新颖乳酸菌及其用于治疗或预防肝脏损伤相关疾病的用途的制作方法

1.本发明有关于益生菌及其用途，特别指一种新颖乳酸菌及其用于治疗或预防肝脏损伤相关疾病的用途。


背景技术：

2.肝脏为人体消化系统非常重要的一部分，具有吸收、代谢及免疫保护等功能。长期慢性的饮酒行为会影响身体代谢，使三酸甘油酯与胆固醇堆积在肝脏，进而形成脂肪肝或其他酒精性肝脏疾病。具体来说，根据研究指出，酒精代谢产物乙醇会改变肠道上皮细胞的通透性，增加肠道中细菌毒素生成量，如内毒素，进而诱发或加重肝脏疾病。
3.虽然脂肪肝对于人体健康不会造成立即性的危害，但是长久下来会使肝脏细胞产生损伤，并且会引发肝炎、肝脏纤维化、肝硬化或肝癌等无法逆转的疾病；而目前临床上未提供治疗脂肪肝的药物，仅能通过饮食习惯及生活习惯的改变控制或改善脂肪肝或其相关代谢疾病，但绝大多数患者无法长时间地改变生活或饮食习惯，导致脂肪肝在临床上的治疗呈现困难。
4.是以，开发一种能够有效地治疗或预防肝脏损伤相关疾病的组合物为目前医学研究的当务之急。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种新颖乳酸菌，其包含有戊糖片球菌 (pediococcus pentosaceus)ttl 3-14，及副干酪乳杆菌副干酪亚种(lactobacillusparacasei subsp.paracasei)ttl 6-2；而该新颖乳酸菌具有增加肝脏抗氧化酶活性及降低发炎因子的能力，以达到有效地预防或改善肝脏细胞受损或其相关疾病的功效，尤其是由酒精引发的肝脏疾病，如脂肪肝。
6.具体来说，戊糖片球菌(pediococcus pentosaceus)ttl 3-14，保藏信息为：保藏编号为dsm 33844；保藏日期日为2021年2月24日；保藏单位为：德国微生物保藏中心(dsmz)；保藏地点为德国。副干酪乳杆菌副干酪亚种(lactobacillusparacasei subsp.paracasei)ttl 6-2，保藏信息为：保藏编号为dsm 33845；保藏日期为2021年2月24日；保藏单位为：德国微生物保藏中心(dsmz)；地点为德国。
7.本发明的另一目的在于提供一种组合物，其包含有效量的本发明所提供新颖乳酸菌，而通过投予该组合物的一个体，能有效地改善或预防肝脏损伤、脂肪肝或与上述病征相关的疾病。
8.具体来说，在本发明的一实施例中所提供的组合物，其包含有至少一乳酸菌，而该乳酸菌为戊糖片球菌ttl 3-14或副干酪乳杆菌副干酪亚种ttl 6-2。
9.为能达到较佳的肝脏疾病预防或/及治疗功效，在本发明的另一实施例中，该组合物中包含有戊糖片球菌ttl 3-14及副干酪乳杆菌副干酪亚种ttl 6-2。
10.在本发明的另一实施例中该组合物包含有另一乳酸菌，其为植物乳酸杆菌植物亚
种ttl 8-16；较佳地，该组合物由戊糖片球菌ttl 3-14、副干酪乳杆菌副干酪亚种ttl 6-2及植物乳酸杆菌植物亚种ttl 8-16以等重量比混合而成。
11.在本发明的实施例中，该组合物可被制备为一食品或一营养补充品，并且可依据需求而被制备为不同剂型，例如粉剂、锭剂等。
12.在本发明另一实施例中提供本发明所提供新颖乳酸菌用于治疗或预防肝脏损伤相关疾病的用途，意即当投予有效量的本发明所提供新颖乳酸菌或含有其的组合物至一个体时，能够有效地达到预防或/及治疗酒精性肝损伤或其相关疾病的功效。
13.其中，该酒精性肝损伤为脂肪肝。
14.其中，该组合物为一肝脏抗氧化酶活性促进剂，能够提升谷胱甘肽及谷胱甘肽过氧化酶的活性，强化肝脏抗氧化的能力，以达到避免或改善肝脏组织受损的功效。
