长链非编码RNAHOXA11-AS作为生物标记物的用途

长链非编码rna hoxa11
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as作为生物标记物的用途
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及一种生物标记物，具体来说是长链非编码rna hoxa11
‑
as作为生物标记物的用途。


背景技术：

2.不孕症是21世纪仅次于心脑血管病和恶性肿瘤的第三大疾病。目前辅助生殖技术已成为治疗不孕症的重要手段，但体外受精
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胚胎移植技术(in vitro fertilization and embryo transfer，ivf
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et)的临床妊娠率一直徘徊在40％左右，活产率约为20％，甚至部分患者反复多周期移植优质胚胎均失败。在反复种植失败(recurrent implantation failure,rif)患者中，约2/3归因于子宫内膜容受性降低。如何提高子宫内膜容受性，已成为生殖医学的瓶颈难题。但子宫内膜容受性没有公认的评价指标和检测方法，因此寻找子宫内膜容受性的生物标记物至关重要。在子宫内膜容受性建立过程中，子宫内膜
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蜕膜转化的发生是子宫内膜对胚胎做出的重要应答，对妊娠的建立和维持至关重要。子宫内膜间质细胞蜕膜化障碍，将导致胚胎种植失败等一系列妊娠相关疾病。因此，深入发明蜕膜化机制，对提高胚胎种植率，减少早期妊娠失败意义深远。
3.长链非编码rna(long non
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coding rna,lncrna)是一类转录本长度超过200个核苷酸、不编码蛋白质的rna，具有较强的组织特异性和时空特异性。lncrna最早被认为是基因组的“噪音”，没有生物学功能。然而，近年来很多发明表明，lncrna可参与调控细胞周期、分化、增殖、迁移、代谢和凋亡等多种细胞过程，在人类生理过程和疾病发生发展中发挥重要作用。在人类基因组中，lncrna的数量远超编码rna，且大部分lncrna的功能尚不清楚，值得进一步深入发明。
4.子宫内膜容受性的建立过程中，已发现多种关键因子以时空特异性的表达模式调控子宫内膜蜕膜化。其中，同源框基因家族中的编码基因hoxa10及hoxa11对蜕膜化有重要调控作用，但该基因家族编码的lncrna成员是否在蜕膜化中发挥作用尚不清楚。本发明首次发现，lncrna hoxa11
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as主要表达于子宫内膜间质细胞，且在蜕膜化进程中显著下调；而在反复种植失败患者中，hoxa11
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as异常激活升高，这可能是反复种植失败患者蜕膜化障碍的病因之一。
5.长链非编码rnahoxa11
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as在pubmed中的gene id为221883，序列如下：5’gccacctcaggggaagcaacagatcgtcactcggtgttctcaccgaaagcacgtaatcgccggtgtaactcatgttggctggggggcctcccggcgcgcgcggagaggctggggtgcgcccccatgcagcatgcttgtgctcaattgcagggtcctcgttctcgagtgtgcagagggcggtgagagctcaactctcgtccccacctcccacccgcagctccccgggtgggtgagggatgccctggactggggatagccaggtgggagtccgtcgctgtgtggcctgtggtctcggagtctgttctcctggagtctcgcatttgcacccccttcttcgcagtccccctcccatagacttgctctgggaagcgcctctgcctccgaccctagccggaaccccttcggggccagagtttgaagccgtggatgtgcctgcctggtggcttgtccgatttgcacggtgacttgattacactctctcattcatggtcacttccgaagcgctttagtgccttccgtccctaaaccgccaacagccagaacggcttctccccgcggtttgtcactgatccgcagggcccggaagggccttcgtcttacccgggatccacctct
cccctcatcttccctgcctacctcttcatcccaccttctgtccttggagaaactccctcctcctcgctgcctgccgggcttcggagtgactcggcagagacagaggcacaggggctgccctgctgctcaccggtccacccatctgcctggtcttctggagctgaggactcgggaaaccatgcaattgaggcaagccttgggctgctttagaggcgctgacatccgaggagacttctcctgggaggtccaacagccgagcttagcccaccgggctctgggaaagacccgactgaggctaaagccgccccggaaggccaagtccgagttccatttcttgaagaggccggcgcgcgtaaggctgtgacattggccctggcgactggcttcccaggagctgttctttctcaggagctccacagcgcgggccatctccagaaaactgtcttcagagtgtatttccttttatcgtcaacccagagccccaccgcggctaatgcaagaggccaaaaaatgtttggaggaagaaaaacaaaggcaggaagtggcggcggcctgacggtgcgtgtgtgtctgcagagaagggagggagccggctcagtctcttcttgtttttccaaacttcaaggtccaggcagccctctgcagggccgggccccattgctccccgcgcggcattggaggtggccgcccggagaggagaaggccaacgcctgcgccaggcttgtcaggcggaaacggctaacaaggagatttggtcagcaaaacagacccagcctttccgaggcttcgtctgacttggcccgaaaggttggggagggggggcttgcgcagagcctcagggaccctcctctctggggactaccatccctgagccttacgcttctttccacagcctttgcaggcggaatatcggaataaagtgggtccaggcgccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa3’(如seq id no：1所示)。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供长链非编码rna hoxa11
