一种特异性识别IL3Rα蛋白的核酸适配体、衍生物、应用、试剂盒及检测芯片的制作方法

一种特异性识别il3r
α
蛋白的核酸适配体、衍生物、应用、试剂盒及检测芯片
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种特异性识别il3rα蛋白的核酸适配体、衍生物、应用、试剂盒及检测芯片。


背景技术：

2.il3rα蛋白是未分化白血病干细胞的特异标志，与急性白血病患者治疗后的高残留病灶呈正相关，提示不良预后。以il3rα蛋白为靶点，有可能成为选择性清除急性粒细胞性白血病细胞的有前景的治疗策略。
3.核酸适配体是指利用指数富集的配体进化技术(selex)从特定的寡核苷酸库中筛选出的能与靶分子特异性结合寡核苷酸(dna或rna)。将一个具有带有20nt-80nt随机碱基的核苷酸序列文库与靶蛋白混合后，经过重复的筛选，扩增，分离纯化后，最终通过测序及鉴定得到靶蛋白的高特异性、高亲和力配体。
4.核酸适配体相比抗体具有如下优势：一、适配体由dna或rna构成，比蛋白质体积更小，经selex筛选富集后，可以拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度的同时具有较好的组织穿透性和免疫原性；二、适配体的目标靶范围广，包括离子、小分子、多肽、蛋白质、细胞、组织切片等；三、适配体更易于制备，可通过化学合成制备、改造与标记，可在体外筛选，可高通量获得。
5.但是现有技术中并没有能与il3rα蛋白特异性结合的核酸适配体。


