一种玉米根际促生菌在促进植株生长中的应用

1.本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种玉米根际促生菌在促进植株生长中的应用。


背景技术：

2.砂质潮土是潮土的主要类型之一，河南省砂质潮土面积约60万hm2，占全省沙地面积的89.8％，其母质主要是黄河历代决口、泛滥主流砂质沉积物，大部分分布在黄淮冲积平原的豫东、豫东北地区。虽然该区具有光照、温度、水分等资源优势，但是由于土壤质地较粗，砂粒含量高，结构疏松，在易耕作、易立苗的同时，产生了养分含量低，水分容量小，持水性差，渗透性强，易干旱，作物后期易脱肥早衰，产量低下等一系列问题，严重影响了玉米、小麦、花生等粮食经济作物的产量与品质。如何改善砂质潮土的不良性状，提高砂土生产能力，日益引起研究者的重视。探寻有效的土壤改良方式，改善微生物菌群结构，保肥增产，对进一步提高粮食产量和农业的可持续发展都具有重要作用。
3.我国作为农业生产第一大国，为了满足人口快速增长对农产品数量的要求，农药、化肥等化学物质的大量使用，虽然大幅度提高了农作物的产量，但同时也带来了农副产品有害物质残留量超标、菜田生态系统失衡、环境污染等问题。并且任何形态及种类的化肥，都不可能被植物百分之百利用和吸收，或残留在土壤中，或通过地表排水和渗漏流失到水环境中，导致地表水体的富营养化和地下水污染。
4.植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,pgpr)是指能够自由附着或定殖于植物根际，能直接或间接地促进植物生长发育或调节新陈代谢的有益菌。这些菌一方面可以增加土壤中氮素的生物利用率，促进难溶性磷素的溶解；另一方面还可以产生刺激植物生长的维生素，生长激素，如吲哚乙酸、赤霉素等，以增强其吸收营养和水分的能力。此外，他们还能分泌抗生素，抑制土壤中的致病菌或拮抗植物病原菌入侵，来提高植物对逆境的忍耐力。大量研究表明在水稻、小麦、药用植物中存在着多种优良的根际促生菌株，可对外界非生物胁迫做出反应，维持土壤健康。因此，对从砂质潮土中分离出来的促生菌进行有益的探索，在减少使用农药化肥、保护环境的同时，提高农作物的产量，是当前生态农业发展的必然选择，并且至今少见玉米促生菌的公开报道。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种玉米根际促生菌及其应用，该菌株对于玉米和拟南芥的生长具有促生作用，尤其对于根系部分具有较强的促生作用。
6.本发明的目的是提供了一种玉米根际促生菌在促进植株生长中的用途。
7.进一步地，所述玉米根际促生菌用于促进植株根系生长。
8.进一步地，所述玉米根际促生菌能够产生挥发物质2
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甲基丁酸乙酯、2,3,7
‑
三甲基辛烷、3
‑
甲基丁酸乙酯。
9.进一步地，所述玉米根际促生菌产生的挥发物质用于促进植株生长。
10.进一步地，所述植株为玉米或拟南芥。
11.进一步地，所述玉米根际促生菌为溶血葡萄球菌。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
13.1、本发明提供了一种玉米根际促生菌在促进植株生长中的应用，所述的玉米根际促生菌对拟南芥根部生长具有促进作用，对拟南芥根长、根系投影面积、表面积、根尖数分别提高了59.30％、8.81％、8.81％、82.13％；
14.2、本发明中的玉米根际促生菌对玉米植株具有促进作用，该菌株对玉米地上部分鲜重、干重、高度和低下部分含水量分别提高了13.9％、83.51％、8.89％、4.95％。
15.3、本发明中的玉米根际促生菌能够产生挥发物质2
‑
甲基丁酸乙酯、2,3,7
‑
三甲基辛烷、3
‑
甲基丁酸乙酯，以上挥发物质对于植株的生长具有促进作用。
16.4、本发明中玉米根际促生菌能够用于玉米和拟南芥的生长，为制备植株生长促进剂奠定菌种基础。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为本发明中的菌株l60菌落图；
19.图2为本发明实施例4中菌株l60促进拟南芥生长表型图；
20.其中，图2(a)表示对照组拟南芥野生型col的根部生长图；
21.图2(b)表示添加菌株l60的拟南芥的根部生长图；
22.图3为本发明实施例4中菌株l60对拟南芥不同指标的影响示意图；
