丁香抑制ldl组份氧化修饰有效成分冻干粉的制备方法
【专利摘要】本发明一种丁香抑制LDL组份氧化修饰有效成分冻干粉的制备方法步骤为：（1）将60℃以下烘干的丁香进行粉碎、过60目筛；（2）向丁香粉中加入40?60wt%的乙醇，采用料液比1:20?1:30g/ml，采取微波?超声波协同提取，微波和超声波的功率分别为50?100W、50W，提取时间6?12min，提取2?5次；提取液合并、浓缩；向该浓缩液中加入适量水混悬后，分别加入正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取；将乙酸乙酯萃取液浓缩、冻干获得丁香冻干粉。该丁香干粉对LDL所含组份及其光谱学性质的改变具有很强的抑制作用，在抑制LDL氧化修饰功能食品研究与开发等领域具有较好的应用前景。
【专利说明】
丁香抑制LDL组份氧化修饰有效成分冻干粉的制备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种丁香抑制LDL组份氧化修饰有效成分冻干粉的制备方法，具体属 于天然产物有效成分提取技术领域。
【背景技术】
[0002]低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL)是极低密度脂蛋白的代谢物，在 肝脏和外周组织之间运输甘油三酯和胆固醇。LDL主要由脂质和载脂蛋白（apolipoprotein B-100，apoB100)组成。
[0003] LDL氧化修饰是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)形成的关键性因素。LDL在氧 化过程中其脂类及蛋白均会产生修饰而改变其结构及光谱性质等。LDL氧化过程主要表现 在：（一)LDL所含脂类发生氧化修饰过程。首先，LDL所含的多元不饱和脂肪酸发生自身氧化 产生共辄二稀(conjugated diene，⑶），该产物可作为脂质早期过氧化的测定指标。其次， 脂类进一步氧化生成大量的脂质过氧化物。（二）蛋白组成部分一 apoBlOO及其相关氨基酸 残基也会发生氧化修饰。① 色氨酸(Trp)氧化修饰，导致其在激发波长295nm(Ex295)/发射 波长330nm(Em330)处的荧光发生淬灭。②赖氨酸(Lys)氧化修饰，分别形成在Ex390/Em460 和Ex350/Em420处有强荧光吸收的物质。③其它氧化修饰。LDL外层蛋白与脂质发生过氧化 反应形成复合产物-希夫碱(脂褐素），在Ex350/Em460处有荧光吸收，反映机体衰老及细胞 受自由基损伤程度。
[0004] 丁香，为桃金娘科植物丁香(Eugenia caryophylla Thunb.)的干燥花蕾，又称公 丁香，属于国家公布的药食两用植物，具有抗氧化、抗低密度脂蛋白氧化修饰、抗菌、杀虫、 消炎、止痛、降血糖等功效。研究结果表明，丁香中总多酚含量非常丰富，丁香总多酚是其具 有众多功能活性的物质基础之一。
[0005] 国内外研究成果表明，丁香具有很强的抗氧化作用。本发明发现丁香在具有强抗 氧化活性的基础上，对LDL氧化修饰也具有很强的抑制作用，并发现丁香乙酸乙酯部位是抑 制LDL氧化修饰的有效部位。但是，丁香乙酸乙酯部位对LDL氧化修饰抑制作用主要通过抑 制其所含脂类氧化、还是通过抑制其所含蛋白apoBlOO氧化、或者是同时对脂类及蛋白实现 氧化抑制来实现呢?LDL氧化修饰受到丁香抑制后其光谱学性质会发生哪些变化?这些问题 目前均不清楚。
[0006] 将超声提取及微波提取结合同时协同提取可以实现优势互补，超声波产生的振荡 和搅拌作用能有效弥补微波传热、传质不均等缺陷，而微波极佳的热效应能有效地弥补超 声产热不足的问题。国内外很多学者采用超声和微波同时协同提取各自原料功能因子，均 发现比传统方法，如热回流、水浴振荡或索氏抽提等提取时间更短、得率更高、效率更好。本 发明采用该超声-微波-协同提取技术提取丁香抗氧化物质得率及效率更高。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种制备抑制LDL所含脂类及蛋白氧化修饰及其光谱学性质 改变的有效成分冻干粉的制备方法，为后续探索丁香抑制LDL氧化剂抗AS相关功能食品产 业化提供依据。
[0008] 本发明丁香抑制LDL组份氧化修饰有效成分冻干粉的制备方法步骤为：
[0009] ⑴丁香在40~60°C烘干后，经粉碎、过30~70目的筛，得到丁香粉末。
[0010]⑵丁香粉末、40~60wt %的乙醇溶液按照1:20~30g/ml的比例，将丁香粉末加入 到乙醇溶液中，通过超声波-微波协同提取6~12min;超声波-微波协同提取重复2~5次后， 将提取液合并后进行真空浓缩至合并提取液起始体积的1/10-1/20,获得丁香提取浓缩液； 所述的微波和超声波的功率分别为50~100W、50W。
