鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性引物对、检测试剂盒及其应用

1.本发明属于致病菌检测技术领域，具体涉及一种鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性引物对、检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌是耶尔森氏菌病的主要病原菌，它在自然界中分布广泛，不仅存在于土壤和河水、湖水等自然环境中，还存在于肉制品、乳制品等食物中。小肠结肠炎耶尔森氏菌是为数不多能在冷藏温度下存活并生长的细菌，因此可通过冰箱内的冷藏食品感染人类。近年来，耶尔森氏菌病在全球广泛流行，其中欧洲最为严重，我国在20世纪80年代也遭受过2次由耶尔森氏菌病引起的大流行。人和动物在被感染后会表现出若干病症，轻者表现为呼吸困难、胃肠炎、心血管疾病，重者可以引起败血症，甚至危及生命。由此可见，致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌所引发的疾病严重危害着人类与动物的健康，其产生的影响不容忽视。
3.小肠结肠炎耶尔森氏菌含有5种主要毒力基因ail、ysta、ystb、yada和virf，其中，ail作为黏附侵袭位点基因，只存在于致病菌株中，并且经常被用于鉴定该菌的致病性。鉴于其对人体健康的巨大危害，我国要求按照sn/t 0174
‑
2011方法对出口食品中的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌进行严格检测，但该方法需要很长时间去培养细菌。中国食品安全国家标准gb 4789.8
‑
2016中规定的食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的鉴定方法有冷富集、培养基培养、尿素酶试验、半固体动力试验、革兰氏染色镜检和生化鉴定。这种方法通常与聚合酶链式反应(pcr)和环介导等温扩增(lamp)等核酸扩增方法结合使用，这种结合虽然能够提高检测的灵敏度，但是该方法耗时略长，而且对大型循环加热仪器的使用(如pcr仪)是不可避免的。
4.自2006年，piepenburg等开发重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)技术以来，该技术已广泛应用于病原的检测。rpa在恒温条件下即可对靶基因进行扩增，操作简单、反应快速，对仪器设备要求很低，在37℃～42℃某一适当温度范围内维持酶的活性即可完成核酸扩增。核酸扩增结果的判定主要是利用仪器法或肉眼观察法。琼脂糖凝胶电泳法与荧光检测仪法均需要借助仪器来判定结果，荧光染料法虽然只需肉眼观察颜色的变化，但染料具有很强的非特异性，能够与任何双链dna结合而显色从而影响判读。


技术实现要素：

5.本发明的目的是，提供一种鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性引物对、检测试剂盒及其应用。旨在解决现有技术中检测方法需要使用加热仪器、检测时间较长，检测灵敏度相对不高的问题。
6.本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
7.一种鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性引物对，所述特异性引物对为fe和re，fe的序列如seq id no.1所示，re的序列如seq id no.2所示。
8.本发明还提供所述的特异性引物对在非诊断或治疗目的检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌中的应用。
9.本发明还提供一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测试剂盒，该检测试剂盒包括seq id no.1和seq id no.2所示的特异性引物对。
10.作为优选实施方案，所述检测试剂盒还包括rpa核酸扩增试剂、量子点荧光微球与地高辛抗体的偶联物qdnbs
‑
mcab、核酸检测试纸条、上样缓冲液。
11.作为优选实施方案，所述特异性引物对的5’端分别修饰有地高辛和生物素，经过rpa核酸扩增后，目标产物带有地高辛和生物素标记。
