一种提高重组蛋白表达量的方法与流程

1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种提高cho细胞蛋白表达量的方法。


背景技术：

2.重组蛋白工业生产的常用哺乳动物作为宿主细胞，中国仓鼠卵巢(cho)细胞是最常用的宿主细胞。尽管cho细胞已成功地用作制造宿主细胞系统超过30年，但这些细胞系在生长速度和重组蛋白生产能力方面仍然受到一定限制。改善宿主细胞的性能，提高宿主细胞的重组蛋白表达量，一直都是重组蛋白生产领域关注的重点。
3.通过生物分子学方法改造细胞系是常用的提高宿主细胞重组蛋白表达量的方法，现阶段应用于cho细胞的细胞系改造方法包括：敲除、过表达特定基因以及使用非编码rna等。这些特定基因涉及蛋白合成、细胞代谢、分泌以及细胞周期等各个细胞通路。例如，现有技术有报道通过敲除cho细胞中的atf6β提高了单抗的产量，通过在cho细胞中过表达erp57使tpo的产量提高了2.1倍，通过在cho细胞中过表达gadd34使human at-iii的titer提高了40％，以及通过在cho细胞中过表达mdh2，使存活细胞数目提高了1.9倍等。
4.脂肪酸结合蛋白(fabp)参与结合和存储疏水性配体(例如长链脂肪酸)，以及将其转运至细胞中适当的区室。脂肪酸结合蛋白5(fatty acid binding protein 5，fabp5)是一种细胞内结合长链脂肪酸和其他疏水性配体的小分子，在脂肪细胞和巨噬细胞中大量表达。
5.现有技术中暂无将fabp5作为目标基因改造用于表达重组蛋白的细胞，改善其性能的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用fabp5改造用于表达重组蛋白的细胞，改善其性能。
7.第一方面，本发明提供一种提高重组蛋白表达量的方法，所述方法包括如下步骤：将编码fabp5蛋白的基因转入用于表达重组蛋白的细胞中，进行瞬时或稳定表达；所述重组蛋白不为所述fabp5蛋白。
8.本发明提供的方法通过在宿主细胞中过表达fabp5蛋白，从而提升重组蛋白产量。
9.在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：将具有编码fabp5蛋白的基因的载体转入用于表达重组蛋白的细胞中。
10.在一些实施方式中，所述基因经过了密码子优化。
11.在一些实施方式中，所述载体中还插入了蛋白标签，如flag标签、halo标签、snap标签、his-tag标签等，优选为组氨酸(his-tag)标签。
12.在一些实施方式中，所述载体为真核细胞表达载体。作为本发明的优选方案，所述载体为pcdna3.1载体，如pcdna3.1 hygro(+)载体。
13.在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞，可以选自cho细胞(中国仓鼠卵巢
dxb11、cho-dg44等细胞系。
31.在一些实施方式中，所述细胞为能够稳定表达重组蛋白的单克隆细胞。
32.在一些实施方式中，所述细胞为外源转入了重组蛋白表达载体的细胞，所述重组蛋白表达载体可以先于编码fabp5蛋白的基因或载体转入细胞，也可以与编码fabp5蛋白的基因或载体共同转入。
33.作为本发明的一种具体实施方式，所述细胞为表达重组蛋白的单克隆cho细胞，其中外源转入了pcdna3.1载体；所述pcdna3.1载体中插入了cho细胞的编码fabp5蛋白的基因和编码组氨酸标签的基因，优选插入了如seq id no:1所示的基因序列。
34.作为本发明的一种具体实施方式，所述细胞为cho细胞，其中外源转入了重组蛋白表达载体和pcdna3.1载体；所述pcdna3.1载体中插入了cho细胞的编码fabp5蛋白的基因和编码组氨酸标签的基因，优选插入了如seq id no:1所示的基因序列。
35.在一些实施方式中，所述重组蛋白选自单克隆抗体(例如：曲妥珠单抗)和融合蛋白。所述融合蛋白优选为fc融合蛋白，如tnfr-fc融合蛋白等。
附图说明
36.图1为在herceptin克隆中的瞬时表达48h的胞内检测结果；
37.图2为瞬时转染fabp5后herceptin单克隆的活细胞密度；
38.图3为瞬时转染fabp5后herceptin单克隆的细胞活率；
39.图4为瞬时转染fabp5后herceptin单克隆的抗体产量；
40.图5为瞬时转染fabp5后tnfr-fc单克隆的活细胞密度；
41.图6为瞬时转染fabp5后tnfr-fc单克隆的细胞活率；
42.图7为瞬时转染fabp5后tnfr-fc单克隆的蛋白产量；
43.图8为在herceptin克隆中的稳定表达细胞池的胞内检测结果；
44.图9为在herceptin单克隆中稳定表达fabp5后的活细胞密度；
45.图10为在herceptin单克隆中稳定表达fabp5后的细胞活率；
46.图11为在herceptin单克隆中稳定表达fabp5后的抗体产量。
具体实施方式
47.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
48.实施例1：质粒构建
49.将cho细胞(中国仓鼠卵巢细胞)的fabp5基因序列的编码区结尾加上组氨酸标签(his-taq)进行序列合成，即合成如seq id no:1所示的基因序列，构建到pcdna3.1 hygro(+)载体中，得到pcdna-fabp5载体。
50.所述seq id no:1具体为：
51.atgggtgctatggccaaaccagactgcatcattacttgtgacggcaacaatatcaccattaaaactgagagcactttgaagacgacgcagttttcttgtaccctgggggagaagtttgatgaaactacagccgatggcagaaaaactcagacggtctgcaccttcactgatggcgccctggttcagcaccagaactgggatgggaaggaaagcacaataacaagaagagttaaggatgggaagctagtggtggattgtgtcatgaacaacgtgacctgtactcgggtctatgaaaaggtggagcatcatcaccaccaccactgataa