[0011]⑶采用极性依次增强的正己烷、乙酸乙酯、正丁醇作为萃取溶剂，对上述丁香提取 浓缩液分别依次萃取2~10次，上述溶剂每次的用量为丁香提取浓缩液体积的1/4~1/2;将 乙酸乙酯萃取液真空浓缩后，加入2~5倍于乙酸乙酯萃取液体积的水进行混悬，在-50~-86 °C条件下冷冻2~I Oh后，再冷冻干燥24~36h，得到丁香冻干粉。
[0012] 所述的步骤⑴中粉碎的时间为1~4min，粉碎的转速为10000~25000r/min。
[0013]本发明的优点
[0014] 本发明优点在于提出一种制备抑制LDL所含脂类及蛋白组分氧化修饰的方法，通 过该方法制备得到的冻干粉是丁香抑制LDL氧化修饰的有效部位，对LDL所含脂类及蛋白氧 化修饰过程发生光谱学性质的改变也具有抑制作用。
[0015] 通过本发明所述方法制备得的冻干粉，当其终浓度为7~lOyg/mL时，能显著抑制 LDL在氧化过程中脂褐素荧光的产生(P〈0.05)、色氨酸残基荧光淬灭及LDL氧化过程中脂类 氧化产物一活性醛修饰LDL中apoBlOO所含赖氨酸残基；当其终浓度为25yg/mL时，能较好地 抑制LDL在氧化修饰过程中赖氨酸游离氨基活性衰减(P〈0.05)及LDL所含脂类及蛋白氧化 修饰过程中紫外可见吸收光谱的改变。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但不因此而限制本发明。
[0017] 实施例！
[0018]称取一定量丁香，于干燥箱中40°c烘干过夜，粉碎后过60目筛。称取筛下物丁香粉 7.000克，采用微波功率75W、超声功率50W、50%乙醇210mL、提取12min，提取三次，提取液合 并、浓缩，加入50mL蒸馏水超声混悬后置-70°C冷冻过夜后冷冻干燥36小时获得丁香粗提 物，将该粗配制成浓度0.3、0.4与0.5mg/mL分别测定其对LDL所含脂类成分的氧化产物一硫 代巴比妥酸反应物(TBARS)产生量的抑制效果如表1所示。丁香粗提物在0.3-0.5mg/mL浓度 范围内对TBARS产生量具有很强的抑制效果，并且呈现出良好的量效关系。 LUUAJ」 头施例2：
[0021] 称取丁香粉末200.0(^，采用50%乙醇、料液比1:30&/1111)、微波功率751、超声功 率50W、提取时间12min，提取3次，提取液合并、浓缩后获得浓缩液，加入适量蒸馏水超声辅 助混悬后，分别采用极性逐渐增大的有机溶剂正己烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取得到这 些有机溶剂相和最后的水相。其中乙酸乙酯混合液浓缩后加水混悬冷冻过夜后冷冻干燥获 得丁香干粉(ethyl acetate fraction，EAF冻干粉），测定该干粉对LDL所含脂质中的总胆 固醇含量在氧化过程中的保护效果结果如表2所示。丁香EFC能有效抑制LDL所含脂类成 分一总胆固醇降解。EFC冻干粉样液（12.5yg/mL)胆固醇含量显著高于促氧组(P〈0.01)，且 比同浓度的阳性对照BHT含量高。
[0023] 实施例3
[0024] 将EAF冻干粉配制成浓度为7以8/11^、1(^8/1111^!11'浓度为1(^8/11^，测定这些样对 LDL所含蛋白中色氨酸（Trp)残基荧光淬灭抑制效果如表3所示。从该表可看出，添加7yg/ mL、10yg/mL EAF样液组荧光强度分别为244.5、263.8，均显著高于促氧组（201.63)(卩〈 0.01 )，表明EAF能显著抑制Trp残基荧光淬灭。
【主权项】
1. 丁香抑制LDL组份氧化修饰有效成分冻干粉的制备方法，其特征在于:所述的制备方 法步骤为： (1) 丁香在40~60°C烘干后，经粉碎、过30~70目的筛，得到丁香粉末； (2) 丁香粉末、40~60wt%的乙醇溶液按照1:20~30g/ml的比例，将丁香粉末加入到乙 醇溶液中，通过超声波-微波协同提取6~12min;超声波-微波协同提取重复2~5次后，将提 取液合并后进行真空浓缩至合并提取液起始体积的1/10-1/20，获得丁香提取浓缩液;所述 的微波和超声波的功率分别为50~100W、50W; (3) 采用极性依次增强的正己烷、乙酸乙酯、正丁醇作为萃取溶剂，对上述丁香提取浓 缩液分别依次萃取2~10次，上述溶剂每次的用量为丁香提取浓缩液体积的1/4~1/2;将乙 酸乙酯萃取液真空浓缩后，加入2~5倍于乙酸乙酯萃取液体积的水进行混悬，在-50~-86 °C条件下冷冻2~10h后，再冷冻干燥24~36h，得到丁香冻干粉。2. 根据权利要求1所述的丁香抑制LDL组份氧化修饰有效成分冻干粉的制备方法，其特 征在于:所述的步骤(1)中粉碎的时间为1~4min，粉碎的转速为10000~25000r/min。
【文档编号】A61P9/10GK105963363SQ201610403057
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】江慎华, 曾钧杰, 杨琼玉, 谢丽琴, 张良慧, 张化浩, 赵锦
【申请人】九江学院