猪脑心肌炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

脑心肌炎是由猪脑心肌炎病毒引起的猪、某些哺乳动物(包括灵长类动物)的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎以及母猪的繁殖障碍等为主要临床特征的一种急性传染病。emcv是单股正链rna病毒，属微rna病毒科心病毒属的唯一成员，病毒颗粒直径25-30nm，呈二十面立体对称结构，无囊膜，具有独特的单一血清型，其基因组全长约7.8kb，含有一个开放性阅读框(orf)。该病毒可以感染多种动物，猪感染emcv后可导致怀孕母猪流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎，但通常不发生母猪死亡或以亚临床感染的形式存在。自1945年首次分离得到第一株emcv以来，世界各国相继有该病发生的报道,人体内也已检测到相应的抗体，其公共卫生学意义受到关注。

猪脑心肌炎病毒的自然宿主是鼠和其它多种哺乳动物，在自然感染发病病例中猪是最易感的家畜。因猪血浆生物制品如白蛋白、凝血酶和纤维蛋白原成分越来越多的被应用于替代人血液相应活性因子，用于治疗多种疾病，甚至被用于临床止血和手术等方面，因此对猪血清中猪脑心肌炎病毒的检测为猪血液生物制品的生物安全性和使用安全性提供了重要的保障。

分子信标是近年来发展出来的一种新型痕量核酸检测技术，特殊的尾部发卡结构使分子信标具有很强的特异性识别靶标序列的能力。分子信标是由茎-环结构组成的寡核苷酸序列，通常由15-30个核苷酸构成，特点是探针的5’端和3’端有4-5个互补核苷酸组成互补结构，使得探针在常态时头尾互补结合形成环状结构，两端连接的荧光基团和淬灭基团能够有效的结合在一起，降低荧光本底提高探针结合靶序列的灵敏度和特异性，这样的结构使得靶序列即使只有一个碱基的突变、缺失、插入，分子信标都能够检测出来，因此具有分子信标特征的pcr技术对核酸分子的分辨率达到一个碱基(singlebasepairaccuracy)。

目前关于猪脑心肌炎病毒基因的检测所公布的方法有基于琼脂糖凝胶电泳法，如专利申请号：cn201510096905.8所公布的琼脂糖凝胶电泳检测方法，采用纳米pcr后琼脂糖凝胶电泳检测的方法，检测灵敏度相对较低，仅能检测约1.2×10⁵copies/ml的病毒颗粒浓度，可能导致假阴性漏检，同时因为最终采用电泳检测方法，不能对病毒含量定量检测。又如专利申请号：cn201711258029.x采用环介导等温扩增(lamp)技术分别对emcv基因进行检测，虽然提升了效率，但不能准确定量病毒含量，所用等温设备仍为类似pcr的精确控温仪器，同时lamp技术存在着灵敏度、封闭体系等诸多问题，在检测中还需要对核酸进行逆转录后才能用lamp方法进行cdna含量检测，所以在反应时间上超出一般荧光定量pcr的检测时间，同时该专利虽然宣称敏感度超过rt-pcr技术，但所对比的技术仍为pcr+琼脂糖凝胶电泳，不能证明其敏感度达到或超过实时荧光定量技术。再如专利申请号cn201710173076.8公布了一种检测鼠脑心肌炎病毒的荧光定量pcr引物和试剂盒，仅针对鼠源emcv进行优化和检测，无法确定该检测试剂盒是否适用于猪源生物样品检测，不能为猪脑心肌炎流行病学研究提供帮助，虽然该专利优化了检测方法，但仍然需要单独进行rna的逆转录，这无疑增加了检测时间和污染的概率，不适合大规模大批量进行病毒含量筛查和检测，容易对环境和检验人员安全造成影响。

技术实现要素：

针对背景技术中提出的问题，本申请提出一种猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)检测引物探针组、试剂盒及其检测方法。

下述emcv即为猪脑心肌炎病毒的简称，为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

本发明公开了一种猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)检测引物探针组、试剂盒及检测方法。其中，引物探针序列如下段中seqidno：1至seqidno：3所示。本发明公开的一种猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)检测试剂盒，主要包括emcvpcr反应液(包括buffer和引物探针)和emcv酶系混合液、emcv阴性对照、emcv阳性对照和emcv定量标准品。采用该试剂盒可以实现猪脑心肌炎病毒核酸的定量检测。试剂盒的检测灵敏度高，最低检测限为10²copies/ml；定量线性范围广，可对10³copies/ml～10¹⁰copies/ml的猪脑心肌炎病毒基因准确定量；特异性强，与其他细菌和猪常见病毒无反应；重复性好，批内和批间变异系数均小于2％，不同仪器间变异系数小于5％；稳定性强，反复冻融8次后10²copies/ml的最低检测限参考品100％检出，与其它12种猪场常见病原体核酸同时检测时能够100％识别出猪脑心肌炎病毒并准确定量，同时对其它病原体核酸无假阳性出现，对116份阳性猪血浆病毒检测能够有100％的识别率，非常适用于猪病常规疫情监测和猪血来源的生物制品对猪脑心肌炎病毒的检测需求。

