一种双歧杆菌的选择性分离培养基的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种利用木聚糖作为主要碳源的选择性分离培养双歧杆菌的培养基。


背景技术：

2.双歧杆菌(bifidobacterium)是属于放线菌门的革兰氏阳性，严格厌氧，糖分解细菌。双歧杆菌代表了一个重要的共生群体，是肠道的第一批微生物定殖者。而越来越多的研究表明双歧杆菌与人体健康存在密切的联系，同时双歧杆菌也是目前公认的益生菌，具有很高的商业价值。早在1899年tissier就首次从母乳喂养的婴儿粪便中分离出双歧杆菌，此后，双歧杆菌从一系列不同的生态环境中分离出来，如口腔、昆虫肠道以及各种哺乳动物的胃肠道。
3.gam培养基，是由不同营养物质组合配制而成的营养基质，含有碳水化合物、含氮物质、无机盐、维生素和水等几大类物质，适用于厌氧菌的培养。在传统的gam培养基中，双歧杆菌生长的同时也有许多杂菌的生长，杂菌长势甚至优于双歧杆菌。因此，不利于从样本中筛选分离双歧杆菌，寻求一种双歧杆菌的选择性分离培养基，在能提供双歧杆菌必须营养物质的同时，还能抑制其他微生物的生长。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种双歧杆菌的选择性分离培养基，本发明培养是在gam培养基的基础上，以木聚糖作为主要碳源，将现有gam培养基中单糖改为难以降解的多糖。本发明旨在利用木聚糖作为主要碳源以促进双歧杆菌的生长同时也减少样本中其他杂菌的生长，本发明的选择分离培养基可在同一样本和同样的培养条件下更有利于双歧杆菌的生长，提高双歧杆菌的在菌落中的相对丰度。
5.为了实现本发明的目的采用以下技术方案：
6.一种双歧杆菌的选择性分离培养基，由以下质量浓度的组分组成：月示胨10.0g/l、大豆胨3g/l、酵母浸粉5g/l、牛肉浸粉2.2g/l、消化血清粉13.5g/l、牛肝浸粉1.2g/l、木聚糖1-10g/l、磷酸二氢钾2.5g/l、氯化钠3g/l、l-半胱氨酸0.3g/l、硫乙醇酸钠0.3g/l。
7.由于双歧杆菌所在的肠道中单糖是有限的，因此双歧杆菌需要拥有各种糖苷酶和糖转运蛋白来降解难消化的多糖、寡糖和复杂的碳水化合物。因此，双歧杆菌的基因组中有超过12％的注释开放阅读框被预测为编码参与碳水化合物代谢的酶；同时，双歧杆菌核心基因组中还有5.5％的序列与碳水化合物代谢有关。因此，基于双歧杆菌碳水化合物活性酶的特性，本发明设计了以难以降解的多糖作为主要碳源的选择性培养基，可在提供双歧杆菌必须营养物质的同时，还能抑制其他微生物的生长。
8.优选地，所述双歧杆菌的选择性分离培养基还包括琼脂。在本发明的培养基中加入琼脂，可制备固体平板培养基。
9.优选地，所述双歧杆菌的选择性分离培养基，由以下质量浓度的组分组成：月示胨
10.0g/l、大豆胨3g/l、酵母浸粉5g/l、牛肉浸粉2.2g/l、消化血清粉13.5g/l、牛肝浸粉1.2g/l、木聚糖2-8g/l、磷酸二氢钾2.5g/l、氯化钠3g/l、l-半胱氨酸0.3g/l、硫乙醇酸钠0.3g/l。
10.优选地，所述双歧杆菌的选择性分离培养基，由以下质量浓度的组分组成：月示胨10.0g/l、大豆胨3g/l、酵母浸粉5g/l、牛肉浸粉2.2g/l、消化血清粉13.5g/l、牛肝浸粉1.2g/l、木聚糖4g/l、磷酸二氢钾2.5g/l、氯化钠3g/l、l-半胱氨酸0.3g/l、硫乙醇酸钠0.3g/l。经大量试验验证，最终当木聚糖为4g/l时，双歧杆菌的相对丰度最高。
11.本发明还提供了一种分离双歧杆菌的方法，包括以下步骤：
12.步骤一：取新鲜的粪便样本，用生理盐水依次梯度稀释成不同浓度的稀释液；将所述稀释液均匀涂布在用权利要求1培养基制备的平板上，随后放入厌氧工作站中培养48-72h；
13.步骤二：从步骤一平板上挑取疑似双歧杆菌的单菌落，在用权利要求1培养基制备的平板上进行划线纯化，然后放入厌氧工作站培养48-72h；
14.步骤三：从步骤二划线纯化的平板上挑取疑似双歧杆菌的单菌落，再次在用权利要求1培养基制备的平板上划线进行纯化，然后放入厌氧工作站中培养48-72h；
15.步骤四：利用质谱仪从平板上挑选的单菌落进行物种鉴定。
16.优选地，所述梯度稀释的浓度分别为10-4
、10-5
和10-6
。
17.本发明的有益效果为：本发明的选择性分离培养基以木聚糖作为主要碳源，将现有gam培养基中单糖改为难以降解的多糖。本发明优化的gam培养基对双歧杆菌的选择性分离效果更好，即平板上的双歧杆菌不仅数量增多同时平板上的其他微生物种类也减少。而可培养双歧杆菌总菌数占平板上可培养微生物的总菌数的百分比可达53.95
±
1.22(传统gam为17.90
±
0.58)。
附图说明
