多重RT-PCR同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法与流程

本发明涉及园林植物分子生物学领域，特别是涉及一种多重rt-pcr同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法。

背景技术：

世界范围内感染菊花的病毒已有20余种，目前我国报道的病毒有14种。病毒种类多，传播途径广，有植物“癌症”，尚无理想的防治措施，早期检疫，防治扩散，抑制传播媒介等是较为有效的防治手段。病毒的快速检测是病毒预防及治理的先决条件。

目前菊花病毒检测技术主要有生物学检测法、酶联免疫吸附法、核酸分子杂交技术、pcr技术等。生物学检测法是通过摩擦或嫁接的方法将病毒传染给某种病毒指示植物，通过观察其症状对病毒种类进行鉴定，操作简单，观察结果直观，但鉴定周期长，受环境影响较大。酶联免疫吸附法是病毒检测最常用的方法之一，抗原或者抗体与酶连接形成酶结合物，根据底物的颜色反应来判断是否存在病毒以及病毒的种类，具有快速、直观、费用较低等优势，但操作过程繁琐，特异性和灵敏度不高，且无法对类病毒和无外壳蛋白的病毒进行检测。核酸分子杂交技术是利用核酸与被标记的特异性探针杂交来检测病毒，但随pcr检测方法的应用，在病毒检测领域的应用越来越少。pcr技术短时间内能大量扩增病毒的遗传物质，具有快速、准确、灵敏度高等优点，但一次仅能检测一种病毒，在菊花栽培中，往往会发生多种病毒的复合侵染，因此明确病原需要重复多次pcr检测。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种采用多重rt-pcr同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法。本发明设计的多重rt-pcr技术，操作简便，检测时间短，灵敏度较高，可同时对5种病毒及类病毒进行检测，极大节省了检测时间与成本。

本发明公开了一种多重rt-pcr同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法，包括菊花b病毒(chrysanthemumvirusb，cvb)、番茄不孕病毒(tomatoaspermyvirus，tav)、番茄斑萎病毒(tomatospottedwiltvirus，tswv)、菊花矮化类病毒(chrysanthemumstuntviroid，csvd)以及菊花褪绿斑驳类病毒(chrysanthemumchloroticmottleviroid，cchmvd)，采用如下引物对组合：

csvd-f和csvd-r，其核苷酸序列如seqidno:1和seqidno:2所示；

cchmvd-f和cchmvd-r，其核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示；

cvb-f和cvb-r，其核苷酸序列如seqidno:5和seqidno:6所示；

tav-f和tav-r，其核苷酸序列如seqidno:7和seqidno:8所示；

tswv-f和tswv-r，其核苷酸序列如seqidno:9和seqidno:10所示。

本发明所述的多重rt-pcr同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法，多重pcr反应体系如下：

反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，55.3℃退火30s，72℃30s，循环35；72℃再延伸10min；4℃保存。

本发明多重rt-pcr同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法与现有技术不同之处在于：

pcr技术被广泛应用于病毒的检测，普通pcr技术一次只能检测一种病毒或类病毒，而本发明多重rt-pcr检测技术可以一次检测5种菊花病毒及类病毒，灵敏度略低于单一pcr，可有效检测植物病毒，极大节省了检测时间与试剂等耗材，适合于大批量病毒的调查，为病毒快速、高效的检测提供了方法。

下面结合附图对本发明的多重rt-pcr同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中单一pcr检测结果图；其中，m为500marker，n为阴性对照；

图2为本发明中引物浓度组合优化的检测结果图；

图3为本发明中退火温度优化的检测结果图；

图4为本发明中另一张退火温度优化的检测结果图；

图5为本发明中灵敏度试验结果图。

具体实施方式

1、实验材料

从顺义、平谷、延庆等郊区县的菊花种植区采集菊花病毒病样本，取1g的新鲜叶片在液氮下进行速冻，于-80℃冰箱保存。

2、引物设计

自ncbi数据库下载收录的菊花b病毒、番茄不孕病毒、番茄斑萎病毒、菊花矮化类病毒以及菊花褪绿斑驳类病毒五种病毒、类病毒的基因序列，利用clustalx软件进行序列比对，选择保守区域利用primer5.0软件进行引物设计，设计过程要求各引物的退火温度在50～60℃，gc含量在40～60％，各引物间尽量避免二聚体及发卡环结构。为了保证电泳区分的效果，不同病毒和类病毒扩增序列的大小至少相差50bp以上。具体的引物序列、退火温度、产物大小见表1。

表1多重rt-pcr同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的引物设计

^ay＝c/t；r＝g/a；h＝a/t/c

3.rna提取及反转录

总rna提取采用takara公司的minibestplantrnaextractionkit试剂盒，取1μg的rna进行反转录，采用promega公司的reversetranscriptionsystem反转录试剂盒，最终体积为100μl。

4.单一pcr检测

反应体系：

反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，循环35；72℃再延伸10min；4℃保存。

pcr扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。单一pcr的目的是为了筛选5种病毒及类病毒的特异性引物。结果显示，所设计的引物特异性良好，没有非特异性条带，可用于后续多重pcr的试验。

5.多重pcr检测

在单一pcr基础上，对引物浓度组合(表2)，退火温度(50、52、54、56、58、60)、(53、53.4、54.3、55.3、56.8、57.8、58.5、59)进行优化。

浓度组合优化结果如图2所示，从图中可以看出当5种病毒及类病毒的引物用量一致时，仅tav可以检测到；当引物用量为组合4时，5种病毒及类病毒均可检测到；而其他几种组合均无法同时检测到5种病毒及类病毒。因此，最终确定引物含量为tswv：tav：cvb：cchmvd：csvd＝0.6：0.1：0.4：1.4：1.2。

退火温度优化结果如图3和图4所示，从图中可以看出当退火温度高于56℃时，条带开始变暗；当退火温度低于54.2℃时，有非特异性条带产生；而退火温度为55.3℃时，条带清晰，无非特异性条带。因此，选用55.3℃为最佳退火温度。

6、多重pcr优化结果

反应体系：

反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，55.3℃退火30s，72℃30s，循环35；72℃再延伸10min；4℃保存。

7、灵敏度检测

将含有cvb、tav、tswv、csvd、cchmvd五种病毒(类病毒)的总cdna依次进行10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶稀释。分别进行单一pcr和多重pcr检测，pcr扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

如图5所示，检测结果表明使用单一pcr检测时，tswv的灵敏度为10²，tav的灵敏度为10⁵，cvb的灵敏度为10²，cchmvd的灵敏度为10⁰，csvd的灵敏度为10¹；使用多重pcr检测时，tswv的灵敏度为10¹，tav的灵敏度为10³，cvb的灵敏度为10³，cchmvd的灵敏度为10²，csvd的灵敏度为10²。总体来看，多重pcr的灵敏度低于单一pcr。

本发明的灵敏度虽然略低于单一pcr，但用于病毒检测已经完全足够，可有效检测植物病毒，极大节省了检测时间与试剂等耗材，适合于大批量病毒的调查，为病毒快速、高效的检测提供了方法。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>北京农业生物技术研究中心

<120>多重rt-pcr同时检测菊花中3种病毒和2种类病毒的方法

<130>2021-5

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<213>人工序列(artificialsequence)

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