新型冠状病毒的重组S蛋白及其制备方法和应用

新型冠状病毒的重组s蛋白及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种新型冠状病毒的重组s蛋白及其制备方法和应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种先前未在人类中发现的新型冠状病毒，即2019新型冠状病毒。2020年2月7日，国家卫健委决定将“新型冠状病毒感染的肺炎”暂命名为“新型冠状病毒肺炎”，简称“新冠肺炎”。2月11日，世界卫生组织(who)将其英文名称为corona virus disease 2019(covid
‑
19)。2月22日，国家卫健委决定将“新型冠状病毒肺炎”英文名称修订为“covid
‑
19”，与世界卫生组织命名保持一致，中文名称保持不变。新型冠状病毒肺炎患者初始症状多为发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。目前，缺乏针对病原体的有效抗病毒药物，以隔离治疗、对症支持治疗为主。基于目前的流行病学调查，潜伏期1～14天，多为3～7天。传染源主要是新型冠状病毒感染的患者和无症状感染者。潜伏期具有传染性，无症状感染者也可能成为传染源，人群普遍易感。感染后或接种新型冠状病毒疫苗后可获得一定的免疫力，但持续时间尚不明确。经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径，接触病毒污染的物品也可造成感染。在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能。
3.既往已知感染人的冠状病毒有6种，即hcov
‑
229e、hcov
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oc43、sarsr
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cov、hcov
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nl63、hcov
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hku1和mersr
‑
cov。新型冠状病毒肺炎主要是由2019新型冠状病毒(2019
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ncov)感染引起，其属于β属的冠状病毒，其基因特征与sarsr
‑
cov和mersr
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cov有明显区别。新型冠状病毒(novel severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,sars
‑
cov
‑
2)是单股正链rna病毒，具有极强的传染性和致死性。新型冠状病毒为球状病毒，主要包括4种结构蛋白，棘突蛋白(spike protein，s)、膜糖蛋白(membrane protein，m)、小包膜糖蛋白(envelop protein，e)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，n)，前三者在病毒衣壳表面散布存在。s蛋白和n蛋白是其中最重要的靶点蛋白，n蛋白是一种高度免疫原性的磷蛋白，在病毒体组装过程中，n蛋白与病毒rna结合形成螺旋核衣壳，且与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关，因此n蛋白常作为冠状病毒诊断检测工具，是免疫学快速诊断试剂的核心原料。s蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合的功能，是宿主中和抗体重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。n蛋白是冠状病毒中含量最丰富蛋白，具有高度保守性。人或动物体在感染新型冠状病毒初期无明显症状(一般为4～7d)，但病毒表面的s蛋白和e蛋白已经可以刺激宿主体液免疫分泌igm抗体，一周后分泌抗体则以igg抗体为主。因此，膜表面抗原适合用于新型冠状病毒抗体血清检测。
4.临床上，新型冠状病毒需要与流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、sars冠状病毒等其他已知病毒性肺炎鉴别，与肺炎支原体、衣原体肺炎及细菌性肺炎等鉴别。此外，还要将sars
‑
cov
‑
2与非感染性疾病，如血管炎、皮肌炎和机化
性肺炎等鉴别。而抗体检测是除了pcr检测之外，应对新型冠状病毒诊断最便捷的手段。
5.但是，采用一般抗原的新冠病毒抗体检测试剂盒的准确度不高，容易产生假阳性检测结果。


技术实现要素：

6.基于此，有必要提供一种用于新冠病毒抗体检测假阳性率较低的新型冠状病毒的重组s蛋白。
