一种暹罗芽孢杆菌、菌剂、萃取物及其应用

本发明涉及生物菌剂技术领域，具体涉及一种暹罗芽孢杆菌、菌剂、萃取物及其应用。

背景技术：

马铃薯是全球第四大重要粮食作物，而在贮藏过程中，容易被马铃薯晚疫病、马铃薯黑痣病、马铃薯枯萎病、马铃薯干腐病、马铃薯早疫病、马铃薯癌肿病、马铃薯银腐病、马铃薯黄萎病、马铃薯粉痂病等多种病害侵袭。其中，马铃薯干腐病是马铃薯贮藏期主要的真菌性病害之一，其由多种镰刀菌（fusariumspp.）引起，尤其是镰刀菌中的真菌青9a-2-6(fusariumtricinctum)、青9a-5-7（fusariumequiseti）、青9a-5-10（fusariumincarnatum）和9a-4-13（fusariumacuminatum）。据统计，每年由马铃薯干腐病造成的产量损失为6%~25%，最高可达60%。目前对该病害以化学防治为主，常用的药剂有苯醚甲环唑·嘧菌酯、霜脲·锰锌、戊唑醇等，但长期使用化学药剂防治，存在菌株抗药性增强、环境污染和农药残留等问题。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明首先提供一种暹罗芽孢杆菌，其名称为暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis）jz1-4-10。

本发明提供的暹罗芽孢杆菌于2020年10月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：gdmccno：61236。

本发明提供的暹罗芽孢杆菌筛选自青稞白酒糟醅。

为解决上述问题，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包含本发明所述的暹罗芽孢杆菌jz1-4-10。

本发明所述菌剂的制备方法包括培养本发明提供的暹罗芽孢杆菌，并添加相应的辅料制备成菌剂。

为解决上述问题，本发明还提供了一种本发明所述暹罗芽孢杆菌发酵液的萃取物，所述萃取物通过将本发明所述暹罗芽孢杆菌培养获得发酵液，然后用有机溶剂对所述发酵液进行萃取获得。

具体为：将暹罗芽孢杆菌jz1-4-10菌株接种至atcc213改良液体培养基中培养5～7d，收获发酵液，然后过滤去除菌体，得到去菌体发酵液。

取发酵液600ml置于3000ml分液漏斗中，依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇对发酵液进行萃取，萃取液经旋转蒸发获得萃取物。

本发明提供的暹罗芽孢杆菌、包含暹罗芽孢杆菌的菌剂以及本发明的暹罗芽孢杆菌发酵液萃取物均可以用于镰刀菌的抑制，所述镰刀菌包括但不限于青9a-2-6(fusariumtricinctum)、青9a-5-7（fusariumequiseti）、青9a-5-10（fusariumincarnatum）和/或9a-4-13（fusariumacuminatum）中的应用。

为解决上述问题，本发明还提供一种本发明所述暹罗芽孢杆菌、包含暹罗芽孢杆菌的菌剂以及本发明的暹罗芽孢杆菌发酵液萃取物在防治青9a-2-6(fusariumtricinctum)、青9a-5-7（fusariumequiseti）、青9a-5-10（fusariumincarnatum）和/或9a-4-13（fusariumacuminatum）所致干腐病中的应用。

青9a-2-6(fusariumtricinctum)、青9a-5-7（fusariumequiseti）、青9a-5-10（fusariumincarnatum）和/或9a-4-13（fusariumacuminatum）引起的干腐病包括但不限于马铃薯干腐病。