18.图1不同碳源下门水平上微生物的相对丰度示意图
19.图2不同碳源下属水平上微生物的相对丰度示意图
20.图3不同碳源下种水平上微生物的相对丰度示意图
具体实施方式
21.为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。
22.实施例1
23.本发明获得以木聚糖作为碳源的具体过程如下：
24.从ncbi中下载得到的144条双歧杆菌全基因组，将核心基因与总基因数以及注释信息采用原核生物泛基因组自动化分析软件(pan-genomics analysis pipeline，pgap)中的mp方法来分析，再通过本地perl脚本对分析结果进行处理。同时这144条全基因组也利用在线软件dbcan-seq database进行糖苷水解酶单独注释以挖掘双歧杆菌共有的糖苷水解酶家族。而样本的宏基因组测序结果则是通过trimmomatic v0.39(bolger et al.，2014)除去带有perl脚本和低质量数据的条形码，并通过clc(qiagen,germany)除去宿主dna。然
后使用spades 3.12.0(nurk，2013)进行组装，并使用prokka 1.13.7(seemann，2014)进行注释。最后基于泛基因组分析和宏基因组分析结果选择以木聚糖作为碳源。
25.本实施例提供一种双歧杆菌的选择性分离培养基，由以下质量浓度的组分组成：月示胨10.0g/l、大豆胨3g/l、酵母浸粉5g/l、牛肉浸粉2.2g/l、消化血清粉13.5g/l、牛肝浸粉1.2g/l、木聚糖1g/l、磷酸二氢钾2.5g/l、氯化钠3g/l、l-半胱氨酸0.3g/l、硫乙醇酸钠0.3g/l。其中，本发明中的牛肉浸粉为牛肉的生物法复合蛋白酶水解物。
26.本实施例中的月示胨、大豆胨、酵母浸粉、消化血清粉、牛肝浸粉、木聚糖、磷酸二氢钾、氯化钠、l-半胱氨酸、硫乙醇酸钠均为市售产品，可从市面购买。木聚糖购自上海麦克林生化科技有限公司，其余组分原料购自广东环凯微生物科技有限公司。
27.本发明液体培养基的制备：
28.在1000ml的蒸馏水中依次加入月示胨10.0g、大豆胨3g、酵母浸粉5g、牛肉浸粉2.2g、消化血清粉13.5g、牛肝浸粉1.2g、木聚糖1g、磷酸二氢钾2.5g、氯化钠3g、l-半胱氨酸0.3g和硫乙醇酸钠0.3g，混合均匀；调节ph值至7.3
±
0.1，121℃，灭菌10min，在培养基灭菌后冷却至50℃左右时按1
‰
的添加量加入无菌浓度为0.1％的维生素k1和浓度为5mg/ml的氯化血红素。
29.本发明固体培养基的制备：
30.在1000ml的蒸馏水中依次加入月示胨10.0g、大豆胨3g、酵母浸粉5g、牛肉浸粉2.2g、消化血清粉13.5g、牛肝浸粉1.2g、木聚糖1g、磷酸二氢钾2.5g、氯化钠3g、l-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸钠0.3g和琼脂粉7g，混合均匀；调节ph值至7.3
±
0.1，121℃，灭菌10min，在培养基灭菌后冷却至50℃左右时按1
‰
的添加量加入无菌浓度为0.1％的维生素k1和浓度为5mg/ml的氯化血红素。
31.实施例2
32.实施例2与实施例1的唯一区别在于，木聚糖为2g/l。
33.实施例3
34.实施例3与实施例1的唯一区别在于，木聚糖为4g/l。
35.实施例4
36.实施例4与实施例1的唯一区别在于，木聚糖为8g/l。
37.实施例5
38.实施例5与实施例1的唯一区别在于，木聚糖为10g/l。
39.对比例1
40.对比例1采用市售的gam培养基(传统gam培养基)，其具体配方如下：
41.月示胨
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10.0g/l
42.大豆胨
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3.0g/l
43.酵母浸粉
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5.0g/l
44.牛肉浸粉
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2.2g/l
45.消化血清粉
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13.5g/l
46.牛肝浸粉
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1.2g/l
47.葡萄糖
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3.0g/l
