一种球孢白僵菌固体培养基及其培养方法与流程

1.本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种球孢白僵菌固体培养基及其培养方法。


背景技术：

2.白僵菌是一类对害虫寄主范围广且致病性强的昆虫病原真菌，因其对天敌无害、对环境友好、适宜条件下易连续多年寄生害虫等特点，成为目前国内外研究最多应用最广的生物农药之一，已成功用于大规模防治松毛虫、玉米螟、蛴螬和大豆食心虫等多种重要的农林业害虫，有研究表明，在田间每平方米土壤以1
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孢子处理，真菌能在虫尸和土壤中的宿存，造成对下一代害虫的侵染，从而维持其在田间的持效性。
3.白僵菌的大量培养生产是满足田间应用的前提，目前，白僵菌大量培养的主要方式有液体发酵、固体发酵和液固两相发酵。白僵菌液体发酵时间短，主要产物为芽生孢子和菌丝体，但这两种产物的存活时间较短；固体发酵和液固两相发酵时间长，均可产生贮存期较长的分生孢子。现有研究与生产工艺中，固体发酵和液固两相发酵所用到的固体培养基通常选用玉米粉、大豆粉、面粉、大米粉、蚕蛹粉及蛭石、麦麸和稻谷壳等填充料，多采用两种及以上材料混合。现有技术中，培养球孢白僵菌分生孢子的发酵周期长，孢子含量不稳定。
4.基于此，需要研究并设计一种利于球孢白僵菌分生孢子大量生产、易于操作、原料简单经济、杂菌污染少的培养基及培养方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种球孢白僵菌固体培养基，该固体培养基以玉米粉、麦麸和木屑为基质，价格低廉，来源充足，大大降低了生产成本。
6.本发明的目的还在于提供一种球孢白僵菌的固体培养方法，该培养方法操作简单，发酵周期短，产孢量高，受杂菌污染少。
7.本发明的上述目的第一个可以通过以下技术方案来实现：一种球孢白僵菌固体培养基，由以下质量份配比的原料制成：玉米粉5～8、麦麸5～30、木屑5～30、水30～35。
8.优选的，各原料的质量份配比为：玉米粉5～7、麦麸7～17、木屑18～28、水31～33。
9.较佳的，各原料的质量份配比为：玉米粉5、麦麸17、木屑18、水32。
10.优选的，所述木屑的粒径为过5～10mm的网孔，可以是多种木屑，以松木屑为佳。
11.优选的，该球孢白僵菌固体培养基的其中一种制备方法如下：按上述质量份配比，称取固体培养基玉米粉、麦麸、木屑及水，拌匀，装入布袋，1个布袋装约2.5kg混合料，将所有装填好的布袋置于灭菌柜中，灭菌过程需要在灭菌柜中加入一定量的水，使得灭菌柜可以达到饱和水蒸汽，2.5kg混合袋装量料灭菌之后约有2.87kg，121～126℃和0.14mpa灭菌40～60min，冷却后待用。
12.本发明的上述目的第二个可以通过以下技术方案来实现：一种球孢白僵菌的固体
培养方法，包括如下步骤：
13.(1)制备球孢白僵菌种子液：选取球孢白僵菌试管菌种，斜面培养后，接种至液体培养基中，进行摇床震荡培养，获得球孢白僵菌种子液；
14.(2)球孢白僵菌的固体培养：将步骤(1)中的球孢白僵菌种子液接种到上述的固体培养基上，混匀后在纱网浅底木框中铺展匀开，使得固体培养基厚度在5～6cm，然后将多个纱网浅底木框叠放，并采用塑料纸密封，在20～26℃下保持密闭培养2～4d，待长满菌丝体后，将塑料纸撤下，再进行开放式培养，再培养5～7d，获得白僵菌固体培养物。
15.在该球孢白僵菌的固体培养方法中：
16.优选的，步骤(1)中所述球孢白僵菌试管菌种分离纯化自松毛虫的球孢白僵菌试管菌种，斜面培养时采用的培养基为600ml牛肉膏蛋白胨琼脂茄子瓶培养基，培养条件为20～25℃条件下培养7～10d，至球孢白僵菌分生孢子长满整个茄子瓶培养基斜面，待用。