进一步地，所述干腐病为马铃薯干腐病。

生物保藏说明：

生物材料的分类命名：暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis）；

生物材料的菌株编号：jz1-4-10；

生物材料的保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心；

生物材料的保藏单位简称：gdmcc；

保藏材料的保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；

生物材料的保藏日期：2020年10月15日；

生物材料的保藏中心登记入册编号：gdmccno：61236。

本发明的有益效果：

本发明提供的暹罗芽孢杆菌、包含暹罗芽孢杆菌的菌剂以及暹罗芽孢杆菌发酵液萃取物能够有效抑制引起马铃薯干腐病的镰刀菌，尤其对青9a-2-6(fusariumtricinctum)、青9a-5-7（fusariumequiseti）、青9a-5-10（fusariumincarnatum）和/或9a-4-13（fusariumacuminatum）抑制效果显著，暹罗芽孢杆菌对青9a-2-6的抑制率可以达到74.12%；暹罗芽孢杆菌发酵液乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对镰刀菌青9a-2-6的抑制率分别高达77.34%和78.00%，乙酸乙酯和正丁醇萃取物对病原菌青9a-4-13的抑制率达66.50%和58.00%，正丁醇萃取物对青9a-5-7的抑制率为72.50%，乙酸乙酯提取物对青9a-4-13的抑制率为66.50%。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例的暹罗芽孢杆菌jz1-4-10的系统发育树；

图2为本发明实施例的暹罗芽孢杆菌jz1-4-10对马铃薯病原真菌青9a-2-6的抑制作用图；

图3为本发明实施例的暹罗芽孢杆菌jz1-4-10对马铃薯病原真菌青9a-5-7的抑制作用图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例所用菌株包括：马铃薯干腐病病原真菌青9a-2-6(fusariumtricinctum)、青9a-5-7（fusariumequiseti）、青9a-5-10（fusariumincarnatum）和9a-4-13（fusariumacuminatum），所述病原真菌分离自马铃薯青薯9号薯块病样；暹罗芽孢杆菌jz1-4-10菌株，分离自青稞白酒糟醅，菌株均纯化后保存于青海省农林科学院生物技术研究所微生物实验室，4℃冰箱保存。

本发明实施例采用的培养基包括马铃薯葡萄糖培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。

马铃薯葡萄糖培养基包括：马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂15g、蒸馏水1000ml。

牛肉膏蛋白胨培养基包括：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调节ph至7.0～7.2。

所使用的仪器包括：电子天平购自梅特勒-托利多仪器有限公司、高压蒸汽灭菌锅购自华粤企业集团有限公司、电热恒温干燥箱购自上海齐欣科学仪器有限公司、生化培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司、全温摇瓶柜购自常州金坛精达仪器制造有限公司。

实施例1

本申请的暹罗芽孢杆菌的活化：

将保存的分离自青稞白酒糟醅的暹罗芽孢杆菌jz1-4-10菌株从4℃冰箱取出，接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养48h，备用。

本申请的暹罗芽孢杆菌的鉴定：

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》（第九版）和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株jz1-4-10分别进行葡萄糖氧化发酵，柠檬酸盐利用，接触酶，糖、醇类发酵，石蕊牛奶测试，明胶液化，甲基红(m.r)，硝酸盐还原，v-p测定以及o-硝基苯-β-d吡喃半乳糖苷酶(onpg)测定等试验，结果见表1。

表1暹罗芽孢杆菌jz1-4-10的生理生化特征

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

由表1可知，菌株jz1-4-10可使明胶液化，石蕊牛乳凝固，可利用蔗糖、麦芽糖及柠檬酸，有氧或无氧分子均参与分解葡萄糖，可以产生onpg，而接触酶试验和v-p试验均呈阴性。菌株jz1-4-10不能利用甘露醇，甲基红实验呈阴性，硝酸盐还原呈阳性。

暹罗芽孢杆菌的分子生物学鉴定：

采用上海生工生物工程（上海）股份有限公司的柱式细菌dna提取试剂盒对本申请的暹罗芽孢杆菌jz1-4-10的dna进行程序提取。选择通用的细菌16srdna引物f27(5′-agagtttgatcctggctcagg-3′)和p1541(5′-aaggaggtggtgatccagccgca-3′)。pcr扩增体系为：10×buffer2.5μl，dntp(10mmol·l^-1)2μl，模板dna1μl，引物各1μl，taqdna聚合酶0.2μl，蒸馏水补足至25μl。

pcr反应条件如下：94℃变性5min；变性94℃变性40s，退火55℃复性45s，72℃延伸80s，35个循环；72℃再延伸10min。反应结束后，取5μlpcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物送至上海生工生物工程公司测序，获得暹罗芽孢杆菌的核苷酸序列如seqidno：1所示。

