专利名称：一种利用番石榴脂肪氧化酶和氢过氧化物裂解酶制备天然香料的方法
技术领域：
本发明涉及一种酶法制备天然香料的方法，利用该方法可用于制备具有天然风味的香料，它涉及一种利用脂肪氧化酶[lipoxygenase(LOX)，EC1.13.11.12]或氢过氧化物裂解酶将不饱和脂肪酸转化为天然香料的方法。属于生物香料制备 技术领域。
背景技术：
本发明涉及制备多元不饱和脂肪酸降解产物的过程。这些降解产物是挥发性 天然风味物质，这些物质主要包括反式-2 tzi烯醛，反-2-顺-6壬二烯醇，顺式-3 己烯醇等。这些物质在植物果实，叶子，以及其它组织中广泛存在。多元不饱 和脂肪酸经脂肪氧化酶与过氧化物裂解后产生两类物质， 一类是C-6的醛类， 另一类是C-9的醛类。天然短链的C-6的醛类和醇类，这些化合物目前可以从植物或植物精油中提 取，也可以通过酶法合成。FR-A1 2696 192描述用脂肪氧化酶与天然的多元不 饱和脂肪酸反应制备醛类物质。WO 95/26413描述在脂肪氧化酶、过氧化氢物 裂解酶和酵母存在的情况下将亚麻酸转化为顺式-3-己烯醇，脂肪氧化酶是通过 在多元不饱和脂肪酸的顺顺双键上的加氧反应将这些不饱和脂肪酸降解，产生 脂肪酸过氧化氢物，这些氧化产物是很多重要的激素(前列腺激素等)与风味 物质的前体。在植物中，脂肪酸过氧化氢物的裂解主要是通过特异性的过氧化 氢物裂解酶的作用。天然的C-9的醛类和醇类(反-2-顺-6壬二烯醛，反-2-顺-6-壬二烯醇等)主 要是从紫罗兰叶中提取出来，紫罗兰叶提取物中还包括其它的化合物辛烯-3-醇 等。Galliard,T.， Phillips, D.R.， Reynolds,J.，等从黄瓜果实中提取的酶能够将 C-9的脂肪酸过氧化氢物裂解形成挥发性的醛类物质，这些物质主要是顺-3-壬醛 和反-2-壬醛。发明内容本发明提供一种制备亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等具有顺、顺-1,4-戊二烯 结构的多元不饱和脂肪酸降解产物的方法，尤其是通过牛化反应将多元不饱和 脂肪酸降解产生天然香料物质。即以多不饱和脂肪酸为原料，这些不饱和脂肪 酸主要是亚油酸，当然不限制其它具有顺、顺-l,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸，如亚麻酸和花生四烯酸等。通过利用番石榴果实中提取的酶的催化反应，将亚 油酸裂解为具有天然风味的天然香料物质，这些物质主要天然的C-6的醛类和 醇类、C-9的醛类和醇类以及酸类物质等，这些物质在植物果实、叶子、蔬菜以 及其它植物组织中广泛存在。正由于这些物质具有各种的天然风味，因此被广 泛的用于食品添加剂行业。催化降解多元不饱和脂肪酸产生重要的风味物质的特异性酶在各种植物组 织中广泛存在，当前的发明将这些酶添加到多不饱和脂肪酸中以产生风味化合 物，利用该方法产生的香料香气纯正、天然、安全。用于本发明的番石榴果实中包括具有降解脂肪酸前体物的酶类。多不饱和脂肪酸可以加入到植物组织中的酶的粗提液中，或者是酶纯化的任 何一个阶段，这些多不饱和脂肪酸可以是亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸。可以按照已有的方法将多元不饱和脂肪酸添加到制备的酶液中，加入多元不 饱和脂肪酸的量取决于处理过程中的各种因素，如番石榴酶提取液中的酶活水 平，所需要的目的产物的量。
一般，多元不饱和脂肪酸的的加入量大约为粗酶液质量的0.1%-10%，特别适合是1%-5%。本发明的处理过程可以产生大量的多元不饱和脂肪的降解产物，这些产物可以作为天然的香味成分。通过本发明可以制得的香味物质有天然的C-6的醛类和醇类、C-9的醛类和醇类以及酸类物质等。对于生化反应，是将番石榴果实中提取的粗酶与多元不饱和脂肪酸混合，这 些不饱和脂肪酸可以是其溶液，水或缓冲液溶剂，不饱和脂肪酸溶液与粗酶溶液的比例可以是l: 1至10: 1，更好的是5: 1 (质量比)。两溶液通过搅拌混合均匀。作为溶液的缓冲液，典型的是10到100mM的磷酸钾或磷酸钠溶液。 在进行生化反应时应通入空气。为提高酶活，提高酶的纯度是需要的，生化反应非常迅速，多元不饱和脂肪 酸的降解通常持续10至60分钟。典型的反应是室温15"C至25°C。粗酶的制 备可以是通过超声波破碎，或利用冰冻反复融胀破碎细胞，或者通过其它物理 或化学方法破碎细胞，以获得更大量的酶，并保持高效的酶活力。目标产物的提取可以采用通常的方法，利用氯仿或乙醚萃取生化反应混合 液，在液相和有机相分层后，取有机相后将溶剂蒸干，残留物用己烷提取，然 后蒸发溶剂，残留物用甲醇溶解，不溶于甲醇的物质在-l(TC放置10-24小时后析出，并通过离心去除。本发明提供一种利用番石榴果实中存在的脂肪氧化酶和氢过氧化物裂解酶 酶酶法降解多元不饱和脂肪酸从而产生天然香料方法，对所用的粗酶液通过纯 化后与多元不饱和脂肪酸进行生化反应所获得的产物有很大意义的提高。该发 明的过程提供了一种新的，有效获得具有天然香料物质，特别是天然的C-6的醛类和醇类、C-9的醛类和醇类以及酸类物质等，通过进一步的提纯，可获得纯 化的产物。目标产物的产量取决于所用的酶的活力与其反应的过程。