23.其中，图3(a)表示实施例4中菌株l60对拟南芥根长的促进作用；
24.图3(b)实施例4中菌株l60对拟南芥根系投影面积的促进作用；
25.图3(c)实施例4中菌株l60对拟南芥表面积的促进作用；
26.图3(d)实施例4中菌株l60对拟南芥根尖数的促进作用；
27.图4为本发明实施例5中菌株l60中促进玉米植株生长的表型图；
28.其中，图4(a)表示玉米对照组生长示意图；
29.图4(b)表示使用菌株l60共培养时玉米生长示意图；
30.图5为本发明实施例5中菌株l60对玉米不同生理指标的促进作用图；
31.其中，图5(a)表示菌株l60对玉米地上部分鲜重的促进作用；
32.图5(b)表示菌株l60对玉米地上部分干重的促进作用；
33.图5(c)表示菌株l60对玉米地上部分高度的促进作用；
34.图5(d)表示菌株l60对玉米地下部分含水量的促进作用；
35.图6为本发明实施例6中菌株l60与空白对照各组之间相关性示意图；
36.图7为本发明实施例6中菌株l60的差异代谢物的层次聚类热力图。
具体实施方式
37.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
38.本发明提供了一种玉米根际促生菌在促进植株生长中的应用。
39.具体实施例如下：
40.实施例1
41.玉米根际促生菌的活化：
42.从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买到菌株，该菌株的保藏编号为cgmcc 1.10840；为了方便记录在本发明中记为菌株l60，称作玉米根际促生菌l60；
43.将获得的上述玉米根际促生菌l60菌株在lb固体培养基上进行活化，倒置放入30℃恒温培养箱中培养24h，活化备用。
44.lb培养基：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，固体加琼脂粉15g，121℃灭菌20分钟。
45.实施例2
46.玉米根际促生菌l60的鉴定：
47.对上述活化后的玉米根际促生菌l60在平板上进行形态特征观察，如图1所示，菌落形态表现为：乳白色、不透明、凸起、边缘整齐、表面湿润、性状为球状。
48.16s rdna鉴定为溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)。
49.实施例3
50.好氧性实验：
51.将刚灭完菌的lb固体培养基倒入试管2/3处，用无菌接种针挑取部分纯化的菌株l60，穿刺接种至试管底部。试管放入30℃恒温培养箱中培养3
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7天，观察结果。若菌株在试管培养基表面生长，则为好氧菌；若菌株沿穿刺线生长，则为厌氧菌；若二者都有，则为兼性厌氧菌。
52.观测结果显示，菌株l60的生长在培养基表面及穿刺线上均有分布，为兼性厌氧菌。
53.菌株l60革兰氏染色为阳性，好氧性试验为兼性厌氧。
54.实施例4
55.玉米根际促生菌l60对拟南芥的促生平板实验：
56.1、拟南芥平板试验
57.设置2个处理组(t1：拟南芥野生型col；t2：拟南芥野生型col+l60菌落)。拟南芥种子先用10％次氯酸钠消毒灭菌15min，再用无菌水清洗5
‑
6遍，点在含有1/2ms的培养基上，放入4℃冰箱春化2天后，竖直立于22℃光照培养箱中生长3
‑
4天(16h光照，8h黑暗)。挑选生长状态一致的幼苗，移至含有1/2ms的圆皿上(直径9cm)，放入大圆皿(直径13cm)中；处理组再放入点有l60菌落的小圆皿(直径4cm)，培养基为lb培养基。直立于22℃全光照培养箱中生长5.5天后进行根部生长指标的测定，促生效果图如图2所示。
58.1/2ms培养基：murashige&skoog medium 2.15g，mes monohydrate 0.5g，蔗糖5g，
琼脂5g，ph5.7，121℃灭菌20min。
59.2、拟南芥根部生长指标测定
60.拟南芥经处理生长5.5天，取出圆皿(直径9cm)，放在根系扫描仪上进行扫描，测定根长、根系投影面积、表面积、根尖数(即侧根数)。菌株l60对拟南芥根长、根系投影面积、表面积、根尖数有促进作用，分别提高了59.30％、8.81％、8.81％、82.13％，结果如图3所示。
61.实施例5
62.玉米根际促生菌l60对玉米的促生盆栽实验：
63.1、玉米盆栽实验