7.一种新型冠状病毒的重组s蛋白，所述重组s蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。
8.新型冠状病毒s蛋白包括corona s1和corona s2两个功能域，其中corona s2功能域与其他的冠状病毒高度相似，而corona s1为与宿主ace2受体识别区域，且与其他的冠状病毒相似度低。因此，本发明基于corona s1结构域进一步筛选得到igg和igm抗体激活表位多肽，并利用串联多肽组装成如seq id no:1所示的重组s蛋白。将该重组s蛋白应用于检测新型冠状病毒igg和igm抗体，可以有效降低新型冠状病毒诊断假阳性率，提高检测的准确度。
9.本发明还提供了一种核酸，所述核酸能够表达如上所述的重组s蛋白。
10.在其中一个实施例中，所述核酸的核苷酸序列如seq id no:2所示。
11.本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如上所述的核酸。
12.本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞的基因组中掺有如上所述的核酸。
13.本发明还提供了一种如上所述的重组s蛋白的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养如上所述的宿主细胞，收集培养液和/或所述宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化，得到所述重组s蛋白。
14.本发明还提供了如上所述的重组s蛋白、如上所述的核酸、如上所述的重组表达载体或如上所述的宿主细胞在制备用于检测新型冠状病毒抗体的产品中的应用。
15.本发明还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的新型冠状病毒抗体的检测方法，其以如上所述的重组s蛋白作为抗原，通过抗原抗体的特异性结合检测新型冠状病毒抗体。
16.在其中一个实施例中，制备方法包括以下步骤：用0.01m～0.03m磷酸缓冲液将所述重组s蛋白按0.1μg/孔～1μg/孔包板孵育过夜，洗板后进行封闭，再加入待测样品孵育，再洗板后，用标记的抗抗体进行孵育结合，抗抗体反应结束后进行反应显色。
17.本发明还提供了一种新冠肺炎检测试剂盒，其如上所述的重组s蛋白、抗抗体以及固相支持物；
18.所述抗抗体为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体；
19.可选的，所述重组s蛋白缀合于所述固相支持物上；
20.可选的，所述固相支持物为试管、ep管、多孔板、微量反应板凹孔、小珠或小圆片；
21.可选的，所述抗抗体与信号物质缀合。
附图说明
22.图1为实施例2中重组菌诱导表达产物的sds
‑
page电泳分析结果图；
23.图2为实施例2中重组菌在37℃培养条件下表达产物的sds
‑
page分析结果图；
24.图3为实施例2中重组菌在30℃培养条件下表达产物的sds
‑
page分析结果图；
25.图4为实施例2中重组菌在25℃培养条件下表达产物sds
‑
page分析结果图；
26.图5为实施例2中重组菌在16℃培养条件下表达产物sds
‑
page分析结果图；
27.图6为实施例3中免疫印迹捕获新型冠状病毒igg抗体的结果图；
28.图7为实施例3中免疫印迹捕获新型冠状病毒igm抗体的结果图；
29.图8为实施例4中重组s蛋白(可溶性)在不同条件下的elisa结果对比图。
具体实施方式
30.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
31.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
32.术语解释
[0033]“抗原”是指所有能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被t/b淋巴细胞表面的抗原受体(tcr/bcr)特异性识别与结合，活化t/b细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。因此，抗原有两个基本特性，就是抗原性和免疫原性。抗原性指抗原与其所诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力。免疫原性是指能引起免疫应答的性能，即抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。
[0034]“抗体”是指一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体按其反应形式分为凝集素、沉降素、抗毒素、溶解素、调理素、中和抗体、补体结合抗体等。按抗体产生的来源分为正常抗体(天然抗体)，如血型abo型中的抗a和抗b的抗体，和免疫抗体如抗微生物的抗体。按反应抗原的来源分为异种抗体、异嗜性抗体、同种抗体和自身抗体。按抗原反应的凝集状态分为完全抗体igm和不完全抗体igg等。抗体在医疗实践中应用甚为广泛，如用于疾病的预防、诊断和治疗方面都有一定的作用。临床上用丙种球蛋白预防病毒性肝炎、麻疹、风疹等，国际上用抗rh免疫球蛋白预防因rh血型不合引起的溶血症。诊断上如类风湿因子用于类风湿性关节炎，抗核抗体(ana)、抗dna抗体用于系统性红斑狼疮，抗精子抗体用于原发性不孕症的诊断等。治疗上如毒素中毒用抗毒治疗以及免疫缺陷性疾病的治疗等。