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as在制备作为诊断子宫内膜容受性的生物标记物中的用途，所述的这种用途要解决现有技术中没有有效的方法用于评价子宫内膜容受性的技术问题。
7.本发明的目的在于提供长链非编码rna hoxa11
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as在制备作为诊断子宫内膜容受性的生物标记物中的用途。
8.本发明还提供了检测长链非编码rna hoxa11
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as的试剂在制备用于体外诊断子宫内膜容受性的生物标记物中的诊断组合物中的用途，所述的检测长链非编码rna hoxa11
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as的上游引物序列如seq id no：2所示，所述的检测长链非编码rna hoxa11
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as的下游引物序列如seq id no：3所示，所述诊断包含：检测来自患者的子宫内膜样本中长链非编码rna hoxa11
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as生物标记物的水平。
9.本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明提供了lncrna hoxa11
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as作为一个新的评价子宫内膜容受性的生物标记物，通过实验发现hoxa11
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as在自然周期内膜的种植窗期明显降低，而在反复种植失败患者的内膜中异常升高，这对于临床评价子宫内膜容受性，选择合适的胚胎移植时间，从而提高胚胎种植率具有很强的应用价值和前景。
附图说明
10.图1显示了hoxa11
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as在月经周期内膜中的表达变化。
11.图2显示了hoxa11
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as在反复种植失败患者内膜的表达变化。
12.图3显示了hoxa11
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as在子宫内膜上皮和间质细胞的定位。
13.图4显示了hoxa11
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as在子宫内膜间质细胞蜕膜化中的表达变化。
14.图5显示了过表达hoxa11
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as抑制子宫内膜间质细胞的蜕膜化
具体实施方式
15.实施例1
16.一、实验方法和材料
17.1、人子宫内膜样本的收集：通过尿促黄体生成素(lh)峰值判断，收集4例自然周期的lh+2(容受前期)和4例lh+7(容受期)的子宫内膜样本。
18.对照组(ctrl,n＝11)和反复种植失败(rif,n＝11)的子宫内膜均来自未接受新鲜胚胎移植的拮抗剂刺激方案的患者。在注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)7天后采集活检样本。
19.对照组为月经周期正常，因输卵管因素或男性因素而接受试管受精，且首次胚胎移植成功的患者。
20.在本发明中，rif定义为3个或3个以上高质量胚胎移植周期失败或10个以上胚胎移植失败。
21.以上病例来自上海交通大学医学院附属仁济医院，均通过伦理调查。
22.用管状导管从子宫底部取活检标本，快速冷冻于液氮中，
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80℃保存，提取总rna。
23.2、人子宫内膜上皮和间质细胞的分离、纯化、培养及体外诱导蜕膜化：无菌获取增殖期子宫内膜，经pbs漂洗后剪成1mm3的碎块，加入质量百分比浓度为0.25％的i型胶原酶、15iu/ml的dna酶，于37℃的摇床中消化30分钟。用400目的筛网过滤得到间质细胞，400目筛网上层即为上皮细胞。以含体积百分比浓度为10％胎牛血清的dmem/f12培养液在37℃、5％co2中培养，后视细胞生长情况传代。换用含双丁酰环磷腺苷(db
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camp)0.5mm/l，醋酸甲羟孕酮(mpa)1um/l和体积百分比浓度为2％碳吸附胎牛血清(cs
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fbs)的培养液进行体外诱导蜕膜化；分别在第0，2，4天观察间质细胞形态，提取rna、留存细胞上清液，检测蜕膜化的标志物
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prl和igfbp1的水平。
24.3、总rna提取和逆转录：根据说明书，使用trizol试剂(invitrogen)从子宫内膜组织和细胞中分离出总rna。rna浓度和质量由nanodrop nd
