一种生物体或组织中dsRNA及提取该dsRNA的方法

本发明涉及dsrna提取技术领域，尤其涉及一种生物体或组织中dsrna及提取该dsrna的方法。

背景技术：

在正常的动植物体内很难检测到双链rna(double-strandedrna，dsrna)的大量存在，任何导致正常植物体dsrna形成的情况都会引起相应基因的沉寂，这是寄主的的dsrna切割酶(dicer酶)切割的结果，所以正常动植物体内各种基因的有效表达需要一套严密防止dsrna形成的机制，这就是生物体内的rna干涉(rnainterference,rnai)。利用rnai原理和技术，借助转基因或纳米载体或其它手段，能够特异性降低或关闭寄主或病原物基因表达。这种技术已经在基因组学研究、转基因动植物培育、有害生物防治、基因治疗和药物研发等领域取得了一定的成果。如2006年在猪ibrs-2细胞水平上，利用人重组腺病毒表达的口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus,fmdv)特异的sirna能有效抑制fmdv的复制；近些年，在饲喂干扰昆虫特异的v-atpase基因的dsrna溶液，或饲喂表达dsrna的植物，或病毒介导v-atpase的基因敲除，实现西方玉米根叶甲、柑橘粉蚧、豌豆蚜、棉蚜、烟粉虱、赤拟谷盗、烟草天蛾等害虫的死亡或有效控制；抗植物病毒方面，人们将外源病毒的基因片段导入靶标植物基因组，表达形成dsrna后，使得入侵的病毒以及同属病毒中序列相近的rna降解，病毒体内复制增殖过程被阻断，转基因植物因此获得抗性,成功的案例很多，如水稻抗rdv、烟草抗tmv、番木瓜抗prsv等。但是转基因作物不容易被大多数国家和民众接收。因此，科学家尝试多种体外表达病毒的dsrnas，通过不同方法被寄主或介体吸收，从而达到干扰病毒侵染的目的。2001年timmons发现一种缺乏dsrna特定的核酸内切酶rnaseiii的大肠杆菌原核表达菌株(ht115)，该菌株能诱导表达目的基因特异的dsrnas。将细菌原核表达的pmmov病毒特异dsrna喷到植物叶片上，几天后在喷洒dsrnas的同一叶片上接种pmmov，观察发现pmmov不能侵染该植物。2016年naga等应用t7rna聚合酶(t7ribomaxexpressrnaisystem)合成tmvp126andcp基因的dsrnas，通过注射方法浸润烟草叶片，接种植株成功抵御tmv的侵染。在rnai技术应用过程中，如果是体外施放dsrna，其制备非常重要，其中dsrna的大量提取尤为关键。

另外，动植物体遭受到rna病毒入侵后，往往能够产生dsrna，有些dsrna是病毒的基因组，有些dsrna是病毒侵染过程中产生的复制中间体。如当前国内流行的水稻病毒病rdv(ricedwarfvirus)、rrsv(riceraggedstuntbirus)等，它们都有特异的dsrna基因组图谱。通过提取患病组织中的dsrna，可以用于鉴定动植物病毒的种类以及进一步分析其核酸遗传和变异的基础。因此，从患病动植物体内提取dsrna是rna病毒研究中的基础操作技术。

目前的dsrna提取方法有：(1)trizol法，即先提取获得总rna后用dna酶和rna酶消化处理，以此得到dsrna，但该种方法提取得到的dsrna质量较差，效率很低。(2)licl沉淀法，即先提取获得总rna后用licl进行密度梯度离心，以此得到dsrna，但该种方法提取得到的dsrna质量也比较差，并且更重要的是操作繁琐并且试剂的价格过于昂贵。

然而，尽管这些常规的方法能够提取dsrna，但是其操作过程仍较为繁琐，在提取过程中还要消耗较多的时间，并且在离心管中多次离心悬浮过程中会造成较多的dsrna的损失，体系不稳定，容易造成dsrna提取实验失败，不利于实验的正常开展，拖慢实验的进度；并且其提取过程中由于dna的降解会产生大量的干扰物，造成提取物中dsrna浓度较低，并影响最终产品纯度及提取回收率。

