1.本发明属于生物制品制备技术领域，具体地说是涉及一种益生菌冻干外壳复合保护剂及其应用。
背景技术：
2.益生菌因为活菌保藏期与货架期长、活菌数量高而被广泛研究和应用。冷冻干燥过程一般会造成益生菌的细胞膜通透性改变、蛋白质变性失活、ph值被破坏、dna损伤和膜脂肪酸组成发生改变等，从而导致冻干过程产品中益生菌的大量死亡。因此，在益生菌制剂的生产过程中，为了保护益生菌的活性，除了控制冻干工艺制程外，最关键的是的挑选益生菌合适的冻干保护剂当成外壳保护剂。
3.中国专利cn 103333840a公开了一种益生菌超低温冷冻工艺、适合这种工艺的全盐冷冻保护剂配方及其制备的益生菌超低温冷冻颗粒。所述益生菌超低温冷冻工艺包括以下步骤：(1)配制发酵培养基；(2)培养益生菌；(3)离心处理；(4)配制保护剂；(5)添加保护剂；(6)速冻成型。其提供了利用所述益生菌超低温冷冻颗粒制备的益生菌制剂及其制备方法。所述益生菌超低温冷冻颗粒为益生菌冷冻菌株，其不需要干燥除水，具有冷冻速度快、活菌率高、复水性能好等优点。
4.许多研究发现在乳酸菌冻干前加入适当的物质能起到保护作用，对于绝大多数益生菌冷冻干燥成功的关键在于外壳保护剂的使用。现有的外壳保护剂对于益生菌的活性有一定的保护作用，但是在冷冻干燥或复水时仍然会对细胞造成一定的损害，益生菌在冷冻干燥工艺中活细胞损失较大，并不能很好地保持原有的各种生理生化特性和生物活性。
5.为了提高益生菌在冷冻干燥工艺中细胞的存活率，中国专利cn 108676721a公开了一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：鼠李糖脂3.5～5.5％，丙二醛1.5～2.2％，谷氨酸1.0～1.6％，酪氨酸0.8～1.2％，7
‑
癸烯
‑4‑
内酯2.0～4.0％，磷酸氢二钠0.8～1.5％，磷酸二氢钠0.8～1.5％，维生素c 0.3～0.5％，余量为蒸馏水。该保护剂与益生菌固形物混合后可以大幅度提高益生菌的存活率，因此具有广阔应用前景。但是其选用的原料组成中的丙二醛具有细胞毒性，而且具有潜在的致癌性，使用安全性还有待于进一步提高。
技术实现要素：
6.为了克服现有技术存在的问题，本发明提供了一种益生菌冻干外壳复合保护剂及其应用。本发明使用的外壳复合保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性；而且外壳复合保护剂中不添加任何化学合成物质，安全性更高。
7.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
8.一种益生菌冻干外壳复合保护剂，所述外壳复合保护剂由如下重量百分含量的组分组成：分离乳清蛋白粉0.7～1.8％、酪氨酸0.5～1.5％、精氨酸0.7～1.3％、结冷胶0.1～
1.1％、菊粉0.2～1.0％、维生素c 0.2～0.8％、藻酸钠0.1～0.5％、γ
‑
聚谷氨酸0.1～0.5％、余量为蒸馏水。
9.本发明很好地克服了现有技术中益生菌在冷冻干燥工艺中活细胞损失较大的技术不足，本发明外壳复合保护剂中的各组分在提高益生菌在冷冻干燥工艺的存活率方面具有显著的保护作用，而且组分安全性更好，具有广阔的应用前景。
10.作为优选，所述分离乳清蛋白粉与菊粉的重量比为3：1。该重量比控制下得到的外壳复合保护剂对于益生菌细胞的保护作用最佳。
11.作为优选，所述复合保护剂由如下重量百分含量的组分组成：分离乳清蛋白粉1.5％、酪氨酸1.0％、精氨酸1.0％、结冷胶0.6％、菊粉0.5％、维生素c0.5％、藻酸钠0.2％、γ
‑
聚谷氨酸0.2％、余量为蒸馏水。在此配方比例下，益生菌细胞在冷冻干燥工艺中的细胞损失率最少。
12.本发明还提供了上述外壳复合保护剂在益生菌冷冻干燥工艺中的应用。
13.作为优选，益生菌冷冻干燥工艺包括如下步骤：
14.(1)将益生菌发酵液控制温度在9～18℃、离心转速为15000～20000rpm，离心时间10～30mins，去除上清液，初步脱水，收集脱水益生菌菌体；
15.(2)将外壳复合保护剂与上述得到的脱水益生菌菌体混合均匀，放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
16.作为优选，步骤(2)中冷冻干燥具体为：按照每半小时降温10℃的降温速度降至至
‑
30～
‑
40℃，真空度维持在150～200pa，持续8～12小时，按照每半小时8℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为100～150pa继续干燥8小时，即冷冻干燥完成。
17.作为优选，在益生菌制剂冷冻干燥前，将外壳复合保护剂与脱水益生菌菌体按照质量比1～5：1的比例混合。
18.作为优选，在益生菌制剂冷冻干燥前，将外壳复合保护剂与脱水益生菌菌体按照3：1的比例混合。
19.作为优选，所述益生菌发酵液为胚芽乳酸杆菌的发酵液、嗜酸乳酸杆菌的发酵液、或发酵乳酸杆菌和副干酪乳杆菌的细胞发酵液。