技术实现要素：

6.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种特异性识别il3rα蛋白的核酸适配体，用于解决现有技术中没有能与il3rα蛋白特异性结合的核酸适配体的问题，同时，本发明还将提供一种特异性识别il3rα蛋白的核酸适配体衍生物；此外，本发明还将提供核酸适配体或核酸适配体衍生物在捕获、纯化、检测il3rα蛋白上的应用。上述核酸适配体能与il3rα蛋白高特异性结合，可用于从复杂体系中捕获il3rα蛋白、或实现对il3rα蛋白的体外检测，适用于il3rα蛋白的纯化、检测及il3rα蛋白相关疾病的诊断。
7.为实现上述目的及其他相关目的，
8.本发明的第一方面，提供一种特异性识别il3rα蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，即所述核酸适配体具有seq id no.1、seq id no.2中任意一条所示的核苷酸序列。
9.上述核酸适配体能与il3rα蛋白高特异性结合，可用于从复杂体系中捕获il3rα蛋白、或实现对il3rα蛋白的体外检测，适用于il3rα蛋白的纯化、检测及il3rα蛋白相关疾病的诊断。
10.上述核酸适配体能与il3rα蛋白特异高效结合的核酸适配体，能用于il3rα蛋白捕获、体外检测或il3rα相关疾病的临床诊断，应用前景广阔，且该核酸适配体可大量人工制
备，方法简单，成本低廉，有利于市场推广。
11.本发明的第二方面，提供一种特异性识别il3rα蛋白的核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物由上述核酸适配体进行核苷酸增减、置换、修饰或编码的肽核酸后获得的与所述核酸适配体具有相同特异性识别功能的单链dna分子。
12.进一步地，所述核酸适配体衍生物由上述核酸适配体进行核苷酸删减、增加、碱基置换、碱基修饰、分子骨架修饰、编码的肽核酸、信号分子修饰、活性分子修饰、功能基团修饰后获得的与所述核酸适配体具有相同特异性识别功能的单链dna分子。
13.本发明的第三方面，提供上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在捕获、纯化、检测il3rα蛋白上的应用，具体为上述核酸适配体或其衍生物在制备捕获和纯化il3rα蛋白的产品中的应用和核酸适配体和其衍生物在制备体外检测il3rα蛋白的产品中的应用。
14.本发明的第四方面，提供上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备诊断或治疗il3rα相关疾病的产品中的应用。il3rα蛋白相关疾病包括非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、b型慢性淋巴细胞白血病、b型和t型急性淋巴细胞白血病、t细胞淋巴瘤、急性骨髓细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓细胞白血病等。即为上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在检测或治疗非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、 b型慢性淋巴细胞白血病、b型和t型急性淋巴细胞白血病、t细胞淋巴瘤、急性骨髓细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓细胞白血病上的应用。
15.本发明的第五方面，提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒中包括上述核酸适配体、上述核酸适配体衍生物中的至少一种。上述检测试剂盒用于纯化或体外检测il3rα蛋白、诊断 il3rα相关疾病的产品。
16.进一步地，所述检测试剂盒中包括上述核酸适配体或上述核酸适配体衍生物。
17.进一步地，所述检测试剂盒中至少有一条seq id no.1、seq id no.2所示的核酸适配体。
18.进一步地，所述检测试剂盒中至少有一条seq id no.1、seq id no.2所示的核酸适配体对应的核酸适配体衍生物。
19.本发明的第六方面，提供一种检测芯片，所述检测芯片中包括上述核酸适配体、上述核酸适配体衍生物中的至少一种。上述检测芯片用于纯化或体外检测il3rα蛋白、诊断il3rα相关疾病的产品。
20.进一步地，所述检测芯片中包括上述核酸适配体或上述核酸适配体衍生物。
21.进一步地，所述检测芯片中至少有一条seq id no.1、seq id no.2所示的核酸适配体。
22.进一步地，所述检测芯片中至少有一条seq id no.1、seq id no.2所示的核酸适配体对应的核酸适配体衍生物。
23.如上所述，本发明的一种特异性识别il3rα蛋白的核酸适配体、衍生物、应用、试剂盒及检测芯片，具有以下有益效果：上述核酸适配体能与il3rα蛋白特异高效结合的核酸适配体，能用于il3rα蛋白捕获、体外检测或il3rα相关疾病的临床诊断，应用前景广阔，且该核酸适配体可大量人工制备，方法简单，成本低廉，有利于市场推广。
附图说明
24.图1是本发明实施例2的il3rα蛋白适配体与靶标结合曲线图；
25.图2是本发明实施例2的il3rα蛋白适配体与il3rα蛋白结合特异性验证结果图；
26.图3是本发明实施例2的il3rα蛋白适配体在pvdf膜上的点杂交结果图一(核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.1)。
27.图4是本发明实施例2的il3rα蛋白适配体在pvdf膜上的点杂交结果图二(核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.2)。
具体实施方式
28.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
29.实施例1
30.筛选特异性识别il3rα蛋白的适配体
31.由于目前缺乏能高效特异性结合il3rα蛋白的核酸适配体，本发明通过筛选获得了一系列特异性针对il3rα蛋白的核酸适配体，这些核酸适配体能与il3rα蛋白高亲和力、高特异性的结合，具有很好的应用前景。
32.为了筛选这些核酸适配体，本发明首先合成一个两端序列已知、中间含有40个随机碱基的dna文库。化学合成初始随机文库，具体序列如下： atccagagtgacgcagca-n40-tggacacggtggcttagt，其中n40为40个随机寡核苷酸。将il3rα蛋白作为靶蛋白，采用selex技术筛选具有高亲和力、高特异性的dna、 rna、修饰dna适配体。通过结构预测软件mfold分析预测适配体的二级结构。通过流式检测技术和点杂交技术鉴定适配体对靶蛋白的亲和力和特异性，得到了多个与il3rα蛋白亲和力高、特异性强的适配体序列，该些适配体都能形成各自特异的茎环结构。