[0035]“载体(vector)”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。
[0036]“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、cho细胞、cos细胞、nso细胞、hela细胞、bhk细胞、hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。
[0037]
本发明一实施例的新型冠状病毒的重组s蛋白，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
[0038][0039]
新型冠状病毒s蛋白包括corona s1和corona s2两个功能域，其中corona s2功能域与其他的冠状病毒高度相似，而corona s1为与宿主ace2受体识别区域，且与其他的冠状病毒相似度低。因此，本发明基于corona s1结构域进一步筛选得到igg和igm抗体激活表位多肽，并利用串联多肽组装成如seq id no:1所示的重组s蛋白。将该重组s蛋白应用于检测新型冠状病毒igg和igm抗体，可以有效降低新型冠状病毒诊断假阳性率，提高检测的准确度。
[0040]
本发明一实施例的核酸，其能够表达如上所述的重组s蛋白。
[0041]
在一个具体示例中，上述核酸的核苷酸序列如seq id no:2所示。可以理解，由于密码子的简并性，能够表达同一蛋白的核酸序列具有多种形式，以上为经过密码子优化的核酸序列，但不限于此。
[0042][0043]
本发明一实施例的重组表达载体，其含有如上所述的核酸。
[0044]
在一个具体示例中，上述重组表达载体基于pet
‑
30a(+)构建得到，但不限于此。可以理解，载体还可包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子等及其他表达控制元件(例如转录终止信号、或者多腺苷酸化信号和多聚u序列等)。
[0045]
本发明一实施例的宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸。
[0046]
在一个具体示例中，宿主细胞为大肠杆菌、枯草菌、酵母细胞或曲霉菌等。在一个具体示例中，宿主细胞优选为原核细胞，优选为大肠杆菌，进一步优选为大肠杆菌bl21菌
株。
[0047]
本发明一实施例的上述重组s蛋白的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养上述宿主细胞，收集培养液和/或宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化，得到上述重组s蛋白。
[0048]
在一个具体示例中，制备方法包括以下步骤：将重组大肠杆菌接种至液体培养基中，37℃培养至对数期，加入iptg诱导剂继续培养，然后收集菌体，裂解菌体并离心收集上清。优选地，采用0.08mm～0.12mm iptg在24℃～26℃诱导4h以上。
[0049]
本发明一实施例的新型冠状病毒抗体的检测方法，其以上述重组s蛋白作为抗原，通过抗原抗体的特异性结合检测新型冠状病毒抗体。可以理解，具体的方法可选择免疫印迹、酶联免疫吸附、免疫层析等，不限于此，凡是利用抗原抗体的特异性结合原理的方法均可。
[0050]
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(western blotting)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有sds
‑
page的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。
[0051]
酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，简写elisa)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。这一方法的基本原理是：
①
使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；
②
使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
[0052]