15.本发明的有益效果在于：
16.本发明提供一种新颖乳酸菌，该新颖乳酸菌具有增加肝脏抗氧化酶活性及降低发炎因子的能力，以达到有效地预防或改善肝脏细胞受损或其相关疾病的功效，尤其是由酒精引发的肝脏疾病，如脂肪肝。
附图说明
17.图1为各组hepg2细胞经不同处理后所检测分析出的ast相对清除率。
18.图2为各组hepg2细胞经不同处理后所检测分析出的alt相对清除率。
19.图3为纪录各组小鼠在试验第0、2、4、6、8周体重变化的结果。
20.图4为纪录各组小鼠在试验第0、2、4、6、8周血清中ast活性的结果。
21.图5为纪录各组小鼠在试验第0、2、4、6、8周血清中alt活性的结果。
22.图6为纪录各组小鼠在试验第0、2、4、6、8周血清中胆固醇含量的结果。
23.图7为纪录各组小鼠在试验第0、2、4、6、8周血清中三酸甘油酯含量的结果。
24.图8为检测各组小鼠肝脏中三酸甘油酯含量的结果。
25.图9为检测各组小鼠肝脏中谷胱甘肽活性的结果。
26.图10为检测各组小鼠肝脏中谷胱甘肽过氧化酶活性的结果。
27.图11为第1组小鼠肝脏组织切片h&e染色的结果。
28.图12为第2组小鼠肝脏组织切片h&e染色的结果。
29.图13为第3组小鼠肝脏组织切片h&e染色的结果。
30.图14为第4组小鼠肝脏组织切片h&e染色的结果。
31.图15为第5组小鼠肝脏组织切片h&e染色的结果。
32.图16为第6组小鼠肝脏组织切片h&e染色的结果。
具体实施方式
33.本发明所提供新颖乳酸菌，包含菌株ttl 3-14及菌株ttl 6-2，分离自谷类来源，具有益生菌基本特性，如耐酸、耐胆盐、具肠道上皮细胞吸附力等，不会对生物体产生危害；其中：
34.菌株ttl 3-14的保藏编号为dsm 33844；保藏日期日为2021年2月24日；保藏单位为：德国微生物保藏中心(dsmz)；而菌株ttl 3-14为革兰氏阳性球菌，不具触酶、氧化酶及
运动特性，不会产生内孢子，在好氧及厌氧下皆能生长。
35.菌株ttl 6-2的保藏编号为dsm 33845；保藏日期为2021年2月24日；德国微生物保藏中心(dsmz)；而菌株ttl 6-2为革兰氏阳性杆菌，不具触酶、氧化酶及运动特性，不会产生内孢子，在好氧及厌氧下皆能生长。
36.本发明所提供菌株ttl 3-14及菌株ttl 6-2可培养于下列条件：培养基为含 0.05％l-cysteine的乳酸菌mrs培养基(lactobacilli mrs broth，bd，difco，usa)， 37℃下培养16小时；培养后的保存条件为：含15％甘油的mrs培养基(mrsbroth)、-80℃的环境下。
37.本发明所称“菌株ttl 3-14”，为保藏编号为dsm 33844的戊糖片球菌 (pediococcus pentosaceus)ttl 3-14。
38.本发明所称“菌株ttl 6-2”，为保藏编号为dsm 33845的副干酪乳杆菌副干酪亚种(lactobacillus paracasei subsp.paracasei)ttl 6-2。
39.本发明所称“菌株ttl 8-16”，为植物乳酸杆菌植物亚种(lactobacillusplantarum subsp.plantarum)ttl 8-16；保藏单位为德国微生物保藏中心 (dsmz)，保藏日期为2020年4月23日，保藏编号：dsm33508，保藏地址为德国；更进一步来说，ttl 8-16菌株为革兰氏阳性杆菌，不具触酶、氧化酶及运动性，不会产生内孢子，在好氧及厌氧环境下皆能生长。