12.作为优选实施方案，所述rpa核酸扩增的引物浓度为0.06
‑
0.24μm，反应时间为5
‑
10min；优选为引物浓度0.012μm，反应时间5min。
13.作为优选实施方案，所述qdnbs
‑
mcab在检测中的用量为1
‑
3μl，优选为2μl。
14.作为优选实施方案，所述核酸检测试纸条的t线为包被链霉亲和素，c线为包被羊抗鼠igg；t线划膜浓度为0.5
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1.0mg/ml，c线划膜浓度为1
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2mg/ml；优选为，t线划膜浓度0.5mg/ml，c线划膜浓度1mg/ml。
15.作为优选实施方案，所述上样缓冲液为含有体积浓度为0.25
‑
0.5％tween 20的10mm pb溶液，优选为含有0.25％tween 20的10mm pb溶液。
16.本发明还提供所述的试剂盒在非诊断或治疗目的检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌中的应用。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
18.(1)层析试纸条法是最便捷、特异且易观察的结果判定法之一，在日常生活中经常被用于检测血糖和怀孕；量子点作为一种纳米材料，具有比传统的有机荧光染料高几十倍的荧光强度，量子点荧光微球(qdnbs)是由高质量的cdse/zns量子点和生物相容性高分子采用自组装的方式制备得到，通过纳米球包覆将量子点的荧光信号放大，可以明显提高免疫检测灵敏度，并且该荧光探针具有荧光信号稳定、胶体稳定性优、生物相容性高等特点被广泛应用。而且量子点荧光微球在经过一系列化学修饰后，可以与抗体等蛋白与小分子偶联，从而达到标记与检测的目的。本实验将rpa技术与量子点荧光微球试纸条方法结合起来，使其能够在一定条件下，通过恒温条件下基因的有效扩增，抗原抗体之间的特异性反应，短时间内即可得到检测结果，从而实现致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌从基因组的扩增到肉眼观察结果的恒温快速检测。
19.(2)本发明成功地将qdnbs与地高辛mcab偶联作为检测探针结合rpa对目的基因的有效扩增，建立鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的核酸检测试纸，检测方法最低检测限为9.6
×
103cfu/ml，所建立的标准曲线方程为：y＝0.144x
‑
0.5098，相关系数r2＝0.9863。
20.(3)本发明建立的检测方法无需使用大型仪器，适合于现场检测，并且该方法从基因组提取到肉眼观察结果的过程仅需要10min左右，这对于致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测具有重大意义。
附图说明
21.图1为实施例1中pcr扩增的凝胶电泳图，其中m：dl 2000dna marker；a、b、c、d、e、f：6对引物的扩增结果。
22.图2a为实施例1中a、e引物的rpa扩增凝胶电泳图，其中p表示阳性对照，n表示阴性对照。
23.图2b为实施例1中b、d引物的rpa扩增凝胶电泳图，其中p表示阳性对照，n表示阴性对照。
24.图3a为实施例2中qdnbs的电子显微镜透射图。
25.图3b为实施例2中qdnbs与qdnbs
‑
mcab的紫外吸收光谱图。
26.图3c为实施例2中qdnbs与qdnbs
‑
mcab的荧光光谱图。
27.图3d为实施例2中qdnbs与qdnbs
‑
mcab的简易试纸条示意图；其中，1：qdnbs
‑
mcab+上样缓冲液，2：qdnbs
‑
mcab+阳性扩增产物+上样缓冲液，3：上样缓冲液。
28.图4为实施例2中试纸条工作原理。
29.图5为实施例2中3个c线划膜浓度的试纸条荧光图。
30.图6为3个t线划膜浓度的试纸条荧光图；其中，p为阳性对照，n为阴性对照。
31.图7为t线与c线划膜浓度优化的试纸条荧光值结果图。
32.图8为含有不同浓度tween 20的10mm pb溶液作为上样缓冲液的试纸条荧光图。
33.图9为不同qdnbs