具体的，本发明的试剂盒的emcv引物探针混合液包括引物和探针混合液。其中，本发明实时荧光定量pcr引物的核苷酸序列如下所示：

引物emcv-f：

5’-cagcaaagctatgggatcagc-3’，(seqidno：1)，

引物emcv-r：

5’-tcattgctttttgggcgtc-3’，(seqidno：2)，

本发明的一种检测猪脑心肌炎病毒的实时荧光定量pcr探针的核苷酸序列如下所示：

探针emcv-p：5’-cgcacgttggcatcgagcaaagccgtatgcg-3’，(seqidno：3)

(emcv)探针具有分子信标结构，5’端具有荧光基团f+cgca结构，3’端具有tgcg+淬灭基团q结构，该设计能够形成茎-环结构。

(emcv)探针5’端荧光基团q可以为fam、hex、rox、vic、cy5、tet中一种，(emcv)探针序列3’端标记的淬灭基团f可以为mgb、tamra、bhq1和bhq2中一种；

进一步的，所述的试剂盒还包括emcvpcr反应buffer和emcv引物探针的混合液、emcv酶系、emcv阴性对照、emcv阳性对照和emcv定量标准品。

其中，所述的emcv定量标准品为含有不同拷贝数的emcv基因的重组质粒；所述的emcv阳性对照为含有特定拷贝数(即确定拷贝数)范围的emcv基因的重组质粒。

所述的emcv酶系为热启动taqdna聚合酶、逆转录酶mmlv、rna酶抑制剂rnasin、bsa和dntps的混合液。

一种检测血液样本中猪脑心肌炎病毒的检测方法，包括如下步骤：

(1)提取血清样本病毒核酸；

(2)配制emcv定量pcr检测体系，其中，所述检测体系中包含所述的多重荧光定量pcr检测试剂盒的引物和探针；

(3)定量pcr反应；

(4)结果判定。

本发明提供能同时检测和鉴别猪脑心肌炎病毒基因的实时荧光定量pcr引物探针组。

作为优选的，(emcv)探针序列的5’端标记fam荧光素，(emcv)探针序列3’端标记mgb淬灭基团。

基于上述引物探针组，本发明提供一种灵敏度高、特异性强、重复性好的多重实时荧光定量pcr检测试剂盒，该试剂盒含有上述引物探针组，所述的引物探针组定量pcr体系的终浓度分别为：引物浓度200nmol/l，探针浓度120nmol/l。试剂盒包括有emcvpcr反应buffer应buffer和emcv引物探针的混合液、emcv酶系、emcv阴性对照、emcv阳性对照和emcv定量标准品。

emcv定量pcr反应buffer为商业化的pcr反应buffer，该buffer中为hepes缓冲液，在pcr反应中的终浓度hepes为20mmol/l，(nh4)2so4的反应终浓度为10mmol/l，kcl的反应终浓度为50mmol/l，蔗糖的终浓度为25mmol/l，mg²⁺的终浓度为2.5mmol/l。hepes缓冲体系和适宜的mg²⁺浓度能够增加检测的特异性，添加非还原糖蔗糖能够增加pcr反应buffer在环境温度下的存储稳定性。

emcv酶系由热启动taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl、逆转录酶(200u/μl)0.3μl、rna酶抑制剂(40u/μl)0.2μl、bsa(50μg/μl)0.8μl和25mmdntps0.2μl组成，每份2μl，即25μlpcr反应体系中热启动taqdna聚合酶的含量为2.5u逆转录酶60u，rna酶抑制剂8u，bsa终浓度为20μg/μl，dntps的终浓度为200μm。所述的热启动taqdna聚合酶(货号：md026)、逆转录酶(货号：md028)、rna酶抑制剂(货号：md015)、dntps(货号：md016)均购自购自菲鹏生物股份有限公司。该酶系将dntps添加至热启动taqdna聚合酶、逆转录酶和rna酶抑制剂混合物中，由于酶系中含有的甘油和bsa成分不会在低温冻结，确保了dntps在酶系中亦不会反复冻融，从而保证检测结果的准确性。

emcv阴性对照为超纯水，由超纯水仪制备，电阻率大于18.0mω.cm。

emcv定量标准品为人工合成的含有emcv基因片段的重组质粒经浓度测定，定值后采用eb缓冲液(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：rk120-02)稀释至拷贝数为10¹⁰copies/ml后-20℃±5℃存储。该定量标准品不仅浓度范围广，由于采用了特定的缓冲液进行稀释，低温存储稳定性强，不会降解，进而保证了定量结果的精确性。