技术实现要素：

有鉴于此，有必要提供一种从生物体或组织中提取dsrna的方法，用以克服现有技术提取过程的上述至少一种缺陷。

本发明提供一种从生物体或组织中提取dsrna的方法，包括以下步骤：

s1、获取生物体或组织，粉碎后混入有机试剂进行处理，离心；

s2、取离心上清液，混入提取试剂作为上样液上样层析柱，促使上样液中dsrna可逆性地吸附于层析柱中的填料上；

s3、采用第一溶液和第二溶液依次对层析柱中填料进行分段洗脱，得到第一洗脱液和第二洗脱液，收集所述第二洗脱液进行后续处理以得到最终的dsrna。

具体的，所述s1步骤中，有机试剂为苯酚、氯仿、异戊醇的混合溶液。

进一步的，苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1；

具体的，所述s1步骤中，先将粉碎的粉末混入ste缓冲溶液，后再与等体积的所述有机溶剂进行混合。

具体的，所述s2步骤中，所述提取试剂包含16％wt的乙醇。

具体的，所述改性纤维素粉为硅化微晶纤维素粉。

具体的，所述第一溶液为包含16％wt乙醇的ste缓冲溶液。

具体的，所述第二溶液为ste缓冲溶液。

具体的，所述s3步骤中，后续处理包括以下步骤：

向第二洗脱液中加入异丙醇，于-20℃条件下冷冻；

离心，取沉淀；及

加入乙醇水溶液后再次离心，取沉淀，用depc溶解后于-20℃条件保存。

本发明还提供所述方法制备得到的包含于生物体或组织中的dsrna。

有益效果：

本发明结合有机试剂处理和纤维素柱层析步骤，先对生物体或组织进行处理，促使其破碎，以释放核酸物质至液相中；再利有纤维素柱层析中填料对液相中浓度核酸物质进行可逆性吸附，通过分段洗脱，能够有效分离dsrna与其他核酸物质，尤其能够显著降低dna降解物质的干扰，提高最终产品dsrna的纯度及提取回收率。

附图说明

图1为本发明实施例提供的不同纤维素粉提取液电泳图；泳道5、4、3、2、1依次对应为硅化微晶纤维素粉、c6288纤维素粉、56790纤维素粉、50um纤维素粉和90um纤维素粉；上方为dsrna条带，下方为杂质条带，最右边为marker泳道。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种从生物体或组织中提取dsrna的方法，包括以下步骤：

s1、获取生物体或组织，粉碎后混入有机试剂进行处理，离心；

s2、取离心上清液，混入提取试剂作为上样液上样层析柱，促使上样液中dsrna可逆性地吸附于层析柱中的填料上；

s3、采用第一溶液和第二溶液依次对层析柱中填料进行分段洗脱，得到第一洗脱液和第二洗脱液，收集所述第二洗脱液进行后续处理以得到最终的dsrna。

本发明结合有机试剂处理和纤维素柱层析步骤，先对生物体或组织进行处理，促使其破碎，以释放核酸物质至液相中；再利有纤维素柱层析中填料对液相中浓度核酸物质进行可逆性吸附，通过分段洗脱，能够有效分离dsrna与其他核酸物质，尤其能够显著降低dna降解物质的干扰，提高最终产品dsrna的纯度及提取回收率。

另外，本发明实施例提供的dsrna提取方法，简化了提取步骤，集成了层析、流动和收集步骤，仅需一步离心，减少了分批次数及整个提取过程的时间，也减少了dsrna的损失，还提高了提取效率。

具体的，所述s1步骤中，有机试剂为苯酚、氯仿、异戊醇的混合溶液，其中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1；主要为促使生物体或组织破碎的细胞中的核酸释放出来，以便于后期层析，此种有机试剂的比例，能够促使释放的核酸中含有较少的其他核酸，如dna、单链dna、单链rna以及其片段或降解物。