33.具体的筛选过程为：
34.1、在1nmol文库中加入50pmol含有6
×
his标签的il3rα蛋白，25℃孵育30min。随后加入50ul his-mag磁珠，25℃孵育30min。his-mag磁珠(his mag sepharose，来源为ge 公司)与蛋白混合液用wb溶液(137mm nacl，2.7mm kcl，10mm na2hpo4，2mm kh2po4， 5mm mgcl2，5mm咪唑，0.02％吐温-20)清洗三次，每次1ml。再向his-mag磁珠与蛋白混合液中加入50ul咪唑(摩尔浓度为500mm)，室温静置1min，吸取上清液。
35.2、产物(即上清液)在500ul pcr体系中预扩增6个循环，随后用循环数梯度实验确定扩增最适的循环数。以预扩增产物为模板，配5管50ul pcr体系，分别扩增6cycle、8cycle、 10cycle、12cycle、14cycle。扩增引物p1：atccagagtgacgcagca，扩增引物p2：5
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phosphorylation-actaagccaccgtgtcca。
36.3、将扩增产物电泳，挑选最合适的循环数并对筛选产物进行扩增制备双链。扩增产物经过纯化，用nanodrop微量系统进行定量。每2ug扩增产物中加入5ul 10
×
酶切缓冲液、1ullambda外切酶并用水补足至50ul，即每2ug扩增产物对应50ul体系。将前述扩增产物在37℃酶切30min，获得次级文库用于下一轮筛选，筛选共进行六轮。
37.筛选后的次级文库通过ta克隆和一代测序，获得如下序列的普通碱基dna核酸适配体，核苷酸序列seq id no.1(il-2)和seq id no.2(il-67)所示。
38.实施例2
39.筛选获得的核酸适配体与il3rα蛋白特异性结合
40.1、酶联适配体吸附实验(elasa)
41.s1、取il3rα蛋白稀释于pbs缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)中(ph＝7.4)，il3rα蛋白的终浓度为500ng/ml；在96孔板上每孔50ul包被于半体积elisa透明酶标板中，封板并于4℃孵育过夜，手工洗板(弃孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置10秒，甩干，重复四次后于吸水纸上拍干)。
42.s2、设15个浓度(500nm开始倍半稀释十四次，即500nm，250nm，125nm， 62.5nm
…
0.061nm，0.030nm)，将生物素标记il3rα对应的核酸适配体在结合缓冲液中倍比稀释，每个浓度均做复孔。将不同浓度的核酸适配体稀释液加入不同的孔中，每孔加入的体积为50ul，并设置空白对照孔和bsa(牛血清白蛋白)对照孔。封板，置25℃孵育2小时。重复手工洗板步骤。
43.s3、再向每孔中加sa-hrp酶标反应液50ul，封板，置25℃孵育1小时。再次手工洗板
44.s4、每孔加入50ul tmb显色混合液，封板并置37℃孵育20分钟。
45.s5、每孔各加50ul 1n h2so4(1n h2so4＝0.5mol/l h2so4)终止液，混匀。用酶标仪在波长450nm下(参考波长630nm)读取各孔od值。
46.结果如图1所示，从图1的结果中可以看出两条核酸适配体均与il3rα蛋白具有高亲和力，如il2的平衡解离常数kd为1.077nm，il67的平衡解离常数kd为0.7309nm；而且，这些核酸适配体与il3rα蛋白的结合具有高特异性的同时，与其他蛋白如dkk1蛋白几乎不结合(见图2)。
47.2.核酸适配体点杂交实验
48.a、pvdf膜激活：将剪裁后pvdf膜(聚偏氟乙烯膜)浸泡于甲醇中，浸泡15s后转移到pbs缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)中，使用前在滤纸上沥干。
49.b、取2ug il3rα纯蛋白，使用点样器点于pvdf膜上(同浓度的tnfa纯蛋白，cd38 纯蛋白，epcam纯蛋白，ctla4纯蛋白及血清作为阴性对照)，点样后于37℃烘箱中烘干。将上述pvdf膜取出，置于1％bsa水溶液中，在水平摇床上摇动封闭1h。
50.c、取出封闭后pvdf膜，使用1
×
pbst缓冲液振荡洗涤5min，共洗涤3次。将上述pvdf 膜置于杂交袋中，在袋中加入3ml 100nm核酸适配体，赶走杂交袋中气泡后封口，置于水平摇床上振荡1h。取出杂交袋中的pvdf膜，使用1
×
pbst振荡洗涤5min，共洗涤3次。将洗涤后pvdf膜置于streptavidin-hrp中，摇床振荡30min。取出pvdf膜，使用1
×ꢀ
pbst缓冲液振荡洗涤5min，共洗涤3次。最后将dab显色液(增敏二氨基联苯胺显色液) 滴在膜上显色3min，保留图像。
51.结果如图3和图4所示，点杂交实验中核酸适配体作为捕获探针能够特异性的结合靶标蛋白(il3rα)。图3中核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.1，图4中核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.2。
52.图3中，泳道1～6分别是：1.il3rα纯蛋白(2ug)；2.阴性对照，tnfα纯蛋白(2ug)； 3.阴性对照，cd38纯蛋白(2ug)；4.阴性对照，epcam纯蛋白(2ug)；5.阴性对照， ctla4纯蛋白(2ug)；6.阴性对照，人血清(10倍稀释)。图4中，泳道1～6分别是：1. il3rα纯蛋白(2ug)；2.阴性对照，tnfα纯蛋白(2ug)；3.阴性对照，cd38纯蛋白(2ug)； 4.阴性对照，epcam纯蛋白
(2ug)；5.阴性对照，ctla4纯蛋白(2ug)；6.阴性对照，人血清(10倍稀释)。
53.综上所述，本发明的核酸适配体能与il3rα蛋白特异高效结合的核酸适配体，能用于 il3rα蛋白捕获、体外检测或il3rα相关疾病的临床诊断，应用前景广阔，且该核酸适配体可大量人工制备，方法简单，成本低廉，有利于市场推广。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
54.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。