本发明还提供了上述猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)的使用方法：

(1)核酸提取

分离猪血血清，采用病毒基因组dna/rna提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：dp315)按照试剂盒说明书操作进行血清病毒核酸提取，提取的病毒核酸如不能立即用于检测，存储于-20℃±5℃。

(2)试剂的配置

按照猪脑心肌炎病毒基因检测试剂盒的使用说明书配置定量25μl定量pcr检测体系，具体为将试剂盒室温溶解后，将试剂盒中各组分涡旋混匀，按照：emcvpcr反应buffer和引物探针混合液18μl、emcv酶系2μl混合后进行分装，每测试分装20μl后添加核酸模板5μl，定量检测需要同步进行定量标准品的检测。

(3)pcr检测

按照如下pcr反应程序进行定量pcr检测：abi7500荧光定量pcr仪上进行反应，反应条件为：50℃25分钟，95℃5分钟，然后经95℃15秒，62℃45秒钟(荧光收集)，40个循环。

(4)结果分析

质控标准：阴性对照检测结果在fam通道为阴性，阳性对照检测结果在fam通道为阳性，且扩增曲线呈明显“s”型曲线；

结果判读：在质控合格的前提下进行结果分析，定性分析可直接根据检测ct值进行阴性或者阳性判定，在fam通道为阳性检测结果均为阳性；定量分析结合标准曲线进行定量分析。

上述方案，本发明具有以下有益效果：

1、本发明方法可准确定量病毒核酸颗粒浓度，其检测限可达到10²copies/ml，由于普通pcr方法10000倍，优于lamp方法1200倍，优于同类型方法30倍。

2、本发明方法采用特定的引物探针设计，能够实现在一次pcr反应中实现逆转录和扩增同时完成，大幅缩短检测时间，降低开盖次数，有效降低假阳性率，保护检验人员的安全。

3、采用高保真逆转录酶，逆转录rna获得高保真cdna模板，稳定获得高产量低突变模板，提高pcr灵敏度。

4、本发明(emcv)探针则采用分子信标-mgb设计，分子信标为特殊的序列设计，形成茎-环结构提高探针对靶序列的识别能力；mgb为非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，因此能够在荧光定量pcr中大幅降低本底荧光强度，提高检测灵敏度；以分子信标-mgb结构设计的探针能够大幅降低与模板的错配几率，即使1个碱基的突变也能够被识别出，从而达到极高的准确度。

5、引物和探针的设计专门针对猪源生物样品检验进行优化，能够100％区分emcv与其它多种猪病原体核酸物质，对于阳性猪血清检出率可达到100％。

6、本发明酶系采用高保真逆转录酶和高效hitaq酶组合进行逆转录和扩增，能够获得更高产量和更高完整性的全长cdna产物，进而提高pcr体系的灵敏度和特异性；酶系中还添加由一定量的bsa，即可确保dntp在酶系中不会因反复冻融产生降解，还有促进酶活的特性，提高检测灵敏度和体系稳定性。

7、本发明针对试剂盒进行系统的方法验证和稳定性研究，能够保证试剂盒在不同人员、不同时间和不同机器上得出相似结果，能够保证试剂盒经多次冻融后仍能够准确检测病毒含量，使得试剂盒的使用范围和数据可靠性大幅提升。

本发明试剂盒的检测灵敏度高，最低检测限为10²copies/ml；定量线性范围广，可对10³copies/ml～10¹⁰copies/ml的猪脑心肌炎病毒基因准确定量；特异性强，与其他12种细菌和猪常见病毒无反应；重复性好，批内和批间变异系数均小于5％；稳定性强，反复冻融8次后10²copies/ml的最低检测限参考品100％检出，灵敏度和特异性高，对116批次阳性猪血浆能够100％检出，非常适用于猪病常规疫情监测和猪血来源的生物制品对猪脑心肌炎病毒的检测需求。