40.本发明所称“乳酸菌组合物”，指将培养后的菌株ttl 3-14、菌株ttl 6-2 及菌株ttl 8-16，以重量等比(1：1：1)的比例混合而成，其中，在混合前各该菌株可先以无菌磷酸盐缓冲液进行清洗。
41.本发明所称“有效量”一词指要产生所求特定效果所需化合物或活性成份的量，可以其在组合物中所占重量百分比表示。如同本发明所属技术领域技术人员所了解，该有效量会因为欲引起特定效果的投予方式而有所不同。一般来说，活性成分或化合物在组合物中的量可占该组合物重量的约1％至约100％，较佳为约30％至约100％。
42.以下，为能更进一步说明本发明的技术特征及其功效，将兹举若干实施例并搭配图表作详细说明如后。
43.以下实施例中所使用的菌株分别保存在含15％甘油的mrs broth，保存于
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80℃。菌株活化两次，培养基为含0.05％l-cysteine的lactobacilli mrs broth (bd,difco,usa)，培养条件为37℃培养24小时。
44.以下实施例使用的人类肝癌细胞c3a(hepg2/c3a)(保藏编号：bcrc 60177)及小鼠巨噬细胞raw264.7作为实验细胞，其中所使用的人类肝癌细胞 c3a(hepg2/c3a)保藏编号：bcrc 60177)与小鼠巨噬细胞raw264.7(保藏编号：bcrc 60001)，皆为本领域的技术人员能够简单购得的细胞株，本发明购自食品工业研究所生物资源保存及研究中心(中国台湾)。
45.实施例一：体外抗发炎试验
46.将人类肝癌细胞c3a(下称hepg2细胞)及小鼠巨噬细胞raw264.7(下称 raw264.7细胞)分别在24孔盘中进行培养，每孔中hepg2细胞的细胞量为2x 105cell/well及raw264.7细胞的细胞量为1x 105cell/well，待细胞生长至80％时，分别以磷酸盐缓冲液清洗后，加入新的培养基，再加入100μl内毒素脂多糖(lps， 100ng/ml)以及100μl的乳酸菌菌液，菌数量为109cfu/ml，而后在二氧化碳培养箱中培养24小时，收集各孔细胞上清液。
47.将由raw264.7细胞收集而得的上清液以市售酶连结免疫分析套组 (enzyme-linked immunosorbent assay kit elisa，购自biolegend)检测tnf-α及il-6的含量；并将由hepg2细胞收集而得的上清液以市售酶连结免疫分析套组 (bd opteia set human il-8，购自bd biosciences)检测il-8的含量，结果如下表1所示，其中，空白组为未加入lps及乳酸菌菌液，lps组为未加入乳酸菌菌液。
48.表1：各乳酸菌抗发炎结果
49.组别tnf-α(pg/ml)il-6(pg/ml)il-8(pg/ml)空白组273.693.18118.22lps组(100ng)469.03818.16153.39菌株ttl 3-141.734.041.09菌株ttl 6-21.494.340.88菌株ttl 8-161.434.3412.51
50.由表1的结果可知，菌株ttl 3-14、菌株ttl 6-2及菌株ttl 8-16都能够降低tnf-α及il-6，但对于hep g2细胞经lps刺激产生发炎激素：il-8来说，仅有菌株ttl 3-14、菌株ttl 6-2能够达到明显较佳的抑制功效。
51.由于hep g2细胞经lps刺激后并不会产生il-6、tnf-α及ifn-γ等发炎因子，而会大幅产生il-8，因此，由上表1可清楚得知，本发明所提供菌株ttl 3-14及菌株ttl 6-2不仅能够抑制体内的发炎反应，对于肝脏发炎反应亦有良好治疗或预防的功效。