20.本发明配以一定比例的益生菌冻干外壳复合保护剂，经胚芽乳酸杆菌的发酵液，嗜酸乳酸杆菌的发酵液，发酵乳酸杆菌和副干酪乳杆菌的细胞发酵液辅以冷冻干燥得活菌冻干粉(益生菌冻干制剂)。益生菌冻干制剂经测试活菌数达到10^9cfu/g以上，本冻干制剂质量稳定，服用量小，易于携带服用和贮存，不添加任何化学合成物质，安全性高，功能独特，稳定性佳。
21.本发明的有益效果在于：
22.(1)本发明外壳复合保护剂中不添加任何化学合成物质，安全性高；
23.(2)本发明外壳复合保护剂可以减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性，对冷冻干燥工艺前后益生菌具有十分显著的保护作用；
24.(3)本发明外壳复合保护剂使用范围广，其对于胚芽乳酸杆菌以及乳酸杆菌属的菌种均具有很好的保护作用，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明所要保护的范围并不限于此。
26.本发明选用的原料组成如无特殊说明，均购于市场。
27.本发明益生菌发酵液为胚芽乳酸杆菌的发酵液、嗜酸乳酸杆菌的发酵液、或发酵乳酸杆菌和副干酪乳杆菌的细胞发酵液。
28.实施例1
29.一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：分离乳清蛋白粉1.5％、酪氨酸1.0％、精氨酸1.0％、结冷胶0.6％、菊粉0.5％、维生素c 0.5％、藻酸钠0.2％、γ
‑
聚谷氨酸0.2％、余量为蒸馏水。
30.冷冻干燥工艺包括如下步骤：
31.(1)将益生菌发酵液控制温度在12℃、离心转速为18000rpm，离心时间30mins，去除上清液，初步脱水，收集益生菌菌体；
32.(2)将冷冻干燥用复合保护剂与脱水益生菌菌体3：1比例混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，按照每半小时降温10℃的降温速度降至
‑
33℃，真空度维持在190pa持续10小时，按照每半小时8℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为140pa继续干燥8小时，即冷冻干燥完成。
33.实施例2
34.一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：分离乳清蛋白粉1.1％、酪氨酸0.5％、精氨酸0.7％、结冷胶0.3％、菊粉0.2％、维生素c 0.4％、藻酸钠0.3％、γ
‑
聚谷氨酸0.3％、余量为蒸馏水。
35.冷冻干燥工艺包括如下步骤：
36.(1)将益生菌发酵液控制温度在15℃、离心转速为19000rpm，离心时间30mins，去除上清液，初步脱水，收集益生菌菌体；
37.(2)将冷冻干燥用复合保护剂与脱水益生菌菌体2.2：1比例混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，按照每半小时降温10℃的降温速度降至至
‑
40℃，真空度维持在180pa持续10小时，按照每半小时8℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为140pa继续干燥8小时，即冷冻干燥完成。
38.实施例3
39.一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：分离乳清蛋白粉1.1％、酪氨酸0.5％、精氨酸0.7％、结冷胶0.3％、菊粉0.2％、维生素c 0.4％、藻酸钠0.3％、γ
‑
聚谷氨酸0.2％、余量为蒸馏水。
40.冷冻干燥工艺包括如下步骤：
41.(1)将益生菌发酵液控制温度在10℃、离心转速为20000rpm，离心时间20mins，去除上清液，初步脱水，收集益生菌菌体；
42.(2)将冷冻干燥用复合保护剂与脱水益生菌菌体3.7：1比例混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，按照每半小时降温10℃的降温速度降至至
‑
30℃，真空度维持在200pa持续10小时，按照每半小时8℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为150pa继续干燥8小时，即冷冻干燥完成。
43.实施例4
44.一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：分离乳清蛋白粉1.3％、酪氨酸0.5％、精氨酸0.7％、结冷胶0.3％、菊粉0.5％、维生素c 0.4％、藻酸钠0.3％、γ
‑
聚谷氨酸0.2％、余量为蒸馏水。
45.冷冻干燥工艺包括如下步骤：
46.(1)将益生菌发酵液控制温度在12℃、离心转速为18000rpm，离心时间30mins，去除上清液，初步脱水，收集益生菌菌体；
47.(2)将冷冻干燥用复合保护剂与脱水益生菌菌体2.6：1比例混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，按照每半小时降温10℃的降温速度降至
‑
33℃，真空度维持在190pa持续10小时，按照每半小时8℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为140pa继续干燥8小时，即冷冻干燥完成。