附图说明：

图1是试剂盒fam通道emcv基因定量线性范围显示图；

图2是试剂盒fam通道emcv基因对高、中、低浓度参考品的重复性结果显示图；

图3-1、图3-2分别为表1-1中emcv组合1、emcv组合2的结果显示图；

实施例

下面通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实施例1引物的设计、合成、筛选与验证

选择emcv基因的相对保守的区域作为待检靶标，根据引物探针的设计原则，针对每个基因分别各设计了两对引物和探针组合，其中第一组探针具有分子信标结构，第二组不具有分子信标结构，分别将2组引物探针送于生工生物工程(上海)股份有限公司合成，相应的引物探针信息如下：

将含有emcv基因片段的质粒dna作为初始浓度样本(浓度约为10¹²copies/ml)，依次向下10倍稀释8个梯度作模板。用上述两组引物探针结合其它pcr反应成份配制相应的pcr反应液，然后对8个梯度模板进行荧光定量pcr检测，同时对第8个梯度的痕量模板进行10次重复性检测，选择荧光曲线线型较好，平台期一致以及灵敏度高的引物探针组合作为后续实验的引物探针组。检测结果见表1-1、表1-2和图3-1、3-2。

表1-1不同emcv基因引物探针组合ct值扩增结果

表1-2不同emcv基因引物探针组合重复性扩增结果

见图3-1、图3-2为不同emcv基因引物探针组合扩增图。

由表1-1、表1-2和图3-1、3-2可知：组合1荧光曲线线型较好，且平台期一致，低浓度检测ct平均值第1组高于第2组3.91个循环，超过3.5个循环，说明第1组灵敏度较高，其最低检测限可高于第2组1个数量级。因此，综合考虑在后述的所有实验中，均采用组合1。

实施例2试剂盒的组装

试剂盒规格为100测试/盒，具体成分及规格见下表2-1。

表2-1emcv试剂盒信息

其中emcvpcr反应buffer为购自菲鹏生物的商品化buffer，在pcr反应中的终浓度hepes为20mmol/l，(nh4)2so4的反应终浓度为10mmol/l，kcl的反应终浓度为50mmol/l，蔗糖的终浓度为25mmol/l，mg²⁺的终浓度为2.5mmol/l。

emcv引物探针混合液为含有实施例1所确定的引物探针混合液，25μl定量pcr反应体系中引物终浓度为200nmol/l，对应的探针浓度为120nmol/l。

emcv酶系为含有热启动taqdna聚合酶、逆转录酶、rna酶抑制剂和dntps的混合溶液，25μl定量pcr反应体系中taqdna聚合酶的用量为1.5u，逆转录酶用量为0.3μl、rna酶抑制剂用量为0.2μl、dntps的终浓度为200μm。

emcv阴性对照为超纯水，由超纯水仪制备，电阻率大于18.0mω.cm。

emcv定量标准品和emcv阳性对照由人工合并含有目的基因片段的质粒dna经eb缓冲液稀释后测定核酸浓度，根据拷贝数就算公式：拷贝数＝ncopies/ml＝(6.02×10²³)×(y×10^-6)/(d×660)，(n：效价值，y：质粒浓度ng/ml，d：质粒片段大小bp)，将目的片段分别稀释至相应的拷贝数后分装并于-80℃±5℃存储。其中，emcv阳性对照的拷贝数范围在10⁵copies/ml～10⁷copies/ml之间。

实施例3试剂盒的使用

试剂配制：将试剂盒自-20℃±5℃冰箱中取出后室温溶解，将试剂盒中各试剂组分涡旋混匀，按照：每个反应emcvpcr反应buffer+引物探针18μl、emcv酶系2μl混合后涡旋混匀，简短离心后分装于pcr管中，按照20μl/反应进行分装后移至加样区。

加样：分别取5ul样本核酸、不同浓度的标准品、阴性对照和阳性对照分别添加至pcr反应管中，盖紧pcr反应管，涡旋混匀后简短离心。

pcr扩增：在abi7500荧光定量pcr仪上反应条件为：50℃25分钟，95℃5分钟，然后经过95℃15秒，62℃45秒钟(荧光收集)，40个循环。

结果分析：

(1)质控标准：阴性对照检测结果在fam通道为阴性，阳性对照检测结果在fam通道为阳性，且扩增曲线呈明显“s”型曲线。

(2)结果判读：在质控合格的前提下进行结果分析，定性分析可直接根据检测ct值进行阴性或者阳性判定，在fam通道为阳性检测结果均为阳性；定量分析需要结合定量标准品的标准曲线，将待测样品的检测ct值代入标准曲线公式，计算样品中含有的基因拷贝数。