具体的，所述s1步骤中，先将粉碎的粉末混入ste缓冲溶液，后再与等体积的有机溶剂进行混合。

具体的，所述s2步骤中，所述提取试剂包含16％wt的乙醇。

具体的，所述s2步骤中，所述填料为硅化微晶纤维素粉，硅化微晶纤维素粉的制备工艺具体包括so3微热爆协同稀碱工艺、酸解工艺、漂白工艺和硅化工艺。

so3微热爆协同稀碱工艺：

1、p2o5、浓硫酸在110℃下搅拌反应，常压条件将生成的so3气体通入放有稻草秸秆的罐体中。罐体温度维持在60℃，1h。

2、两步碱洗操作：首先2％的氢氧化钠溶液，固液比1:15置于中试罐，转数为40r/min，60℃下搅拌1h后过滤；接着再加2％的氢氧化钠溶液1:10，再加30％加过氧化氢使其实际浓度为2％。

3、将碱洗后的滤渣进行多次水洗，直至ph为7～8。

酸解工艺：

向预处理得到的粗纤维素中加入2mo1/l的稀盐酸溶液。在90℃下机械搅拌3h后。取出向混合液中补加2/3的冰水，冷藏30min，去离子水洗涤至滤液基本为无色。此时ph维持在5～6。

漂白工艺：

一步漂白工艺条件：将酸解后的滤渣置于ph约1～3的盐酸溶液中。75℃下机械搅拌。加入2％的亚氯酸钠固体漂白剂。漂白1h后过滤，用去离子水洗涤至中性；二步漂白工艺条件：将一次漂白后滤渣放置于5％的双氧水溶液中。体系ph为9～10，在55℃下机械搅拌约1h。然后过滤，去离子水洗涤至中性。

硅化工艺：

碱化过程：称取配好的九水偏硅酸钠于纯化水中，加入漂白得到的固体，碱化处理使其溶胀；后用盐酸调ph到弱酸性，制备硅胶，使其涂覆与秸秆微晶纤维素的表面。产物过滤，用纯化水打浆洗涤，重复直到水洗液产物符合标准，滤饼在78～82℃干燥得到产物。

具体的，所述第一溶液为包含16％wt的乙醇的ste缓冲溶液。

具体的，所述第二溶液为ste缓冲溶液。

具体的，所述s3步骤中，后续处理包括以下步骤：

向第二洗脱液中加入异丙醇，于-20℃条件下冷冻；

离心，取沉淀；及

加入乙醇水溶液后再次离心，取沉淀，用depc溶解后于-20℃条件保存。

为便于对上述步骤进行更具体的描述，一个更加典型的实施过程如下：

1、首先需要使用本发明所建立的层析柱-蠕动泵-自动部分收集器的装置系统，在实验前要先配制层析柱中的填充剂16％乙醇1×ste溶液，并将其填充至层析柱的3/4处，填充要分多次完成，需加到3/4处后等待纤维素粉沉降压实后，继续填充，直至沉降压实后的纤维素粉到达层析柱的3/4处即填充完成，然后将层析柱，蠕动泵和自动部分收集器顺次连接完成，整个提取系统准备完成。

2、具体的提取过程如下：

(1)取1-10g含有dsrna的生物体或组织放入研钵，加入适量液氮用研磨锤将菌体或组织研磨至粉末状或沙子状，保持粉末状的时间内尽快将其转移至50ml离心管中。

(2)向含有磨碎生物体或组织的50ml离心管中加入等体积(v/m)的2×ste溶液(0.5mtris-hcl，1mnacl，10medta)，然后再加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇溶剂(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)。

(3)将离心管放置于摇床上混匀振荡10min。

(4)振荡完后，将离心管取出，离心15分钟(9000rpm/min)。

(5)离心后取上清液，配置成含16％乙醇的溶液，然后转移至50ml新离心管中。

(6)把层析柱下端细管和蠕动泵用软管对接，软管另一端通向废液缸，层析柱上端细管插入(5)中离心管液体中。

(7)打开蠕动泵，在蠕动泵的作用下，离心管中溶液会被吸至层析柱中并最终经过柱子进入废液缸，待离心管中溶液吸完，暂停蠕动泵，在这个过程中，层析柱中的纤维素粉会变为褐色，同时双链rna会被吸附至层析柱中的纤维素粉上。