‑
mcab用量的试纸条荧光图；其中，p为阳性对照，n为阴性对照。
34.图10为不同qdnbs
‑
mcab用量的试纸条荧光值结果图。
35.图11为不同引物浓度扩增反应后的试纸条荧光图；其中，p为阳性对照，n为阴性对照。
36.图12为不同引物浓度扩增反应后的试纸条荧光值结果图。
37.图13为不同菌液浓度的电泳图和量子点试纸条荧光图；其中，m：dl 2000 dna marker，n：阴性对照。
38.图14为根据不同菌液浓度对应的荧光值绘制的标准曲线。
39.图15为各细菌的电泳图和量子点试纸条荧光图；其中，m：dl 2000dna marker；1：cmcc52225；2：bf50
‑
2；3：单核细胞增多性李斯特氏菌；4：副溶血弧菌；5：福氏志贺氏菌；6：金黄色葡萄球菌；7：沙门氏菌。
40.图16为不同细菌的试纸条荧光值结果图。
41.图17为三种菌液浓度重复性试验的试纸条荧光图。
42.图18为三种菌液浓度重复性试验的电泳图。
43.图19为三种菌液浓度重复性试验的试纸条荧光值结果图。
44.图20为实际样品检测的电泳图和试纸条荧光图；其中，m：dl 2000 dna marker；p：阳性对照；b1
‑
b5：牛肉样品；c1
‑
c3：鸡肉样品；m1：羊肉样品；p1
‑
p6：猪肉样品。
具体实施方式
45.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
46.主要菌株及样品：
47.致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌(pathogenic yersinia enterocolitica cmcc52225)、非致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌(non
‑
pathogenic yersinia enterocolitica bf50
‑
2)、单核细胞增多性李斯特氏菌(listeria monocytogenes)、副溶血弧菌(vibrio parahemolyticus)、福氏志贺氏菌(shigella flexneri)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、沙门氏菌(salmonella typhimurium)，以上菌种来自于本实验室保存。实际待检测样品来源于本地生鲜超市，共20份，其中猪肉8份、牛肉7份、鸡肉4份、羊肉1份。
48.主要仪器设备：
[0049][0050][0051]
主要试剂：
[0052][0053][0054]
主要试剂的配制：
[0055]
(1)25mm pbst(反应缓冲液)：称取氯化钠10g、十二水合磷酸氢二钠3.625g、氯化钾0.25g、磷酸二氢钾0.25g，溶于400ml蒸馏水，ph调节至6.4，加入100μl tween 20，定容至500ml，用0.22μm的滤器过滤除菌。
[0056]
(2)1％bsa(封闭液)：称取0.07g bsa，溶于7ml反应缓冲液，用0.22μm的滤器过滤除菌。
[0057]
(3)10mm edc.hcl(活化剂)：称取0.1g edc.hcl，溶于100ml反应缓冲液，用0.22μm的滤器过滤除菌。
[0058]
(4)保存液：称取0.3028g tris、0.45g氯化钠、0.5g bsa，溶于40ml反应缓冲液，ph调节至7.2，定容至50ml，用0.22μm的滤器过滤除菌。
[0059]
(5)10mm pb溶液：称取十二水合磷酸氢二钠1.43g、磷酸二氢钾0.136g，溶于400ml蒸馏水，ph调节到7.4，定容至500ml，用0.22μm的滤器过滤除菌。
[0060]
(6)划膜液：含5％蔗糖的10mm pb溶液。
[0061]
实施例1：引物设计与筛选
[0062]
引物设计：根据twistamp基础试剂盒的引物设计规则，以及genbank中ail(cp009846.1)基因的保守区域，利用oligo7.0软件设计出能够同时用于rpa与普通pcr的引物，并于ncbi进行blast以鉴定其特异性。本实验共设计了6对引物，均由上海生工合成，并将引物用ddh2o稀释，置于
‑
20℃分装保存(引物具体信息见表1)。
[0063]
表1
[0064][0065][0066]