52.实施例二：体外酒精耐受性试验
53.分别取菌株ttl 3-14、菌株ttl 6-2、菌株ttl 8-16，活化后培养16小时，再取培养后的菌液100μl，分别接种至不含酒精的4ml mrs培养基(mrsbroth)、含最终酒精浓度为1％、5％、10％、15％及20％的4ml mrs培养基中，再在37℃下培养16小时，而后将培养后的菌液经序列稀释，以平板计数方式计算其菌数量，结果如下表2所示。
54.表2：各乳酸菌进行酒精耐受性试验后所得的菌数
[0055][0056]
由上表2的结果可知，本发明所提供菌株ttl 3-14及菌株ttl 6-2都能在高浓度酒精的环境下存活，其中，又以菌株ttl 6-2对于酒精的耐受性较佳，意即能在含有浓度为20％以上酒精的环境下生存。
[0057]
实施例三：体外酒精性肝损伤生化指标的检测
[0058]
将hepg2细胞以2x 105cell/well接种至24孔盘，当细胞生长至80％时，以磷酸盐缓冲液清洗后，再将培养基更换为不含fbs的mem培养基，并进行分组而以不同条件处理，其中：
[0059]
空白组添加1ml培养基；
14及/或菌株ttl 6-2具有对于酒精所造成的肝脏损伤或肝脏疾病有特异性的治疗或预防效果，意即投予有效量的本发明所提供菌株ttl 3-14 及/或菌株ttl 6-2至具有饮酒习惯的受试者时，能达到有效地改善或预防酒精性肝脏损伤或肝脏疾病的功效。
[0077]
又，虽然由图6的结果可知各组小鼠血清中的总胆固醇含量没有明显变化，但由图7的结果可知，在试验第4周时，相较于第2组小鼠，第3组及第4组小鼠血清中三酸甘油脂含量明显降低(p＜0.05)，分别下降28.9及22.7％，且下降的效果能够持续维持至试验结束(第8周)；更进一步来说，在试验第4周时，第5 组小鼠血清中三酸甘油脂含量下降幅度最佳，相较于第3或4组小鼠来说，约下降44.8％，而第6组小鼠血清中三酸甘油脂含量下降幅度约为23.9％；在试验第4 周后，除第2组小鼠外，各组小鼠血清中三酸甘油脂含量几乎与第1组(空白组) 小鼠无差异，并在试验第8周时，第5组及第6组小鼠血清中三酸甘油脂含量仍持续降低，分别较第2组小鼠血清中的三酸甘油脂下降约35.4％及34.4％，彼此间具有显着差异(p＜0.05)。换言之，由图7的结果显示，在酒精饮食下，本发明所提供菌株ttl 8-16及/或菌株ttl 3-14及/或菌株ttl 6-2能够持续及有效地降低血清中三酸甘油酯的含量，以能达到预防或治疗因酒精引发的血管病变的功效。
[0078]
实施例五：肝脏内三酸甘油酯含量的检测
[0079]
取实施例一中试验完成的各组小鼠的肝脏组织，分别进行均质离心后，取其上清液，加入调制好的三酸甘油酯酶试剂(triglyceride enzyme mixture)，反应后测定od530-550nm吸光值，将所得到的od值减去标准品(0mg/dl)的 od值，再通过所绘制出标准曲线的线性回归分析计算出各组小鼠肝脏内三酸甘油酯含量，结果如图8所示。
[0080]
由图8的结果可知，8周后相较于第1组小鼠，第2组小鼠肝脏中三酸甘油脂含量明显增加，意即酒精饮食确实会导致肝脏脂肪堆积，并会诱发脂肪肝的发生；而相较于第2组小鼠，第3组至第6组小鼠肝脏中三酸甘油脂含量明显下降，分别降低49.8％、53.7％、45.9％以及47.2％。
[0081]
由此结果可知，本发明所提供菌株ttl 3-14及/或菌株ttl 6-2确实能够避免酒精饮食下的三酸甘油酯累积于肝脏组织中，并且如果持续投予有效量的本发明所提供菌株ttl 3-14及/或菌株ttl 6-2至有饮酒习惯的个体，能够使其肝脏中三酸甘油酯含量维持与未有饮酒习惯者相近。