实施例4试剂盒定量线性范围

用阴性猪血清将浓度为10¹⁰copies/ml的质控品稀释至浓度分别为10¹⁰copies/ml、10⁹copies/ml、10⁸copies/ml、10⁷copies/ml、10⁶copies/ml、10⁵copies/ml、10⁴copies/ml、10³copies/ml、10²copies/ml，阴性猪血浆作为阴性对照。采用病毒基因组dna/rna提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：dp315)按照试剂盒说明书操作进行血清病毒核酸提取。提取的核酸采用本发明研制的“猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)检测试剂盒”按照使用说明书操作在abi7500实时荧光定量pcr仪器上进行试剂的配制和定量检测。每个浓度梯度设置3次重复，通过分析实验结果确定试剂盒的检测线性范围，要求线性范围内其理论浓度log值与测定浓度log值的线性相关系数|r|≥0.98。检测结果见表4-1。

表4-1emcv基因检测ct值

由以上统计结果可以确定emcv检测线性范围为10³copies/ml～1.0×10¹⁰copies/ml，在此范围内线性相关系数r²为0.9998，|r|＝0.999≥0.98。

实施例5批间不精密度

取中值精密度参考品r3：10⁶copies/ml作为待检样本，用质检合格的202003001(lot1)、202003002(lot2)、202003003(lot3)三批“猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)检测试剂盒”试剂盒按照试剂盒使用说明书操作在abi7500实时荧光定量pcr仪器上进行试剂的配制和定量检测，每个浓度梯度设置10次重复。考查试剂盒对阳性样本的批间不精密度，计算检测ct值变异系数，要求参考品r3的批间ct值变异系数≤5％，阴性样本应均为阴性。检测结果见表5-1。

表5-1emcv基因批间不精密度

三批“猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)检测试剂盒(荧光pcr法)”在abi7500仪器上的批间不精密度为0.80％。

实施例6批内不精密度

取中值精密度参考品r3：3.0×10⁶copies/ml作为待检样本，用202003003批次“猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)检测试剂盒”检测试剂盒分别按照(1)不同仪器：不同abi7500；(2)不同施员；(3)不同时间进行检测，每种处理10次平行检测。计算检测结果ct值变异系数，要求阳性样本相同品牌型号仪器的所有批内ct值变异系数≤5％，不同仪器的所有批内ct值变异系数≤5％，阴性样本应均为阴性。检测结果见表6-1～表6-3。

表6-1不同仪器对检测ct值的影响

表6-2不同操作人员对检测ct值的影响

表6-3不同检测时间对检测ct值的影响

由表6-1～表6-3可知：本项目构建的猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)检测试剂盒在不同仪器、不同操作施用和不同检测时间下对emcv基因检测批内不精密度均不超过2％，不同仪器变异系数不超过5％，批内精密度高。

实施例7试剂盒检测限和稳定性研究

用质检合格的202003001、202003002、202003003三批“猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)检测试剂盒”分别进行冻融1次、2次、4次、6次、8次的稳定性验证实验。以检测限参考品l(10²copies/ml)和阴性对照，研究不同通融次数对试剂盒最低检测限的影响。检测结果见表7-1.

表7-1不同冻融次数对试剂盒的影响

由上表统计结果可以得出，三批emcv检测试剂盒(荧光pcr法)在分别进行冻融1次、2次、4次、6次、8次后均能对最低检测限参考品100％检出，说明试剂盒检测限为10²copies/ml，同时冻融稳定性良好。

实施例8特异性研究

用质检合格的202003001批次“猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)检测试剂盒”对常见猪病原体如：伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、猪丹毒杆菌、猪细小病毒、轮状病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪蓝耳病毒、猪腹泻病毒、猪乙型脑炎病毒、猪链球菌、猪传染性胃肠炎病毒等提取的核酸进行检测。

检测结果显示仅对猪脑心肌炎病毒基因结果为阳性，对其他细菌和病毒检测结果为阴性，表明该试剂盒可以特异性检测猪脑心肌炎病毒核酸。

实施例9血浆样品检测

用质检合格的202003003批次“猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr(分子信标-mgb)检测试剂盒”对116批次猪血浆阳性样品进行检测核酸检测。

检测结果显示全部阳性样本均能检出，检出率为100％。

序列表

<110>哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司

<120>猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cagcaaagctatgggatcagc

<210>2

<211>19

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序列表

<110>哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司

<120>猪脑心肌炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法

<160>3

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