基因组提取：将小肠结肠炎耶尔森氏菌菌种在cin
‑
1平板上划线复壮，其它菌种均在lb平板上划线复壮。挑取单菌落至lb液体培养基中，小肠结肠炎耶尔森氏菌于28℃培养8
‑
12h，其它菌落于37℃培养12
‑
16h。用细菌基因组提取试剂盒对菌液进行基因组的提取。为了达到省时、免离心的目的，采用碱裂解法提取样品中的基因组，即将1g匀浆肉与2ml0.5m naoh溶液混合，室温下静置3min左右，将上清视为扩增模板，分装后于
‑
20℃保存。
[0067]
引物筛选：首先通过普通pcr对引物进行初步筛选，再利用rpa进行复筛，最后将筛选出的最优引物上下游的5’末端分别标记生物素与地高辛。pcr反应体系与程序：总体系25μl，包括2
×
m5hiper plus taqhifi pcr mix 12.5μl，上、下游引物各1μl(10mm)，基因组模板2μl，其余用ddh2o补足。95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸2min。rpa反应体系与程序：总体积50μl，包括缓冲液29.5μl，ddh2o 11.2μl，上、下游引物各2.4μl(10mm)，基因组模板2μl，冻干酶颗粒1管，280mm醋酸镁(mgoac)2.5μl。反应条件为39℃，10min。上述扩增产物和用于分子标记的dl 2000 dna marker于2％的琼脂糖凝胶中120v电泳30min，并利用凝胶成像系统观察结果。
[0068]
引物筛选最重要的两个标准即扩增的特异性与灵敏性。首先用普通pcr方法对6对引物进行初步筛选，结果如图1所示，为pcr扩增的凝胶电泳图，其中m：dl 2000 dna marker；a、b、c、d、e、f：6对引物的扩增产物图。由于凝胶电泳图中显示引物d与e的扩增条带较宽较亮，引物a与b的扩增条带较干净无杂带，所以选择引物d、e、a和b进行rpa复筛，结果如图2a和图2b所示，为rpa扩增的凝胶电泳图，其中p表示阳性对照，n表示阴性对照。从图2a和图2b可知，只有引物e在对阴性模板的扩增结果中显示没有条带，而引物a、b和d均显示有条带和严重的抹带，也就是说这些引物特异性较差，因此选择引物e为最佳引物对，包括fe序列和re序列，其中fe的序列如seq id no.1所示，re的序列如seq id no.2所示。
[0069]
实施例2：rpa
‑
量子点试纸条的制备
[0070]
(1)qdnbs
‑
mcab的制备
[0071]
由于量子点荧光微球(qdnbs)表面有羧基官能团修饰，便于偶联抗体，因此利用碳二亚胺法将量子点与地高辛抗体进行偶联，具体步骤如下：将50μl qdnbs(10mg/ml)分散于200μl反应缓冲液，混匀，12000rpm离心10min弃掉上清，将沉淀重悬于250μl反应缓冲液，超声5min，加入edc活化剂(10mm edc.hcl)50μl，37℃于四维混匀仪中孵育30min，12000rpm离心10min弃掉上清(量子点的活化)；用反应缓冲液重悬沉淀至250μl，超声8min，加入地高辛抗体38.5μl(1.3mg/ml)，37℃于四维混匀仪中孵育30min，12000rpm离心10min弃掉上清(抗体的偶联)；加入封闭液250μl，超声5min，37℃于四维混匀仪中孵育30min，8000rpm离心8min弃掉上清(封闭)；加入250μl于保存液，重悬后，将得到的qdnbs
‑
mcab于4℃保存。
[0072]
为了探究qdnbs的形态结构与大小，采用透射电子显微镜对其进行表征，如图3a所示，为qdnbs的电子显微镜透射图。由图3a可知：qdnbs的粒径均在80
‑
100nm范围内。为了评价偶联效果，一方面，对qdnbs与qdnbs
‑
mcab进行紫外可见吸收光谱与荧光光谱的测定，并予以比较，另一方面，制作简易试纸条对其进行验证。如图3b所示，为qdnbs与qdnbs
‑
mcab的紫外吸收光谱图，图3b显示偶联后最大吸收峰对应的波长有所偏移。如图3c所示，为qdnbs与qdnbs
‑
mcab的荧光光谱图，图3c显示偶联后最大吸收峰对应的波长有所偏移。如图3d所示，为qdnbs与qdnbs
‑
mcab的简易试纸条示意图；其中，1：qdnbs
‑
mcab+上样缓冲液，2：qdnbs
‑
mcab+阳性扩增产物+上样缓冲液，3：上样缓冲液。图3d显示在3种样品溶液中，含有qdnbs
‑
