术要点是：包括预防应用方法和治疗应用方法，所述预防应用方法为：在花生褐斑病发病前喷施孢子浓度为108～109cfu/ml的生防菌剂；治疗应用方法为：在花生发病初期喷施孢子浓度为108-109cfu/ml的生防菌剂。
进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌的生防菌剂与多菌灵混合制备得到解淀粉芽孢杆菌·多菌灵混剂，所述解淀粉芽孢杆菌的·多菌灵混剂中，所述解淀粉芽孢杆菌孢子浓度为108-109cfu/ml，所述多菌灵的有效成分量为400-600mg/kg。
进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌的生防菌剂与鱼蛋白有机肥混合制备得到解淀粉芽孢杆菌·鱼蛋白混剂，所述解淀粉芽孢杆菌·鱼蛋白混剂中解淀粉芽孢杆菌孢子浓度为108-109cfu/ml，所述鱼蛋白有机肥的有效浓度为：1-1.5g/l。
进一步的，所述花生叶片(干)粉的制备方法为：将花生叶子摘下，用清水冲洗后烘干，用粉碎机对干叶进行打粉，过100目筛，将花生叶干粉装袋，置于干燥器中保存备用。
进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌·鱼蛋白混剂用于降低花生褐斑病病原菌对多菌灵，戊唑醇，代森锰锌的抗药性。
本发明与现有技术相比，其有益效果是：
(1)生防菌株解淀粉芽孢杆菌来源于花生叶片，对植物本身、环境及人畜都是安全的，不会像一部分农药那样有剧毒性，且其在发酵、生产加工及使用过程中均不产生有害物质，无毒副作用。
(2)生防菌株发酵后的生防菌剂增强了解淀粉芽孢杆菌在叶片上的附着和定殖，对花生褐斑病有良好的防治效果；
(3)在田间防治花生褐斑病防治上，解淀粉芽孢杆菌·多菌灵混剂和解淀粉芽孢杆菌·鱼蛋白混剂具有优异的防治作用，应用前景广阔。
具体实施方式
实施例1
(1)生防菌的活化
所述生防菌株为解淀粉芽孢杆菌，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmccno.18748，保藏日期2019年10月28日，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)。
本实施例中所述解淀粉芽孢杆菌标记为tl-6，所述tl-6从花生叶片上分离获得，tl-6菌株na培养基平板上，菌落形状呈乳白色圆形或近似圆形，菌落扁平，表面干燥粗糙有褶皱，边缘呈锯齿状，革兰氏染色呈阳性。生理生化反应中，淀粉水解试验、明胶液化试验、氧化酶反应、v-p反应、接触酶反应、硝酸盐还原反应等试验呈阳性；甲基红试验、h2s反应、吲哚试验为阴性；具有一定耐盐性，可以在≤10％的nacl培养基中可以正常生长。经形态特征观察、生理生化反应及对其16srdna序列测定后与genbank比对与解淀粉芽孢杆菌相似性100％，定名为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)。
采用lb培养基活化培养，培养温度25-30℃，培养3d；所述lb培养基配方如下：蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠5g/l、琼脂粉12-15g/l、ph7.2-7.4。
(2)生防菌剂原液的制备
刮取活化后的解淀粉芽孢杆菌tl6，接于装有100mlnb培养液(蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化钠5g/l、ph7.2-7.4)的250ml三角瓶中，25℃，150rpm震荡培养2d，配制成浓度为1～9×1010cfu/ml的孢子悬浮液，即为母液。