免疫层析法(immunochromatography)的原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。例如胶体金试纸，是将胶体金标记的生物大分子在pvc材质的试纸固定，留加样孔，并设检测线和质量控制线。在加样孔上加入样品后，再滴加液体介质，试纸上进行层析。根据试纸上的免疫反应发生结果，即胶体金位置是否有红色条带出现判断检测结果。
[0053]
在一个具体示例中，检测方法包括以下步骤：用缓冲液将上述重组s蛋白按0.1μg/孔～1μg/孔包板孵育过夜，洗板后进行封闭，再加入样品孵育，再洗板后，用标记的抗抗体进行孵育结合，抗抗体反应结束后，使用底物溶液进行反应显色。优选地，上述缓冲液为磷酸缓冲液，进一步优选为ph7.2 0.01m～0.03m磷酸缓冲液，包被浓度为0.4μg/孔～0.6μg/
孔。例如用缓冲液将重组s蛋白按0.5μg/孔包板，100μl/孔，4℃孵育过夜，经过洗板后，用5％脱脂奶粉进行封闭，再加入兔抗新型冠状病毒s蛋白多克隆igg抗体孵育1小时，再洗板后，用hrp标记的羊抗兔igg抗体为二抗进行孵育结合45min，二抗反应结束后，使用tmb底物溶液进行反应显色，测定od450nm值。
[0054]
在一个具体示例中，检测方法包括以下步骤：将重组s蛋白上样进行sds
‑
page电泳，电泳结束后，进行转膜和抗体孵育，其中一抗用样品孵育，二抗用抗人单克隆抗体，再用化学发光试剂盒显影。例如将重组s蛋白以10μg的上样量进行sds
‑
page电泳，电泳结束后，进行转膜和抗体孵育，其中一抗用血清样品，二抗用鼠抗人igg的单克隆抗体或鼠抗人igm的单克隆抗体，再用超敏ecl化学发光试剂盒显影，并在伯乐化学发光成像系统进行拍照。
[0055]
本发明一实施例的新冠肺炎检测试剂盒，其含有如上所述的重组s蛋白、抗抗体以及固相支持物。可以理解，抗抗体为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体。
[0056]
可选的，重组s蛋白缀合于固相支持物上。可选的，固相支持物为试管、ep管、多孔板、微量反应板凹孔、小珠或小圆片。可选的，抗抗体与信号物质缀合。可选地，检测试剂盒还包括磷酸缓冲液、脱脂奶粉和3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺中的一种或多种。
[0057]
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
[0058]
实施例1重组菌的制备
[0059]
合成密码子优化后的重组s蛋白基因(seq id no:2)后，与原核表达载体pet
‑
30a(+)同时进行ecor i和xho i限制性内切酶双酶切，分别回收核酸片段，再用t4 dna连接酶连接过夜。
[0060]
将连接产物热激转化bl21(de3)感染态细胞，并用50μg/ml卡那霉素lb培养板进行抗生素压力筛选后，经过菌落pcr鉴定和核酸测序分析后，得到重组菌，该菌也同时包含了重组载体。
[0061]
实施例2重组s蛋白的表达
[0062]
通过改变诱导温度(t)、诱导时间(t)和iptg浓度，确定获得重组s蛋白可溶性表达的最佳诱导条件。
[0063]
挑取上述重组菌的单菌落至5ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，过夜培养后，再按1％接种到100ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，37℃培养至对数期，加入不同浓度的iptg诱导剂，继续培养4h后，收集菌体。往上述菌体加入pbs，连续洗涤两次后，加入含有10ml 1％triton x
‑
100的pbs，冰上超声裂解菌体，12000rpm离心20min，收集上清q1。剩余沉淀则加入上样缓冲液(100mm nah2po4，10mm tris，8m尿素，10mm 2
‑
me，ph8.0)充分混匀后，12000rpm离心30min，收集上清q2。上述上清样品q1和q2均经sds
‑
page电泳分析检测，结果见图1。泳道m为protein marker，泳道1为野生表达菌全菌蛋白，泳道2是重组菌在0.1mm iptg 37℃诱导4h后的全菌蛋白，泳道3是重组菌在0.5mm iptg 37℃诱导4h后的全菌蛋白，泳道4是重组菌在1mm iptg 37℃诱导4h后的全菌蛋白，泳道5是重组菌在0.1mm iptg 37℃诱导4h后的裂解上清，泳道6是重组菌在0.1mm iptg 37℃诱导4h后的沉淀。该结果显示，重组菌经过诱导可以有效表达目的蛋白，大小约30kda。
[0064]
类似地，在30℃培养条件下0.5mm iptg诱导，对不同培养时间的表达产物进行sds
‑
page分析，结果如图2所示。泳道m为protein marker，泳道1为30℃2h诱导菌液，泳道2是30℃2h裂解上清，泳道3是30℃2h裂解沉淀，泳道4是30℃4h诱导前，泳道5是30℃4h裂解
上清，泳道6是30℃4h裂解沉淀，泳道7是30℃6h诱导菌液，泳道8是30℃6h裂解上清，泳道9是30℃6h裂解沉淀。该结果显示，重组菌在30℃培养条件下不能有效表达目的蛋白。
[0065]