mcab的试纸条有明显的荧光条带。上述结果均能够说明qdnbs与mcab偶联成功。
[0073]
(2)rpa
‑
量子点荧光微球试纸条的制备
[0074]
rpa
‑
量子点试纸条反应原理：利用rpa进行核酸扩增后，将qdnbs
‑
mcab、扩增产物和上样缓冲液混合，滴加至分别包被有链霉亲和素(t线)和羊抗鼠igg(c线)的试纸条上，反应5分钟后，如果有目的基因被扩增，其产物会标记有地高辛和生物素，因产物层析时会与t线上固定的链霉亲和素结合而被固定，使t线发出荧光，此时为阳性反应；如果没有扩增产物，t线就不会有荧光产生，此时为阴性反应，而作为质控线c，不管有无产物被扩增，则都会因量子点标记的地高辛抗体复合物与羊抗鼠igg的结合而被固定，从而发出荧光。参见图4，为试纸条工作原理。
[0075]
试纸条的组装：首先利用xyz三维点膜仪均匀地将t、c线划膜液分别划在硝酸纤维素膜(nc膜)上，37℃烘干30min，将nc膜(sartoriuscn95)裁剪成长度2.5cm、宽度1.6cm大小，并粘贴在pvc板中间，再将长度3cm、宽度1.6cm的吸水垫(h7)和样品垫(玻璃纤维垫rb65)分别粘贴在nc膜的两端(t线靠近样品垫，c线靠近吸水垫)，并与nc膜重叠2mm，最后将
制作好的试纸条按照4mm的宽度裁剪，于4℃密封保存。
[0076]
t线与c线划膜浓度的优化
[0077]
(1)c线划膜浓度的优化：用划膜液稀释羊抗鼠igg，使c线划膜浓度分别为1mg/ml、1.5mg/ml和2mg/ml，按照1μl/cm划膜后于37℃烘干30min，组装成试纸条，将qdnbs
‑
mcab与上样缓冲液混合后加至试纸条的上样垫，5min后观察c线的荧光，选取最优浓度。参见图5，为3个c线划膜浓度的试纸条荧光图。由图5可知：3个浓度所得到c线的荧光基本无差别，因此，为了节省试剂，选择1mg/ml为c线最优划膜浓度。
[0078]
(2)t线划膜浓度的优化：用划膜液稀释羊抗鼠igg与链霉亲和素，使c线划膜浓度为最优浓度1mg/ml，t线划膜浓度分别为0.5mg/ml、0.75mg/ml和1mg/ml，按照1μl/cm划膜后于37℃烘干30min，组装成试纸条，将qdnbs
‑
mcab、rpa扩增产物和上样缓冲液混合后加至试纸条的上样垫，5min后观察t、c线的荧光，并测定其荧光值，选取最优浓度。参见图6，为3个t线划膜浓度的试纸条荧光图；其中，p为阳性对照，n为阴性对照。参见图7，为t线与c线划膜浓度优化的试纸条荧光值结果图。由图6可知：t线划膜浓度为1.0mg/ml时，t与c线眼观荧光强度最强。但由图7的荧光值结果可知：t线划膜浓度为1.0mg/ml时，该浓度的阴性值(n)较高，该现象容易导致结果产生假阳性，也容易导致阳性值与阴性值的比值(p/n)偏低。因此最终选择0.5mg/ml为t线最优划膜浓度。
[0079]
上样缓冲液的优化
[0080]
表面活性剂(如tween 20等)能够增大膜的亲水性能，从而增强荧光信号强度和试纸条的灵敏度，但含量过多又会起到反作用。因此，对上样缓冲液的优化，主要是指对tween 20浓度的优化。首先分别配制含有0％、0.1％、0.25％、0.5％tween 20的10mm pb溶液作为上样缓冲液，选择上述最优t、c线划膜浓度，制作试纸条，再将qdnbs
‑
mcab、rpa阳性扩增产物和上样缓冲液混合后加至试纸条的上样垫，5min后观察t、c线的荧光，选取tween 20最优浓度。参见图8为含有不同浓度tween20的10mm pb溶液作为上样缓冲液的试纸条荧光图。由图8可知：当不含tween 20或其浓度过低时，不能很好的使qdnbs
‑
mcab向吸水垫处流动，因此从效果与节约角度考虑，选择含有0.25％tween 20的10mmpb溶液作为最优上样缓冲液。
[0081]
qdnbs
‑
mcab用量的优化
[0082]
由于上样混合物中qdnbs
‑
mcab的含量会影响量子点荧光微球的爬膜速度以及条带亮度，因此，在按照上述最优条件组装试纸条后，将rpa扩增产物、上样缓冲液以及不同量的qdnbs
‑
mcab(1μl、2μl、3μl)混合后加至试纸条的上样垫，5min后观察t、c线的荧光，并测定其荧光值，选取最优量。参见图9
‑
图10，图9为不同qdnbs
‑
mcab用量的试纸条荧光图；其中，p为阳性对照，n为阴性对照。图10为不同qdnbs
‑