17.优选的，步骤(1)中所述液体培养基由以下质量份配比的原料制成：玉米粉28～30、白糖10～12、水600～620，采用高压蒸汽灭菌法处理后冷却用于接种，接种后的液体培养基置于25℃，150r/min，摇床上震荡培养3～4d，至液体培养基变为粘稠状和培养容器壁出现白色黏状物，获得球孢白僵菌种子液。
18.优选的，步骤(1)中一个生长良好的600ml茄子瓶白僵菌可以接种8～10瓶(体积约为600～620ml)液体培养基。
19.优选的，步骤(2)中所述的固体培养基先装入布袋中，然后在121～126℃和0.14mpa灭菌40～60min后冷却，再接种球孢白僵菌种子液，球孢白僵菌种子液与所述固体培养基的用量关系为100ml：450～950g。
20.生产上可以以1瓶600ml种子液拌1袋2.8kg固体培养基，其比例关系大约为100ml:466g，在培养条件稳定的情况下，也可以以1瓶600ml种子液拌2袋2.8kg固体培养基，其比例关系大约为100ml:932g，因此，球孢白僵菌种子液与所述固体培养基的用量关系为100ml：450～950g为佳。
21.优选的，步骤(2)中将塑料纸撤下以降低培养湿度从90％以上降低至70～75％，再进行开放式培养，获得白色结块的白僵菌固体培养物。
22.湿度由约90％降到70～75％，原因在于湿度由90％以及以上高湿条件下培养出白僵菌菌丝之后如果继续保持高湿条件，容易发生其它杂菌生长，而适当减低湿度到70～75％，杂菌发生较少，且白僵菌已经生成的菌丝将进入生长分生孢子阶段。
23.优选的，步骤(2)中主要采用网纱浅木框培养，其为网纱底浅框，内尺寸长80～100cm、宽40～50cm、厚(高)6～8cm，可根据实际情况调整，主要保持铺料厚度在5～7cm，培养时将多个纱网浅底木框先叠放在架子上，然后用塑料纸将架子围覆盖起来，保持密闭培养，待长满菌丝体后，将塑料纸撤下以降低培养湿度，然后再进行开放式培养，获得白色结块的白僵菌固体培养物。
24.进一步的，将步骤(2)中所述白僵菌固体培养物进行干燥，待白僵菌固体培养物含水量低于5％时，直接将白僵菌固体培养物粉碎获得初产品，或通过分孢器分离获得分生孢子粉，获得高孢白僵菌产品。产品中含孢量采用血球计数板法计算。
25.本发明提供的球孢白僵菌菌株的固体培养方法，操作简单，在较短的发酵时间内可以获得高产量的球孢白僵菌分生孢子，且产品质量稳定，具有显著的经济价值和良好的
应用前景。
26.上述培养方法获得的产品的含孢量的测定方法：
27.随机称取白僵菌固体培养初产品1g，放入100ml装有无菌水20ml的三角瓶中，加入50μl的0.05％的吐温
‑
80，用振动器震荡均匀，用微量移液器取样1ml，梯度稀释至10
‑7后镜检，用血球计数板法计算试验产品的含孢量，重复三次取平均值。
28.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
29.(1)本发明以木屑颗粒作为固体培养基基质，起到到增加透气性的作用，而且木屑的保湿作用较好，菌丝体在木屑颗粒孔隙间生长量多且迅速，最终白僵菌可以自由生长至固体培养基的里里外外，在整个培养过程中不需要人工翻料，省时省工；
30.(2)本发明操作过程简单，容易实现规模批量生产，生产条件要求不高，生产质量容易控制；
31.(3)本发明的固体培养基原料即玉米粉、麦麸、木屑都是价格低廉的材料，来源易得，南方地区可以就地取材，减少了运输费用，大大减低白僵菌培养的成本；