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2000分光光度计(thermo fisher scientific)测定。使用primescript rt试剂盒(takara,dalian,china)根据说明书，取500ng总rna合成cdna。
25.4、实时荧光定量pcr检测hoxa11
‑
as的表达水平：采用sybr green master mix(takara,dalian,china)和abi prism系统(applied biosystems,thermo fisher scientific)进行实时荧光定量pcr。所有定量rt
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pcr反应进行三次。以actb为内控，采用比较周期阈值法计算相对mrna或lncrna水平。具体方法为：先用目的基因(如hoxa11
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as)的ct值减去内参actb的ct值得到δct，再用每个病例的δct减去第一个对照的δct得到δδ
26.ct，最后取2^
‑
δδct作为hoxa11
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as的相对表达量。引物序列如下：
[0027][0028]
5、上清prl及igfbp1的检测：收集不同处理的细胞上清液，利用roche cobas e601电化学发光(ecl)检测prl蛋白水平，采用igfbp1酶联免疫吸附试验(elisa)检测igfbp1蛋
白水平(r&d)。
[0029]
6、质粒转染：在细胞密度70
‑
80％时使用lipo3000(invitrogen)进行质粒转染。
[0030]
7、统计学方法：采用单因素方差分析检验各组均数差异是否具有统计学意义；检验水准为p＜0.05。应用spss 22.0统计软件进行数据统计及分析。
[0031]
二、实验结果
[0032]
1、hoxa11
‑
as在容受期子宫内膜表达下降
[0033]
通过rt
‑
qpcr对hoxa11
‑
as在内膜月经周期的表达进行了检测，结果如图1所示，与容受前期(lh+2)相比，hoxa11
‑
as在容受期(lh+7)表达量显著下降(p<0.01，n＝4:4)。
[0034]
2、hoxa11
‑
as在反复种植失败患者内膜中表达升高
[0035]
通过rt
‑
qpcr对hoxa11
‑
as在对照(ctrl)和反复种植失败(rif)患者内膜中的表达进行了检测，结果如图2所示，与对照相比，反复种植失败患者内膜的hoxa11
‑
as表达异常升高(p<0.001,n＝11:11)。
[0036]
对照ctrl与反复种植失败rif的hoxa11
‑
as相对表达量如下：
[0037][0038][0039]
根据我们选的参照，hoxa11
‑
as的相对表达量大于7.503可认为子宫内膜容受性降低。hoxa11
‑
as的相对表达量小于3.368可认为子宫内膜容受性良好，下个周期进行胚胎移植的成功率较高。
[0040]
3、hoxa11
‑
as主要定位于子宫内膜间质细胞
[0041]
子宫内膜主要分为上皮和间质细胞，体外分离子宫内膜组织的上皮细胞和间质细胞，epithelial cell adhesion molecule(epcam)为上皮细胞的特异性标志物，而vimentin(vim)是间质细胞的特异性标志物，因此用epcam和vim鉴定上皮和间质细胞分离
效率。
[0042]
如图3结果所示，hoxa11
‑
as在上皮细胞的表达量很低，间质细胞的表达量远远高于上皮细胞(p<0.01，n＝6:6)。
[0043]
4、hoxa11
‑
as在子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中表达下降
[0044]
因为人的子宫内膜间质细胞在容受期发生自发蜕膜化，收集正常可孕妇女增殖期子宫内膜组织，分离提纯子宫内膜间质细胞并诱导蜕膜化，蜕膜化标志分子prl和igfbp1在上清中的蛋白水平显著升高(图4a和4b,n＝4)，标志着体外诱导蜕膜化模型建立成功。同时，随着体外诱导蜕膜化天数的增加，hoxa11
‑
as显著下降(图4c p<0.05,n＝4)。此结果提示hoxa11
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as在子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中发挥重要作用，从而影响胚胎植入过程。
[0045]
5、hoxa11
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as过表达抑制子宫内膜间质细胞蜕膜化
[0046]
利用snovector载体构建hoxa11
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as的过表达质粒，过表达效率验证见图5a(p<0.0001，n＝5)。在诱导人子宫内膜原代间质细胞蜕膜化的同时转染过表达质粒，诱导蜕膜化4天后收集上清和rna，结果显示过表达hoxa11
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as可以显著下调蜕膜化标志物prl和igfbp1表达(图5b和5c，p<0.05,n＝7)。此结果表明hoxa11
‑
as在调控蜕膜化过程中发挥重要作用。
[0047]
上述结果表明，lncrna hoxa11
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as在子宫内膜容受窗期表达明显下降，而在反复种植失败患者内膜中表达异常升高。hoxa11
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as主要定位于子宫内膜间质细胞，且在间质细胞蜕膜化过程中表达下降。过表达hoxa11
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as抑制了子宫内膜间质细胞的蜕膜化。这些结果提示hoxa11
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as在子宫内膜容受性建立中发挥重要作用，可作为一个新的生物标记物提示内膜容受性。