mcab用量的试纸条荧光值结果图。由图9可知：当qdnbs
‑
mcab用量为2μl时，t与c线荧光(a)比用量为1μl时强，试纸条的背景比用量为3μl时干净。图10也显示qdnbs
‑
mcab用量为2μl时p/n值最高。因此，2μl是qdnbs
‑
mcab的最佳用量。
[0083]
引物浓度与rpa反应时间的优化
[0084]
由于rpa引物较长，在反应过程中容易产生非特异性扩增产物，进而使试纸条荧光背景增强，造成假阳性现象，所以应当通过优化引物浓度与反应时间来控制扩增产物的量。选择已被标记的最佳引物，将引物浓度分别稀释至0.03μm、0.06μm、0.12μm和0.24μm，在35℃
‑
36.5℃下反应5或10min。再将qdnbs
‑
mcab、rpa扩增产物和上样缓冲液混合后加至试纸
条的上样垫，5min后观察t、c线的荧光，并测定其荧光值，选择最优引物浓度与rpa反应时间。参见图11
‑
图12，图11为不同引物浓度扩增反应后的试纸条荧光图；其中，p为阳性对照，n为阴性对照。图12为不同引物浓度扩增反应后的试纸条荧光值结果图。由图11可知：引物浓度为0.12μm，反应时间为5min时，试纸条t与c线的荧光最强，阴性对照的t线处无荧光。图12也显示引物浓度为0.12μm，反应时间为5min时，p/n值最大，说明该反应条件使得结果既灵敏又特异。因此，选择引物浓度为0.12μm，反应时间为5min作为最佳反应条件。
[0085]
实施例3：rpa
‑
量子点荧光微球试纸条的检测性能
[0086]
rpa
‑
量子点试纸条灵敏度的确定
[0087]
对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的菌液进行平板计数，10倍倍比稀释后的菌液浓度分别为：9.6
×
108、9.6
×
107、9.6
×
106、9.6
×
105、9.6
×
104、9.6
×
103、9.6
×
102和9.6
×
101cfu/ml，提取上述菌液的基因组作为rpa模板进行扩增反应，再将qdnbs
‑
mcab、rpa扩增产物和上样缓冲液以优化好的参数值混合后加至试纸条的上样垫，5min后观察t、c线的荧光，测定其荧光值，并根据数据建立标准曲线。参见图13
‑
图14，图13为不同菌液浓度的电泳图和量子点试纸条荧光图；其中，m：dl 2000dna marker，n：阴性对照。图14为根据不同菌液浓度对应的荧光值绘制的标准曲线。由图13可知：rpa电泳图(a)中显示最低检测限为9.6
×
104cfu/ml，而量子点试纸条(b)显示最低检测限为9.6
×
103cfu/ml，说明量子点试纸条与rpa的结合，能够提高检测的灵敏度。图14绘制的标准曲线方程为：y＝0.144x
‑
0.5098，r2＝0.9863。
[0088]
rpa
‑
量子点试纸条特异性验证
[0089]
将致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌、非致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、副溶血弧菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌的基因组作为rpa模板进行扩增反应，再将qdnbs
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mcab、rpa扩增产物和上样缓冲液混合后加至试纸条的上样垫，5min后观察t、c线的荧光，并测定其荧光值。参见图15
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图16，图15为各细菌的电泳图和量子点试纸条荧光图；其中，m：dl 2000dnamarker；1：cmcc52225；2：bf50
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2；3：单核细胞增多性李斯特氏菌；4：副溶血弧菌；5：福氏志贺氏菌；6：金黄色葡萄球菌；7：沙门氏菌。图16为不同细菌的试纸条荧光值结果图。由图15可知：除了致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌(cmcc52225)之外，检测其他细菌的rpa电泳图(a)以及试纸条(b)的t线上均无条带或荧光。图16也显示除致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌外，其他细菌测定的荧光值接近于0，该结果表明所建立的方法特异性较好。