32.(4)本发明采用网纱浅底木框叠架式培养，优势明显，白僵菌固体培养一开始阶段需要保持密闭培养，只需将木框叠放在架子上，用塑料纸将架子围覆盖起来，即可保持密闭培养，待长满菌丝体后，需要降低湿度，只需将塑料纸撤下，降低湿度后有利于分生孢子的形成及成熟脱落，采用网纱底浅木框叠架式培养可以快速地由密闭培养转变为开放式培养，可以使白僵菌在较快的时间形成白色结块的白僵菌固体培养物，减少杂菌的污染。
附图说明
33.以下通过附图对本发明作进一步说明。
34.图1为本申请中采用的网纱浅底木框。
具体实施方式
35.以下通过具体的实施例子对本发明作进一步说明。
36.首先通过实施例1和对比例1
‑
3来说明不同成分固体培养基对于球孢白僵菌产孢量的影响。
37.目前生产一直用玉米粉、麦麸、谷壳和水为原料，其中谷壳作为填充料主要作用是疏松透气和提供菌丝体附着的作用，实验了不同填充材料替代谷壳培养白僵菌效果，实验发现以木屑代替谷壳培养白僵菌效果较不错，进而实验了不同木屑添加量的白僵菌培养效果，低、中、高添加量三个实施例和一个不用木屑替代谷壳的对照。
38.实施例1
39.本实施例提供的球孢白僵菌固体培养基，由以下质量份配比的原料制成：玉米粉5、麦麸28、木屑7、水32。
40.木屑的粒径为过8mm网孔。
41.木屑为松木屑。
42.该固体培养基制备方法如下：按上述质量份数称取固体培养基组分玉米粉、麦麸、木屑和水，拌匀成混合料，装入布袋，1个布袋装2.5kg混合料，将所有装填好的布袋置于灭菌柜中，灭菌过程需要在灭菌柜中加入一定量的水，使得灭菌柜可以达到饱和水蒸汽，126
℃和0.14mpa灭菌60min，冷却后待用(冷却后1个布袋重2.8kg)。
43.采用上述固体培养基进行球孢白僵菌的固体培养方法，包括如下步骤：
44.(1)球孢白僵菌种子液的制备
45.采用分离纯化自松毛虫的(采用常规分离纯化步骤获得)球孢白僵菌试管菌种，接种到60ml牛肉膏蛋白胨琼脂茄子瓶培养基上，25℃条件下培养7
‑
10d，至球孢白僵菌分生孢子长满整个茄子瓶培养基斜面，待用；
46.液体培养基用水600ml、玉米粉30g、白糖10g，装入1000ml容量的锥形瓶中，高压蒸汽灭菌法处理后冷却用于接种，一个生长良好的茄子瓶白僵菌可接种8
‑
10瓶液体培养基，接种后的液体培养基置于25℃，150r/min，摇床上震荡培养3
‑
4d，至液体培养基变为粘稠状和锥形瓶瓶壁出现白色黏状物，即为获得球孢白僵菌种子液；
47.(2)球孢白僵菌的固体培养
48.1瓶600ml种子液接种到1个布袋固体材料(2.8kg)上，混合均匀后，倒进1个纱网浅底木框中(纱网浅底木框如图1所示)，铺展匀开，使得培养基材料厚度在5～6cm，将接种好的固体培养框叠放在架子上，用塑料纸将架子围覆盖起来，保持密闭培养，20～26℃，培养2～4d，待长满菌丝体后，将塑料纸撤下，采用开放式培养，降低培养湿度，再培养5～7d，获得白色结块的白僵菌固体培养物；
49.(3)球孢白僵菌产品收集处理
50.将白僵菌固体培养物在干燥通风处晾干，待培养料含水量低于5％时，将白僵菌固体培养物粉碎获得初产品。
51.采用血球计数板法测定计算含孢量：随机称取白僵菌固体培养初产品1g，放入100ml装有无菌水20ml的三角瓶中，加入50μl的0.05％的吐温
‑
80，用振动器震荡均匀，用微量移液器取样1ml，梯度稀释至10
‑
7后镜检，用血球计数板法计算试验产品的含孢量。重复三次取平均值。
52.测定结果：3次血球计数板计数取平均值，培养物分生孢子含量为137.3
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108个/g。
53.对比例1
54.与实施例1不同是，固体培养基为：按质量份数比为玉米粉：麦麸：甜叶菊渣：水＝5：28：7：32配制3份固体培养基，每份固体培养基360g(玉米粉25g、麦麸140g、甜叶菊渣35g、水160g)，121.3℃，103.4kpa，60min，冷却后待用。