[0082]
实施例六：肝脏内抗氧化酶表现量的检测
[0083]
取实施例一中试验完成的各组小鼠的肝脏组织，分别进行均质离心后，取其上清液，再以市售分析套组(quantichromtm glutathione assay kit及 enzychromtm glutathione peroxidase assay kit)分别检测各组小鼠肝脏组织中谷胱甘肽(glutathione，gsh)及谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase， gpx)活性的表现，结果如图9及图10所示。
[0084]
由图9的结果可知，8周后第5组小鼠肝脏中谷胱甘肽含量与第1组小鼠无明显差异(p＞0.05)；第2组小鼠肝脏中谷胱甘肽含量明显高于第1组小鼠(p＜ 0.05)，但与第6组小鼠间无明显差异存在(p＞0.05)；而相较于第2组小鼠来说，第3组及第4组小鼠肝脏中谷胱甘肽含量明显上升37％及35％(p＜0.05)；而基于谷胱甘肽为生物体中的抗氧化物质，故由此结果显示，本发明所提供菌株ttl 3-14及/或菌株ttl 6-2确实为能够提升肝脏抗氧化能力的特殊乳酸菌株，意即在酒精饮食下，将有效量本发明所提供菌株ttl 3-14及/或菌株
ttl 6-2投予至个体时，能有效地提升个体肝脏内谷胱甘肽，达到增加个体抗氧化能力的功效。
[0085]
再者，由图10的结果可知，8周后相较于第1组小鼠来说，第2组小鼠肝脏内谷胱甘肽过氧化酶酶活性下降31.9％；而相较于第2组小鼠来说，第3组至第6组小鼠肝脏内谷胱甘肽过氧化酶酶活性虽皆有上升(分别增加30.6％、31.6％、 16.9％以及58.4％)，但第5组小鼠肝脏中谷胱甘肽过氧化酶酶活性上升程度不佳，显示投予菌株ttl 8-16对于个体肝脏抗氧化能力的提升效果有限，而是投予本发明所提供菌株ttl 3-14及/或菌株ttl 6-2确实能够增加肝脏内谷胱甘肽过氧化酶酶活性。
[0086]
由图9及图10的结果显示，本发明所提供菌株ttl 3-14及/或菌株ttl 6-2为具提升肝脏抗氧化能力的特异性乳酸菌，意即投予有效量的菌株ttl 3-14及/或菌株ttl 6-2至有饮酒习惯的个体，能够通过提升肝脏中抗氧化活性物质及/或抗氧化酶，达到避免或改善肝脏损害或酒精引发的肝脏相关疾病的功效。
[0087]
实施例五：肝脏组织切片染色结果
[0088]
取实施例一中试验完成的各组小鼠的肝脏组织，分别以石蜡包埋切片后进行h&e染色，结果如图11至图16所示。
[0089]
由图11可知，第1组小鼠肝脏切片中未发现明显的脂肪油滴堆积，并细胞核都非常完整；由图12可知，第2组小鼠肝脏切片中具有明显脂肪油滴堆积相当明显，显示长期投予酒精确实会造成脂肪累积在肝脏，产生脂肪肝的病征；由图 13至图16所示的第3组至第6组的结果可知，投予不同乳酸菌或是乳酸菌组合物能够使肝脏中脂肪油滴缩小，减少脂肪累积在肝脏中，并且避免肝脏细胞被破坏，而比较第3组至第6组的肝脏组织切片染色的结果，显示投予本发明所提供 ttl 3-14菌株可更有效地避免脂肪堆积于肝脏组织。
[0090]
由上述结果可知，在酒精饮食下，本发明所提供菌株ttl 3-14及/或菌株ttl 6-2能够避免或改善脂肪堆积于肝脏的情形，并且能够保护肝脏细胞受损，维持细胞完整性；换言之，投予有效量的本发明所提供菌株ttl 3-14及/或菌株ttl 6-2至个体时，能够有效地达到预防或治疗脂肪肝或其相关病症的功效。