[0090]
rpa
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量子点试纸条重复性验证
[0091]
分别将致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌高、中、低浓度(9.6
×
108、9.6
×
106和9.6
×
103cfu/ml)的基因组作为rpa模板进行扩增反应，再将qdnbs
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mcab、rpa扩增产物和上样缓冲液混合后加至试纸条的上样垫，5min后观察t、c线的荧光，并测定其荧光值，每个反应重复3次。参见图17
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图19，图17为三种菌液浓度重复性试验的试纸条荧光图；图18为三种菌液浓度重复性试验的电泳图；图19为三种菌液浓度重复性试验的试纸条荧光值结果图。图17
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19对高、中、低浓度的重复性试验结果显示：rpa试纸条、电泳图以及荧光值的结果均显示该方法较为稳定，重复性较好。
[0092]
样品加标回收以及实际样品检测结果
[0093]
样品加标回收：对猪肉、牛肉以及鸡肉样品进行加标回收的结果如表2所示，牛肉
与猪肉样品的加标浓度为1.92
×
104cfu/ml时回收率较低(42.19％
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48.43％)，而其他加标浓度与鸡肉加标的回收率基本高于100％(92.71％
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108.85％)，这是因为1.92
×
104cfu/ml接近于方法的最低检测限，因而可能出现回收率低的现象；而大多数时候试纸条会存在一定的背景荧光值，因此回收率会高于100％，属于正常范围内。
[0094]
表2
[0095][0096]
实际样品检测：采用普通pcr和所建立的rpa
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量子点试纸条方法去检测同一批肉样品，参见图20，为实际样品检测的电泳图和试纸条荧光图；其中，m：dl 2000dna marker；p：阳性对照；b1
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b5：牛肉样品；c1
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c3：鸡肉样品；m1：羊肉样品；p1
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p6：猪肉样品。图20中的pcr电泳图(a)和试纸条(b)结果均显示：15份肉样品中，只有1份猪肉样品(p4)检测结果为阳性，其余样品均为阴性。表3为pcr电泳检测和rpa
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量子点试纸条检测的结果对比。根据表3可知：普通pcr检测方法与本发明建立的rpa
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量子点试纸条检测方法对于实际样品检测的结果一致，这初步说明rpa
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量子点试纸条检测方法是检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的可靠方法。
[0097]
表3
[0098][0099]
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。