将得到的16srdna序列在网站https://www.ezbiocloud.net/上与数据库中已知的16srdna序列进行比对，并下载与暹罗芽孢杆菌jz1-4-10的16srdna序列同源性大于95%的序列，使用mega（7.0）软件，根据neighbor-joining方法构建系统发育树，如图1所示。结果表明，菌株jz1-4-10与暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis）聚类同一分支，亲缘关系最近，相似度高达99.58%，结合暹罗芽孢杆菌jz1-4-10的生理生化特征和16srdna序列分析结果，最终将菌株jz1-4-10鉴定为暹罗芽孢杆菌（bacillussiamensis）。

实施例2

活性菌株的筛选及稳定性评价：

采用平板对峙法在直径为9cm的培养皿边缘2cm处的一侧点接分离自青稞白酒糟醅的暹罗芽孢杆菌菌株，相对的另一侧分别接种直径5mm的病原真菌青9a-2-6(fusariumtricinctum)、青9a-5-7（fusariumequiseti）、青9a-5-10（fusariumincarnatum）和9a-4-13（fusariumacuminatum），每个病原真菌重复处理3次，以只接病原真菌的处理作为对照。置于28℃生化培养箱中培养7d，观察分离自青稞白酒糟醅的菌株与病原真菌之间有无抑菌带出现，，测量菌落直径，计算抑菌率，计算公式如下：

抑制率（%）=[(对照菌落直径–处理菌落直径)/对照菌落直径]×100

结果如表2和图2、图3所示。

表2暹罗芽孢杆菌jz1-4-10抑制镰刀菌的活性

注：表中数值为平均值±标准差，同一列数据后不同小写字母代表在p<0.05水平差异显著。

本发明为了确定活性菌株的稳定性，将初筛得到的有抑菌活性的菌株进行稳定性评价，方法同上。分别将本申请的暹罗芽孢杆菌和镰刀菌对峙培养7d和14d后，测量抑菌带宽度，计算14d时抑菌带宽度缩小率（vf），比较暹罗芽孢杆菌对各种镰刀菌的抑制稳定性。

稳定评价标准为：“--”：vf≥70%，不稳定；“-”：50%≤vf＜70%，较不稳定；“+”：20%≤vf＜50%，较稳定；“++”：vf＜20%，稳定。计算公式如下：

vf（%）=[(7d抑菌带宽度值-14d抑菌带宽度值)/7d抑菌宽带值]×100

结果如表3所示：

表3暹罗芽孢杆菌jz1-4-10对病原菌抑制作用的稳定性

从表3可以看出，本申请的暹罗芽孢杆菌jz1-4-10菌株对马铃薯镰刀菌青9a-2-6、青9a-5-7和青9a-5-10的抑菌作用稳定，稳定性为“++”；对青9a-4-13的抑菌作用较稳定，稳定性为“+”。

暹罗芽孢杆菌jz1-4-10对马铃薯干腐病的防治效果测定

首先将活化后的暹罗芽孢杆菌jz1-4-10接种于atcc213改良液体培养基中，在37℃、200r·min^-1的摇瓶柜中震荡培养2d，收获发酵液。用血球计数板将jz1-4-10菌株发酵液的浓度调整到1.0×10⁸cfu·ml^-1；将4种引起马铃薯干腐病的上述镰刀菌分别接种于pda液体培养基中，在28℃、200r·min^-1的摇瓶柜中震荡培养2d，收获发酵液。用血球计数板分别将4种镰刀菌发酵液的孢子浓度调整为1.0×10⁷个·ml^-1。然后在已消毒处理的马铃薯上用直径为5mm的打孔器打2个深3mm的孔口。每个孔口先接入40μl一种镰刀菌发酵液，随后接入40μl暹罗芽孢杆菌发酵液作为实验组。将接种完成的马铃薯用封口膜包扎放入自封袋中，并在28℃、相对湿度75%左右的恒温培养箱中培养14d。以接镰刀菌发酵液和等量无菌水的处理作为阳性对照；以接等量无菌水和暹罗芽孢杆菌发酵液的处理作为阴性对照，以只接等量无菌水的处理为空白对照。每个处理接种一个马铃薯，重复3次。