类似地，在25℃培养条件下4h诱导，对采用不同浓度iptg诱导的表达产物进行sds
‑
page分析，结果如图3所示。泳道m为protein marker，泳道1为诱导前，泳道2是0.1mm iptg 25℃诱导，泳道3是0.5mm iptg 25℃诱导，泳道4是1mm iptg 25℃诱导，泳道5是0.1mm iptg 25℃裂解上清，泳道6是0.1mm iptg 25℃裂解沉淀。该结果显示，重组菌在25℃培养条件下不能有效表达目的蛋白。
[0066]
类似地，在16℃培养条件下4h诱导，对采用不同浓度iptg诱导的表达产物进行sds
‑
page分析，结果如图4所示。泳道m为protein marker，泳道1为诱导前，泳道2是0.1mm iptg 16℃诱导，泳道3是0.5mm iptg 16℃诱导，泳道4是1mm iptg 16℃诱导，泳道5是0.1mm iptg 16℃裂解上清，泳道6是0.1mm iptg 16℃裂解沉淀。该结果显示，重组菌在16℃培养条件下不能有效表达目的蛋白。
[0067]
利用ni
‑
sepharose亲和层析柱，分离和纯化上清q1的目的蛋白，收集洗脱液，得到重组s蛋白的可溶性蛋白，纯化后的目的蛋白浓度为0.14μg/μl。结果见图5所示，泳道1～2均为纯化后的重组s蛋白的可溶性蛋白，泳道m为protein marker。
[0068]
实施例3免疫印迹
[0069]
将重组s蛋白(可溶性)、重组s蛋白(包涵体纯化)和n蛋白进行wb分析，上样量分别为2μg、10μg、9.4μg，血清稀释倍数1：300，sds
‑
page电泳结束后，进行转膜和抗体孵育，其中一抗用阳性血清，二抗用鼠抗人igg的单克隆抗体(圣克鲁斯生物技术，货号：sc
‑
69786)或鼠抗人igm的单克隆抗体(圣克鲁斯生物技术，货号：sc
‑
376317)，再用超敏ecl化学发光试剂盒显影，并在伯乐化学发光成像系统进行拍照。结果见图6和图7，泳道1为n蛋白，泳道2为重组s蛋白(包涵体纯化)，泳道3为重组s蛋白(可溶性)，泳道m为预染色彩虹蛋白marker，3个蛋白孵育抗igg二抗均出现目的条带，重组s蛋白(可溶性)和重组s蛋白(包涵体纯化)孵育抗igm二抗出现目的条带。由图6和图7可知，该重组s蛋白可以有效捕获新型冠状病毒igg和igm抗体，产生抗原抗体免疫反应。
[0070]
实施例4酶联免疫吸附(elisa)
[0071]
为了进一步优化重组s蛋白通过elisa检测手段对抗体进行捕获结合，本实施例分别配制了0.05m醋酸缓冲液(ph2.0)、0.05m柠檬缓冲液(ph5.0)、0.02m磷酸缓冲液(ph7.2)、0.05m碳酸缓冲液(ph9.6)等4种不同ph值的包被液。
[0072]
用上述4种缓冲液将重组s蛋白分别按0.1μg/孔、0.2μg/孔、0.5μg/孔、1μg/孔包板，100μl/孔，做3个重复孔，4℃孵育过夜。经过洗板后，用5％脱脂奶粉进行封闭，再加入兔抗新型冠状病毒s蛋白多克隆igg抗体(由金斯瑞生物科技股份有限公司制备)孵育1小时，再洗板后，用hrp标记的羊抗兔igg抗体为二抗进行孵育结合45min。一二抗反应结束后，使用tmb底物溶液进行反应显色，测定od450nm值。
[0073]
重组s蛋白(可溶性)的elisa检测结果数据见表1和图8(数据结果显示为样品孔od450/空白孔od450)，重组s蛋白(包涵体纯化)的elisa检测结果数据见表2。结果显示，最优包被液为0.02m磷酸缓冲液(ph7.2)，抗原包被浓度为0.5μg时，重组s蛋白捕获elisa具有较高的灵敏度和可重复性。
[0074]
表1
[0075] 0.1μg0.2μg0.5μg1μg0.05m醋酸缓冲液(ph2.0)1.6477987422.9371069182.2893081762.5660377360.05m柠檬缓冲液(ph5.0)2.3439490454.471337585.0254777074.3757961780.02m磷酸缓冲液(ph7.2)2.9924242426.5757575767.0075757586.6893939390.05m碳酸缓冲液(ph9.6)2.6951219514.7256097564.4329268293.93902439
[0076]
表2
[0077] 0.1μg0.2μg0.5μg1μg0.05m醋酸缓冲液(ph2.0)2.1949685532.0943396232.3710691821.3647798740.05m柠檬缓冲液(ph5.0)4.4840764334.490445864.5159235672.7197452230.02m磷酸缓冲液(ph7.2)8.969696978.6136363648.2045454555.469696970.05m碳酸缓冲液(ph9.6)5.0243902445.8414634156.0182926836.512195122
[0078]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0079]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。