(3)发酵培养
所述生防菌剂的发酵培养基配方为：花生粉20g/l，花生叶片(干)粉10g/l，蔗糖7.5g/l，牛肉膏3g/l，磷酸氢二钾5g/l，ph7.2-7.4，所述母液与发酵培养基100ml(v:v＝1:19)，置于250ml三角瓶中，发酵温度25℃，150rpm振荡发酵培养5d，获得生防菌剂原液。
所述花生叶片(干)粉的制备方法为：将花生叶子摘下，用清水冲洗后烘干，用粉碎机对干叶进行打粉，过100目筛，将花生叶干粉装袋，置于干燥器中保存备用。
(3)生防菌剂的制备
将原液稀释为100-200倍，获得生防菌剂，所述生防菌剂的解淀粉芽孢杆菌孢子浓度为108-109cfu/ml。
实施例2室内离体防治花生褐斑病效果评价
(1)供试靶标
利用离体叶片进行室内防效试验；
(2)试验处理
设计5个不同处理，每个处理4次重复。
处理1：先喷布花生褐斑病菌孢子悬浮液，24h后喷布含有解淀粉芽孢杆菌tl6的生物菌剂(治疗应用)，生防菌剂的孢子浓度为1-9×1010cfu/ml；
处理2：先喷布含有解淀粉芽孢杆菌tl6的生物菌剂，24h后喷布花生褐斑病菌孢子悬浮液(预防应用)，生防菌剂的孢子浓度为1-9×1010cfu/ml；
处理3：只喷布花生褐斑病菌孢子囊悬浮液。
每个处理30片叶片，3次重复，接种花生褐斑病菌孢子浓度为105个/ml。试验参照农业部药检所田间药效试验准则(二)第85部分：杀菌剂防治花生叶斑病分级标准进行调查，计算病情指数，7d后调查发病情况。
(3)试验结果
结果见表1，处理1防效为83.71％，处理2防效为88.12％，预防效果显著高于治疗效果。处理1和处理2的病情指数明显低于对照，解淀粉芽孢杆菌tl6的生物菌剂对花生褐斑病均有优异的防治作用。
表1tl6对花生褐斑病离体叶片防控效果
实施例3田间防治花生褐斑病效果评价
(1)试验地点为辽宁省农业科学院花生试验田。
(2)试验处理
处理1tl6：生防菌剂原液，所述原液解淀粉芽孢杆菌浓度为1-9×1010cfu/ml；
处理2tl6：生防菌剂原液10倍稀释液，；
处理3tl6：生防菌剂原液100倍稀释液，；
处理4tl6：生防菌剂原液200倍稀释液；
处理5：普利登鱼蛋白有机肥(普利登农业科技(南京)有限公司)600倍液；
处理6：50％多菌灵悬浮剂(江苏龙灯化学有限公司)：1000倍液。
处理7：清水对照
处理时期：为花生褐斑病发病初期。
(3)试验结果
调查结果见表2。解淀粉芽孢杆菌tl6生防菌剂对花生褐斑病均有较好的防治效果。在花生褐斑病防治上，本发明的tl6发酵原液防效达到69.17％以上，与50％多菌灵悬浮剂1000倍的防治效果差异不显著。
表2tl6对花生褐斑病田间防治效果
实施例4混剂处理
(1)试验地点
试验地点为辽宁省农业科学院花生试验田。
(2)试验处理
处理1：普利登鱼蛋白有机肥+tl6生防菌剂，用生防菌剂原液200倍稀释液配制普利登鱼蛋白有机肥800倍液。
处理2：50％多菌灵悬浮剂+tl6生防菌剂，用生防菌剂原液200倍稀释液配制50％多菌灵悬浮剂1000倍液。
处理3：生防菌剂原液200倍稀释液；
处理4：普利登鱼蛋白有机肥稀释800倍液；
处理5：50％多菌灵悬浮剂1000倍液；
处理6：清水对照。
处理时期：为花生褐斑病发病初期。
(3)试验结果
调查结果见表2。解淀粉芽孢杆菌tl6200倍液+普利登鱼蛋白有机肥800倍液复配和解淀粉芽孢杆菌tl6+50％多菌灵悬浮剂复配对花生褐斑病有较好的防治效果。在花生褐斑病防治上，两种配方对花生褐斑病的田间防治效果分别为83.78％和80.83％，表现出良好的增效作用，此外应用时两种配方可交替使用。