具体实施方式
实施例1天然香料的酶法制备I将20g番石榴果实去皮，机械破碎后，用石油醚脱脂后于室温下真空度1.3 千帕真空干燥，取上述脱脂番石榴粉用300ml， 0.01mol/L、 pH6.5的磷酸缓冲液 溶解，fC下搅拌45分钟，8000rpm离心5分钟，上清液加入硫酸氨使之饱和度 为50%,离心(10000rpm,15min)，沉淀用50ml的0.01mol/L、 pH6.5的磷酸缓冲 液溶解，溶液即为粗酶液，将亚油酸(纯度为60%) lml滴加入粗酶液中，4°C 下搅拌反应5小时，然后加入两体积的乙醚萃取，收集上层有机相，旋转蒸发 仪去除溶剂，所得到的天然香料含有天然的C-6的醛类和醇类、C-9的醛类和醇 类以及酸类物质。实施例2天然香料物质的酶法制备II50g番石榴去皮后与60ml 0.1M Bis-tris (pH6.8，含0.1%Triton-X100)机械 搅碎后过滤，滤液离心25000g 4°C， 30分钟，沉淀加入6.25ml、 20mM Bis-tris (pH6.8)搅拌lhr(4。C)， 4°C， 25000g离心30分钟后，上清液作为粗酶液保 存备用。将0.5mL亚麻酸(纯度为卯％)分散于15mL含0.05mL吐温20的 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.8)中，然后与上述获得的粗酶液混合，暴露在空 气中4。C下搅拌5小时后加入两体积的乙醚萃取，收集上层有机相，旋转蒸发仪 去除溶剂，所得到的天然香料含有天然的C-6的醛类和醇类、C-9的醛类和醇类 以及酸类物质。实施例3天然香料的酶法制备III2500g去皮的番石榴果实在1250mL O.lmol/L磷酸盐缓冲液(pH5.8)均质, 并用超声波破碎15分钟,10000 rpm离心30分钟。上清液加入20mM的CaCl2， 4"C下搅拌1小时，然后加入硫酸氨使之饱和度为30%， 10000rpm离心获得的 上清液继续加入硫酸氨使之饱和度为60%，离心获得的沉淀用200ml缓冲液溶 解，溶液既为酶液保存备用。将250mL花生四烯酸(纯度为85%)和5ml上述 制备的酶液混合，置酶反应器中，通入氧气，在4(TC下搅拌8小时，然后加入 两体积的乙醚萃取，收集上层有机相，旋转蒸发仪去除溶剂，即得所要求的天 然香料，内含天然的C-6的醛类和醇类、C-9的醛类和醇类以及酸类物质。
权利要求
1、一种利用番石榴中提取的具有高活性的酶用于降解亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等多元不饱和脂肪酸以产生天然香料的方法。这些具有高活性的酶是指从番石榴果实中提取，这些高活性的酶是指番石榴果实中存在的脂肪氧化酶和过氧化氢物裂解酶。
2、 根据权利要求1所述，从番石榴中提取的酶与多元不饱和脂肪酸混合进行 生化反应以制备天然香料，操作步骤如下1) 番石榴果实中脂肪氧化酶和过氧化氢物裂解酶的提取从番石榴果实中提 取酶，这里的酶可以是从番石榴果实中提取的粗酶，也可以是采用色谱柱分离 或其他分离力'法提纯后的酶。2) 将多元不饱和脂肪酸，如亚油酸，将0.25mL亚油酸分散于15mL含0.05mL 吐温20的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.8)中，然后与提取的酶混合，暴露在 空气中4'C下剧烈搅拌5小时后，加入两体积的乙醚萃取，收集上层有机相，减 压去除溶剂，即得天然香料。
3、 根据权利要求1所述，不饱和脂肪酸可以是亚油酸、也可以是其它具有顺、 顺-l，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸，如亚麻酸和花生四烯酸等。
4、 根据权利要求1所述，番石榴果实中所提取的酶含有脂肪氧化酶和过氧化 氢物裂解酶。
5、 根据权利要求1所述，制备的天然香料产物中包含一些C6-C9的醛类物质、 烯醛类物质、相应醛的醇类物质、酸类物质等。
全文摘要
本发明涉及一种利用番石榴组织中存在的酶合成天然香料的方法，该方法提供一种以亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等具有顺、顺-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的底物，利用番石榴组织中存在的酶降解底物，合成具有天然风味香料的方法。
文档编号C12P7/04GK101225406SQ200710172680
公开日2008年7月23日 申请日期2007年12月21日 优先权日2007年12月21日
发明者于忠梅, 侯心刚, 高彦祥 申请人:华宝食用香精香料(上海)有限公司