培养14d后，分别测定发酵液和萃取物溶液处理下马铃薯块茎的坏果率、病斑深度以及抑制率，抑制率计算公式如下。

抑制率(%)=lp-la/lp*100%。

其中，lp为空白对照组的马铃薯块茎质量-阳性对照组的马铃薯块茎质量，la为阴性对照组马铃薯块茎质量-实验组马铃薯块茎质量。结果见表4，

表4暹罗芽孢杆菌jz1-4-10对镰刀菌的抑制效果

从表中可以看出，jz1-4-10发酵液对4种镰刀菌的抑制活性从高到低分别为青9a-2-6、青9a-5-7、青9a-4-13和青9a-5-10。其中jz1-4-10发酵液对镰刀菌青9a-2-6的坏果率为0.78%，病斑深度为0.69cm，抑制率达75.33%；对青9a-5-7的坏果率为0.35%，病斑深度为0.89cm，抑制率达66.15%；对青9a-4-13的坏果率为0.62%，病斑深度为0.93cm，抑制率为60.85%；对青9a-5-10的坏果率为0.49%，病斑深度为1.25cm，抑制率达43.26%。

实施例3

暹罗芽孢杆菌jz1-4-10发酵液及其萃取物的制备：

将暹罗芽孢杆jz1-4-10菌株接种至装瓶量为400ml的atcc213改良液体培养基中，置于37℃，180r·min^-1恒温摇瓶柜中振荡培养5～7d，收获发酵液，然后将其经布氏漏斗减压过滤去除菌体，得到去菌体发酵液，备用。

取上述去菌体发酵液600ml置于3000ml分液漏斗中，依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇对发酵液进行萃取，萃取液经旋转蒸发得萃取物；将萃取物用无菌水分别配成质量浓度为1.00、5.00、10.00和20.00mg·ml^-1的萃取物溶液，溶液经0.22μm微孔滤膜抽滤，备用。

采用与实施例2中发酵液相同的方法来验证发酵液萃取物对马铃薯干腐病病原菌的抑制效果，结果见表5。

表5暹罗芽孢杆菌jz1-4-10萃取物对马铃薯干腐病病原菌的抑制效果

由表5可知，jz1-4-10菌株发酵液的正丁醇萃取物对4种引起马铃薯干腐病的镰刀菌的抑制活性最高，乙酸乙酯萃取物活性次之，氯仿萃取物活性最低。其中，正丁醇萃取物在10mg·ml^-1的供试浓度下，对镰刀菌青9a-2-6的抑制率高达70.25%；在20mg·ml^-1的供试浓度下，对镰刀菌青9a-2-6和青9a-5-7的抑制率分别高达78.00%和72.5%；对镰刀菌青9a-4-13的抑制率为58.00%。乙酸乙酯萃取物在10mg·ml^-1的供试浓度下，对病原菌青9a-2-6的抑制率为56.00%；在20mg·ml^-1的供试浓度下，对病原菌青9a-2-6和青9a-4-13的抑制率分别高达77.34%和66.50%。

10mg·ml^-1和20mg·ml^-1的乙酸乙酯萃取物及所有供试浓度下的正丁醇萃取物对病原菌青9a-2-6的抑制作用均较强，抑制率范围为56.00%-78.00%。仅20mg·ml^-1的正丁醇萃取物对病原菌青9a-5-7的抑制作用较强，抑制率高达72.50%。仅20mg·ml^-1的乙酸乙酯和正丁醇萃取物对病原菌青9a-4-13的抑制作用较强，抑制率达66.50%和58.00%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>青海省农林科学院

<120>一种暹罗芽孢杆菌、菌剂、萃取物及其应用

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1414

<212>dna

<213>暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)

<400>1

gcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaac60

acgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggat120

ggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatgg180

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