64.设置2个处理组(t1：玉米野生型b73；t2：玉米野生型b73+l60菌落)。玉米种子先用10％次氯酸钠消毒灭菌15min，再用无菌水清洗3
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4遍后，置于28℃水中浸泡24h。将装有等量灭菌的营养土(营养土1:蛭石1)的花盆(上直径14cm，下直径9cm，高11cm)放在已加水的托盘中，让水自然浸透土壤，挑取浸泡后大小一致且饱满的种子放在土表层，用保鲜膜盖住花盆以防水分流失，置于28℃恒温光照培养箱中培养，待其露白萌发。选择长势相同的玉米幼苗放在新的花盆中，每个花盆放5棵玉米幼苗。
65.用无菌枪头蘸取部分l60菌株打散至装有无菌水的2ml离心管中，轻轻吹打混合均匀，涂布于lb固体培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养1天。
66.将培养好的l60分离菌株培养基与玉米幼苗花盆置于一个全透明的箱子中，用胶带密封使其形成密闭的空间，置于恒温培养箱中生长14天后进行生长指标的测定，促生效果图如图4所示。
67.2、玉米生长生理指标测定
68.玉米经处理生长14天，将植株取出，小心清洗处理根部土壤，测定玉米地上部分鲜重、干重、高度和地下部分含水量。菌株l60对玉米地上部分鲜重、干重、高度和地下部分含水量均有促进作用，分别提高了13.9％、83.51％、8.89％、4.95％，结果如图5所示。
69.实施例6
70.玉米根际促生菌l60挥发物测定实验：
71.1、菌株l60挥发物的收集及检测
72.用无菌枪头蘸取部分l60菌株至装有无菌水的2ml离心管中，轻轻吹打使其混合均匀，并涂布于lb固体培养基上。选择未涂布的固体培养基作为对照，将其共同放入28℃恒温培养箱倒置培养1天，然后分别放入干净的气体收集瓶中抽提12h。取下收集柱，用1ml二氯甲烷洗脱挥发性化合物到棕色收集瓶中，做好标签，放到
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20℃冰箱中保存。利用气相色谱
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质谱联用技术对挥发性化合物进行测定，混合气体在离子源的电离下形成质荷比不同的离子，在质量分析器中根据质荷比的不同，将相同质荷比的离子聚集而将不同质荷比的离子分开，从而形成不同的质谱峰，数据系统根据电信号的不同，经过分析处理，得到相应的色谱图和数据结果。
73.2、菌株l60挥发物的数据分析
74.利用气相色谱
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质谱联用技术对l60菌株和其背景进行分析比对，结果如图6所示，l60与空白对照各组之间相关性较好，样本区分非常显著，全部处于95％置信区间。各组对比进行差异代谢物的筛选，得到差异代谢物的层次聚类热力图，结果如图7所示。如表1所示，选择l60分离菌株与其背景差异较大的成分，同时排除苯类物质，结果显示溶血葡萄球
菌产生的挥发物质2
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甲基丁酸乙酯(butanoic acid,2
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methyl
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,ethyl ester)、2,3,7
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三甲基辛烷(2,3,7
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trimethyloctane)、3
‑
甲基丁酸乙酯(butanoic acid,3
‑
methyl
‑
,ethyl ester)较背景差异显著。
75.表1玉米根际促生菌l60菌株与其背景差异代谢物
[0076][0077][0078]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0079]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。