52.所述pcdna3.1 hygro(+)载体具有如seq id no:2所示的序列。
53.实施例2：瞬时转染
54.1、实验材料：
55.表达herceptin单抗的cho-k1单克隆细胞，培养基：ex-cell advanced cho fed-batch medium(sigma)；
56.表达tnfr-fc融合蛋白的cho-k1单克隆细胞，培养基balancd cho growth a(irvine),添加4mm谷氨酰胺；
57.实验前两种细胞均已复苏后传代一周以上，接种密度0.3-0.5
×
106个/ml，每3天传代一次，于180rpm，5％co2细胞培养摇床中培养。
58.24深孔板及三明治硅胶盖(htslabs)。
59.转染培养基：blancd transfectory cho(irvine)
60.2、步骤：
61.转染前一天将单克隆细胞传代至1.0
×
106个/ml，转染当天计数，用转染培养基blancd transfectory cho调整密度至2.0
×
106个/ml，分装到24深孔板中，每孔2.2ml。分别在细胞中加入实施例1构建的pcdna-fabp5质粒4μg/孔,pcdna3.1质粒4μg/孔，pei(聚醚酰亚胺)12μl/孔(1mg/ml)，每种质粒3个复孔。转染后，分别在24h，48h，72h，96h计数及留样用于滴度检测。在48h留取0.4
×
106个细胞用于免疫印迹，用his-tag antibody,mouse(proteintech)作为一抗，4℃过夜，二抗hrp goat anti-mouse igg hcs(abbkine)室温1h后显色。
62.3、herceptin克隆中的瞬时转染结果如图1至图4所示。
63.如图1所示，瞬时转染48h后，可见fabp5能检测到大小正确条带，证明pcdna-fabp5载体在宿主细胞中瞬时转染能够表达。
64.如图2所示，瞬时转染fabp5后，herceptin单克隆的活细胞密度较对照组pcdna3.1有提升，在96h提升了206％。
65.如图3所示，瞬时表达fabp5后，herceptin单克隆的活率较对照组pcdna3.1也有12个百分点的提升。
66.如图4所示，瞬时转染fabp5后，herceptin单克隆的产量在96h提升了195％。
67.由以上结果可知，瞬时转染fabp5对herceptin单克隆的细胞生长有促进作用，并且活率提升，抗体产量也有提升。
68.4、tnfr-fc克隆中的瞬时转染结果如图5至图7所示。
69.如图5所示，瞬时转染fabp5后，tnfr-fc单克隆的活细胞密度较对照组pcdna3.1有提升，在96h提升了31％。
70.如图6所示，瞬时转染fabp5后，tnfr-fc单克隆的活率略有提升，提升了9个百分点。
71.如图7所示，瞬时转染fabp5后，tnfr-fc单克隆的蛋白产量提升了60％。
72.由以上结果可知，瞬时转染fabp5对tnfr-fc单克隆的细胞生长有促进作用，融合蛋白产量也有提升。
73.实施例3：稳定表达
74.本实施例检测稳定表达fabp5对herceptin单克隆的影响。
75.1、实验材料：
76.表达herceptin单抗的cho-k1单克隆，培养基：ex-cell advanced cho fed-batch medium(sigma)；转染培养基：blancd transfectory cho(irvine)。实验前两种克隆均已复苏后传代一周以上，接种密度0.3-0.5
×
106个/ml，每3天传代一次，于180rpm，5％co2细胞培养摇床中培养。
77.2、实验方法：
78.转染前一天将herceptin单克隆细胞传代至1.0
×
106个/ml，转染当天计数，用转染培养基blancd transfectory cho调整密度至2.0
×
106个/ml，在摇管中进行瞬时转染，pcdna-fabp5和pcdna3.1质粒，按照质粒9μg，pei:27μl(1mg/ml)，进行转染。
79.转染48h后通过离心换液(200g,5分钟)的方式将细胞密度调整至0.5
×
106个/ml，培养基：ex-cell advanced cho fed-batch medium，并加入筛选试剂hygromycin(潮霉素)，终浓度：1500μg/ml，每3-4天计数，通过离心换液以0.5
×
106个/ml传代，直至细胞活率恢复至90％以上。(注：筛选过程中，pcdna3.1空载的细胞未能在1500μg/ml恢复活率，全部死亡)
80.将fabp5筛选后的细胞池与未处理的herceptin单克隆一起以0.5
×
106个/ml的密度接种在无抗生素的培养基中进行补料批培养，第三天开始加入补料cell boost 7a liquid feed(hyclone)3％，cell boost 7b liquid feed(hyclone)0.3％，并检测葡萄糖浓度，低于4g/l则补充到8g/l。在培养第4天留取0.5
×
106个细胞用于免疫印迹，用his-tag antibody,mouse(proteintech)作为一抗，4℃过夜，二抗hrp goat anti-mouse igg hcs(abbkine)室温1h后显色。培养过程中计数和取样进行抗体产量检测(fortebio octet)。
81.3、结果：
82.如图8所示，fabp5筛选后的细胞池补料批培养4天的细胞中可检测到fabp5的表达。
83.如图9和图10所示，与未处理组(nc)的herceptin单克隆相比，herceptin单克隆稳定表达fabp5后活细胞密度提升了33％，活率提升了3个百分点。
84.如图11所示，与未处理组(nc)相比，herceptin单克隆稳定表达fabp5后抗体产量提升了20％。
85.由以上结果可知，稳定表达fabp5对herceptin单克隆的细胞生长和抗体产量有提升作用。
86.虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。