48.实施例5
49.一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：分离乳清蛋白粉1.3％、酪氨酸0.5％、精氨酸0.7％、结冷胶0.3％、菊粉0.5％、维生素c 0.4％、藻酸钠0.3％、γ
‑
聚谷氨酸0.3％、余量为蒸馏水。
50.冷冻干燥工艺包括如下步骤：
51.(1)将益生菌发酵液控制温度在18℃、离心转速为15000rpm，离心时间10mins，去除上清液，初步脱水，收集益生菌菌体；
52.(2)将冷冻干燥用复合保护剂与脱水益生菌菌体2.8：1比例混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，按照每半小时降温10℃的降温速度降至至
‑
35℃，真空度维持在150pa持续10小时，按照每半小时8℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为100pa继续干燥8小时，即冷冻干燥完成。
53.实施例6
54.一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：分离乳清蛋白粉1.2％、酪氨酸0.5％、精氨酸0.7％、结冷胶0.3％、菊粉0.2％、维生素c 0.4％、藻酸钠0.4％、γ
‑
聚谷氨酸0.3％、余量为蒸馏水。
55.冷冻干燥工艺包括如下步骤：
56.(1)将益生菌发酵液控制温度在12℃、离心转速为18000rpm，离心时间30mins，去除上清液，初步脱水，收集益生菌菌体；
57.(2)将冷冻干燥用复合保护剂与脱水益生菌菌体2.4：1比例混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，按照每半小时降温10℃的降温速度降至
‑
33℃，真空度维持在190pa持续10小时，按照每半小时8℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为140pa继续干燥8小时，即冷冻干燥完成。
58.实施例7
59.一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：分离乳清蛋白粉1.1％、酪氨酸0.5％、精氨酸0.7％、结冷胶0.3％、菊粉0.2％、维生素c 0.4％、藻酸钠0.4％、γ
‑
聚谷氨酸0.3％、余量为蒸馏水。
60.冷冻干燥工艺包括如下步骤：
61.(1)将益生菌发酵液控制温度在12℃、离心转速为18000rpm，离心时间30mins，去
除上清液，初步脱水，收集益生菌菌体；
62.(2)将冷冻干燥用复合保护剂与脱水益生菌菌体2.3：1比例混合均匀，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥，按照每半小时降温10℃的降温速度降至
‑
33℃，真空度维持在190pa持续10小时，按照每半小时8℃的升温速度升温至30℃，控制真空度为140pa继续干燥8小时，即冷冻干燥完成。
63.对比例1
64.一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂，其由如下重量百分含量的组分组成：分离乳清蛋白粉2.0％、酪氨酸1.7％、精氨酸1.5％、结冷胶1.3％、菊粉1.2％、维生素c 0.9％、藻酸钠0.7％、γ
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聚谷氨酸0.6％、余量为蒸馏水。冷冻干燥工艺同实施例1。
65.对比例2
66.未添加冷冻干燥用复合保护剂，直接按照实施例1所述的工艺进行冷冻干燥。
67.按照本发明所述的工艺分别处理样品1、样品2和样品3，分别测定冷冻前后的益生菌数量变化，其中样品1为胚芽乳酸杆菌的发酵液，样品2为嗜酸乳酸杆菌的发酵液，样品3为发酵乳酸杆菌和副干酪乳杆菌的细胞发酵液。菌落计数按照gb 4789.35
‑
2010食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验所述的方法进行，计算其存活率，存活率为冷冻干燥后的细菌总数与冷冻干燥前的细菌总数的比值。其测定结果(本发明外壳复合保护剂对冷冻干燥工艺前后益生菌的保护作用)如表1所示。
68.表1
[0069] 样品1存活率(％)样品2存活率(％)样品3存活率(％)实施例193.294.796.9实施例283.185.876.6实施例380.885.273.9实施例489.990.893.6实施例589.580.187.7实施例684.285.786.8实施例782.784.885.1对比例163.767.865.4对比例223.120.924.2
[0070]
由上表可以看出，本发明外壳复合保护剂对冷冻干燥工艺前后益生菌具有十分显著的保护作用，与未添加任何保护剂的工艺相比具有极显著性差异。从不同实施例可以看出，组分的用量比例以及工艺条件的控制等均会对外壳复合保护剂的效果产生明显影响，其中实施例1所述的外壳复合保护剂的保护效果最佳。