48.磷酸二氢钾
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2.5g/l
49.氯化钠
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3.0g/l
50.l-半胱氨酸
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0.3g/l
51.硫乙醇酸钠
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0.3g/l
52.琼脂粉
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7g/l
53.ph值7.3
±
0.1 25℃，在培养基灭菌后冷却至50℃左右时按1
‰
的添加量加入无菌浓度为0.1％的维生素k1和浓度为5mg/ml的氯化血红素。
54.对比例2
55.对比例2与实施例3的唯一区别在于，以乳果糖替换木聚糖。
56.对比例3
57.对比例3与实施例3的唯一区别在于，以抗性淀粉替换木聚糖。
58.对比例4
59.对比例4与实施例3的唯一区别在于，以葡聚糖替换木聚糖。
60.效果例1
61.将实施例3与对比例1的培养基进行双歧杆菌的分离试验，验证其分离效果，具体如下：
62.从来自广东药科大学附属第一医院粪菌移植供体两例样本(s17,s20)中选择性分离双歧杆菌，步骤如下：
63.步骤一：取新鲜的粪便样本s17或s20 1g，用9ml生理盐水重悬混匀，然后再用生理盐水依次重悬至10-4
,10-5
,10-6
。取100μl的10-4
,10-5
,10-6
的稀释液均匀涂布在对比例1(gam传统培养基平板)和实施例3(gam优化培养基平板)，随后放入厌氧工作站中培养48-72h。
64.步骤二：分别从步骤一的对比例1和实施例3的平板上挑取疑似双歧杆菌的单菌落，分别在对比例1和实施例3的平板进行划线纯化，然后放入厌氧工作站培养48-72h。
65.步骤三：分别从步骤二划线纯化的平板上挑取疑似双歧杆菌的单菌落，再次分别在对比例1和实施例3的平板上划线进行纯化，然后放入厌氧工作站中培养48-72h。
66.步骤四：利用maldi-tof质谱仪分别从对比例1和实施例3平板上挑选的单菌落进行物种鉴定。
67.为了更加准确地了解培养基对粪便样本中的双歧杆菌的选择性分离培养的效果，将步骤三中所得到的涂布的平板用生理盐水使其中的菌落重悬，然后4℃，4000g/10min离心，再用3ml30％的甘油重悬，取0.5ml用于提dna剩余的分装成两管。提取的dna用于16s rdna测序，以分析平板上的微生物种类及丰富度，结果表1、图1-3所示。
68.由表1、图1-3可以明显地看到在样本s17中以木聚糖作为碳源的培养基上生长的双歧杆菌的相对丰度明显高于普通市售的gam培养基。同时木聚糖作为碳源的培养基的辛普森指数显著小于gam培养基，即菌落的多样性更少，因此平板上杂菌更少。同样的，样本s20中以木聚糖作为碳源的培养基上生长的双歧杆菌的相对丰度明显高于普通的gam培养基，同时木聚糖作为碳源的培养基的辛普森指数显著小于gam培养基。
69.表1两例样本中不同培养基可培养微生物的相对丰度
[0070][0071]
s1701：表示s17样本采用实施例3的培养基培养；s1702：表示s17样本采用对比例1的培养基培养；s2001：表示s20样本采用实施例3的培养基培养；s2002：表示s s20样本采用对比例1的培养基培养。
[0072]
效果例2
[0073]
从上述两个样本的实施例3的平板上总共挑取鉴定了76个单菌落，双歧杆菌的数量为28占总数的36.84％，如表2所示：
[0074]
表2两例样本的筛菌结果统计
[0075][0076]
效果例3
[0077]
采用实施例1～5与对比例1～4的培养基分离来自广东药科大学附属第一医院粪菌移植供体的样本(s18)中分离双歧杆菌，其结果如表3所示：
[0078]
表3不同培养基对双歧杆菌相对丰度的影响
[0079][0080][0081]
由上表可知，本发明筛选出的木聚糖作为碳源能提高双歧杆菌在菌落中的相对丰度。本发明还试用了其他种类的多糖，例如，乳果糖(对比例2)、抗性淀粉(对比例3)、葡聚糖(对比例4)但均未能实现提高双歧杆菌相对丰度的效果，因此，并不是所有的糖类都能被双歧杆菌有效利用，作为主要碳源使用。从实施例1～5中可以看出，当木聚糖的质量浓度为4g/l时，双歧杆菌的相对丰度最高，因此，实施例3为本发明的最佳实施例。
[0082]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。