表3tl6复配配方对花生褐斑病田间防治效果
实施例5解淀粉芽孢杆菌发酵方法对防治花生褐斑病作用的影响
(1)试验地点
试验地点为辽宁省农业科学院花生试验田。
(2)试验处理
处理1：tl6生防菌剂原液100倍稀释液，制备方法见实施例1；
处理2：tl6生防菌剂原液200倍稀释液；制备方法见实施例1；
处理3：tl6菌剂原液100倍稀释液；所述tl6菌剂的活化菌株、母液配制同实施例1，
发酵培养如下：生防菌剂的发酵培养基配方为：马铃薯200g/l，蔗糖7.5g/l，牛肉膏3g/l，磷酸氢二钾5g/l，ph7.2～7.4，取5ml母液接种至装有95ml的250ml发酵培养基的三角瓶中，发酵温度25℃，150rpm振荡发酵培养5d，获得生防菌剂原液。
处理4：tl6菌剂原液200倍稀释液；tl6菌剂原液制备同处理3；
处理5：清水对照
处理时期：为花生褐斑病发病初期。
(3)试验结果
调查结果见表2，试验结果表明，发酵培养基中采用花生粉和花生叶片粉末特殊配方，解淀粉芽孢杆菌tl6在发酵后对花生褐斑病的防治效果明显高于通过常规培养基发酵后的防治效果，即发酵液中的花生粉和花生叶片粉末可以提高解淀粉芽孢杆菌tl6的活性。田间花生叶片具有特殊的运动特性，叶片常处于倾斜状态，生物菌本身作用起效较慢，因此，稳定的附着和定殖对于生物菌剂能够发挥作用具有重要的意义。配方中加入花生粉和花生叶片粉末的发酵培养基有助于解淀粉芽孢杆菌tl6在叶片上保持活性，从而增强了在叶片上的附着和定殖从而对花生褐斑病有良好的防治效果。
表4tl6不同发酵培养基对花生褐斑病的田间防治效果的影响
实施例6普利登鱼蛋白有机肥+tl6生防菌剂降低病原菌对多种药剂抗药性作用。
(1)试验地点
试验地点为辽宁省农业科学院花生试验田，病菌来源为接种。
(2)试验处理
处理1：50％多菌灵悬浮剂1000倍液，每隔10天施用一次，施用4次；
处理2：43％戊唑醇悬浮剂3000倍，液每隔10天施用一次，施用4次；
处理3：80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液，每隔10天施用一次，施用4次；
处理4：普利登鱼蛋白有机肥800倍液+tl6生防菌剂100倍液，50％多菌灵悬浮剂1000倍液交替使用各2次；
处理5：普利登鱼蛋白有机肥800倍液+tl6生防菌剂100倍液，43％戊唑醇悬浮剂3000倍交替使用各2次；
处理6：普利登鱼蛋白有机肥800倍液+tl6生防菌剂100倍液，80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液交替使用各2次；
处理7：普利登鱼蛋白有机肥800倍液+tl6生防菌剂100倍液，每隔10天施用一次，施用4次；
处理8：清水对照。
处理时期：为花生褐斑病发病初期；分别在各处理最后一次施药7天后采集病叶并培养各处理的花生褐斑病病原菌孢子，采用病斑分生孢子直接测定法测定不同处理的花生褐斑病病原菌的抗药性，分别测定在多菌灵、戊唑醇、代森锰锌处理浓度下孢子萌芽的情况；多菌灵、戊唑醇、代森锰锌处理浓度参照：刘勇等，花生褐斑病菌对多菌灵抗药性测试方法的研究，中国油料，1991，第4期，67-70；戊唑醇、代森锰锌处理浓度同多菌灵。
调查方法参照：魏蕾，采用孢子萌发法检测蔬菜灰霉病菌的抗药性，北京农业科学，19-21。
(3)试验结果
调查结果见表5，结果表明，采用普利登鱼蛋白有机肥+tl6生防菌剂与多菌灵、戊唑醇、代森锰锌交替施用，明显的减缓了花生褐斑病菌对上述单剂的抗药性的产生，有助于目前花生褐斑病的田间药剂防治有效时期。
表5tl6复配配方对花生褐斑病田间防治效果