(8)将连接层析柱的上端细管移至16％乙醇1×ste溶液中，然后打开蠕动泵，使16％乙醇1×ste溶液被吸至层析柱中，并最终同样通向废液缸，16％乙醇1×ste溶液起到洗脱液的作用，洗去dna和ssrna(单链rna)，在这个过程中，纤维素粉逐渐褪色。当16％乙醇1×ste溶液被用掉400ml后，暂停蠕动泵。

(9)将自动部分收集器的细管与蠕动泵软管连接，同时将层析柱上端细管移至不含乙醇的1×ste溶液中。确认各个管口都连接好后同时打开蠕动泵和自动部分收集器，收集器定滴设置为22滴一管(1ml)，收集30管后同时关闭蠕动泵和自动部分收集器；

(10)将30管收集的溶液转移至30个2ml离心管中，加入等体积的异丙醇，置于冰箱-20℃层中冷冻90min以上；

(11)完成冷冻后，将离心管置于离心机中离心10min，12000rpm/min；

(12)弃上清液，用预冷的75％乙醇洗涤沉淀，然后再离心1min，12000rpm/min；

(13)用移液枪吸干上清液(注意不要吸起沉淀)，真空干燥3min；

(14)加入50μldepc水溶解沉淀，-20℃保存，至此dsrna便提取完成。

下面结合附图和实际应用对本发明进行进一步的说明。

一、层析柱的选择以及填充

本发明所采用的层析柱，其规格为直径16mm，长20cm，其上下均有接口，采用内径为1mm的细管连接外界与蠕动泵。其内部要填充纤维素粉和16％乙醇1×ste溶液(预先以1:1配好再填充)，填充完毕后连接层析柱，蠕动泵和自动部分收集器，可以准备开始实验。过层析柱的步骤代替了传统纤维素层析法提取dsrna基因组步骤中，使用16％乙醇1×ste溶液洗脱以及1×ste溶液溶解的步骤。大大简化了实验中最繁琐的重复悬浮离心纤维素粉从而洗脱dna和ssrna的操作，同时由于蠕动泵的作用，过柱速度较快，相比于使用离心管重复悬浮离心，加快了实验速度。

二、高效吸附dsrna的纤维素粉的筛选

利用不同品系、规格的纤维素粉提取生物体或组织中dsrna，并分析各自的纯化效果，筛选能最高效吸附dsrna的纤维素粉。

具体步骤如下：

1)提取材料的准备：将携带lsev病毒的瓠瓜种子种植于试验田中，待其成株后，采集叶片，用液氮研磨后-20℃保存备用。

2)dsrna的提取：按照上述典型的实施例过程进行提取。

选取5个型号的纤维素粉(c6288纤维素粉、56790纤维素粉、50um纤维素粉、90um纤维素粉及上述本发明实施例提供的硅化微晶纤维素粉)，分别填充层析柱，用于提取1-10g感染lsev病毒的瓠瓜植株中的dsrna，将提取出的dsrna溶解于30ul的核酸溶解液中，取lul用nanodrop检测浓度，取15ul进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。

从图1中可以看出本发明实施例所采用的硅化微晶纤维素粉对应的泳道中显示的dsrna条带最亮，表明其提取出的dsrna的浓度最高。

dsrna的定量分析：

rt-pcr产物的克隆和测序琼脂糖凝胶电泳检测rt-pcr产物后，随机选取3个扩增的目的片段经pcreragmentrecoverkit回收纯化，与pmd18-tvector连接后转化e.colidh5a菌株感受态细胞，挑取阳性克隆子，菌落pcr验证后，送上海生工生物工程公司进行测序，测序结果运用ncbiblast进行同源性搜索比较分析。

提取的dsrna浓度分析的结果如下表1所示。

表1

表1结果表明，本发明实施例采用硅化微晶纤维素粉提取lsev感染的瓠瓜组织中dsrna，其得到的dsrna浓度最高，且远远高于其他几种纤维素粉，这可能与微晶纤维素粉的高机械强度及对水相的高度敏感性，促使其在复杂的混合各类核酸物质的有机环境中，更易于亲和双链核糖核酸结构，将其吸附在其微孔结构和表面，以最大程度地获取双链核糖核酸，为提高dsrna产品的纯度提高关键保障。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。