55.(5)测定结果：3次血球计数板计数取平均值，培养物分生孢子含量为94.4
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108个/g。
56.对比例2
57.与实施例1不同的是，固体培养基为：按质量份数比为玉米粉：麦麸：油茶壳：水＝5：28：7：32配制3份固体培养基，每份固体培养基360g(玉米粉25g、麦麸140g、油茶壳35g、水160g)，121.3℃，103.4kpa，60min，冷却后待用。
58.(5)测定结果，3次血球计数板计数取平均值，培养物分生孢子含量为62.6
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108个/g。
59.对比例3
60.与实施例1不同的是，固体培养基为：按质量份数比为玉米粉：麦麸：谷壳：水＝5：
28：7：32配制3份固体培养基，每份固体培养基360g(玉米粉25g、麦麸140g、谷壳35g、水160g)，121.3℃，103.4kpa，60min，冷却后待用。
61.(5)测定结果，3次血球计数板计数取平均值，培养物分生孢子含量为108.4
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108个/g。
62.如表1所示，不同固体培养基上的产孢量存在较大差异，以含有木屑的固体培养基上的白僵菌产孢量最高，为进一步研究含有木屑的固体培养基各组分之间的配比对产孢量的影响，采用以下实施例2
‑
3进一步研究。
63.表1白僵菌在不同固体培养基上的产孢量
64.培养基组成各组分配比(质量比)产孢量(108个/g)实施例1：玉米粉+麦麸+木屑+水5:28:7:32137.3对照例1：玉米粉+麦麸+甜叶菊渣+水5:28:7:3294.4对照例2：玉米粉+麦麸+油茶壳+水5:28:7:3262.6对照例3：玉米粉+麦麸+谷壳+水5:28:7:32108.4
65.实施例2
66.与实施例1不同的是，固体培养基为：按质量份数比为玉米粉：麦麸：木屑：水＝5：7：28：32配制3份固体培养基，每份固体培养基360g(玉米粉25g、麦麸35g、木屑140g、水160g)，121.3℃，103.4kpa，60min，冷却后待用。
67.(5)测定结果，3次血球计数板计数取平均值，培养物分生孢子含量为172.6
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108个/g。
68.实施例3
69.与实施例1不同的是，固体培养基为：按质量份数比为玉米粉：麦麸：木屑：水＝5：17：18：32配制3份固体培养基，每份固体培养基360g(玉米粉25g、麦麸85g、木屑90g、水160g)，121.3℃，103.4kpa，60min，冷却后待用。
70.(5)测定结果，3次血球计数板计数取平均值，培养物分生孢子含量为201.3
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108个/g。
71.如表2所示，通过实施例1
‑
3可以说明，在含有木屑的固体培养基中，当木屑与麦麸的比例大约在1：1时，白僵菌的产孢量最高。
72.表2固体培养基组分不同比例的产孢量
73.培养基组成各组分配比(质量比)产孢量(108个/g)实施例1：玉米粉+麦麸+木屑+水5：28：7：32137.3实施例2：玉米粉+麦麸+木屑+水5：7：28：32172.6实施例3：玉米粉+麦麸+木屑+水5：17：18：32201.3
74.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。