结合TIGIT的抗体及其用途的制作方法

al.，(2013)cell death differ 20：456-464)。tigit也和cd112(也称为pvrl2/结合素-2)以及pvrl3结合，但结合力要弱得多。
5.研究表明，tigit通过多种途径抑制先天免疫和获得性免疫。首先，tigit与树突状态细胞上的cd155结合，使得树突状细胞呈耐受性表型，减少白介素(il)-12的分泌，增加il-10的分泌，从而抑制抗原提呈相关分子的上调，抑制t细胞增殖和效应细胞因子的分泌(yu x et al.，(2009)nat.immunol.10：48-57)。其次，tigit对免疫细胞有着直接的抑制作用。例如，tigit通路可减弱t细胞受体驱使的活化信号，抑制t细胞的增殖和功能，而高表达tigit的cd8
+
肿瘤浸润细胞明显有着较差的分泌促炎性细胞因子的能力和受损的脱颗粒能力(kurtulus s et al.，(2015)j.clin.invest.125：4053-4062)。nk细胞是在机体消除癌症的初始阶段最为重要的免疫细胞，而tigit表达与nk细胞分泌ifn-γ和杀伤cd155
+
细胞的能力呈负相关。tigit
+
nk细胞比起tigit-nk细胞更容易受到mdsc的影响，tigit阻断可以重启nk细胞对癌症的效应功能(wang f et al.，(2015)eur.j.immunol.45：2886-2897；manieri na et al.，(2017)trends immunol.38(1)：20-28；zhang q et al.，(2018)nat.immunol.19：723-732)。再次，tigit组成性地高表达于大多数treg。tigit
+
treg抑制促炎性th1和th7 t细胞的应答，并产生il-10和纤维蛋白原样蛋白2来抑制t细胞功能，抑制性比tigit-treg更强(joller n.，et al.，(2014)immunity 40：569-581；kurtulus s et al.，(2015)同上)。
6.已开发出靶向tigit的抗体，在多种类型的癌症中进行临床测试。例如，oncomed公司开发的etigilimab(omp-313m32)，目前已经在多种实体瘤，包括结直肠癌、子宫内膜癌、和胰腺癌等中，开展单药以及与nivolumab(pd-1抗体)联用的1期临床试验，检测其安全性、药效、药动和剂量摸索。1期实验结果显示，该药在20mg/kg的剂量下安全耐受。另一个tigit阻断型抗体，tiragolumab，是由罗氏公司开发的一款抗体药物。针对该抗体药物的临床试验显示，该药与pd-l1抗体药物atezolizumab联用，可以在多种类型的肿瘤中起到协同作用，尤其是在非小细胞肺癌的治疗中，效果显著。其他tigit抗体，包括bms-986207(百时美施贵宝)、bgb-a1217(百济神州)、ab154(arcus biosciences)等，也处在单药或与其他抗肿瘤药物联用的临床试验中，涵盖多种实体瘤，包括多发骨髓瘤和黑色素瘤(chauvin j，zarour hm.，(2020)journal for immunotherapy ofcancer 8：e000957)。研究还显示，tigit抗体的恒定区可以与髓细胞fcγr结合而激活髓细胞，增强抗原提呈能力和细胞因子如il-23和tnf-α的分泌，并引发t细胞的颗粒溶解酶b和穿孔素分泌(han jh et al.，(2020)front immunol.11：573405)。
7.在慢性病毒感染中，效应细胞的功能也严重受损。使用tigit抗体阻断tigit通路后，cd8
+
t细胞可重获抗病毒活性。已有报道称，nk细胞上tigit表达的增加与hiv-1病程进展相关，而tigit通路阻断是否能重启nk细胞对病毒的杀伤力还有待考证(holder ka，grant md.(2020)同上；yin x et al.，(2018)front.immunol.9：2341)。
8.基于tigit抗体在调节免疫系统功能中的重要作用，本领域内仍需要更多具有改善药物特征的tigit抗体。


技术实现要素：

9.本技术提供一种分离的单克隆抗体，例如，与tigit(例如，人tigit和猴tigit)结
合的鼠源、人源、嵌合或人源化的单克隆抗体，其与现有技术抗体例如tiragolumab或etigilimab相比，具有相当或更佳的人/猴tigit结合活性、相当的tigit-pvr阻断活性、相当或更强的t细胞激活能力、相当或更强的对tigit阳性细胞的adcc诱导能力、以及相当或更好的体内抗肿瘤活性。
10.本技术的抗体可以用于多种应用，包括tigit相关疾病的治疗等。
11.因此，在一个方面，本技术涉及一种分离的单克隆抗体(例如，人源化抗体)、或其抗原结合部分，其与tigit结合，可以含有i)重链可变区，该重链可变区含有vh cdr1区、vhcdr2区和vh cdr3区，其中，vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区可以分别包含如(1)seq id nos：1、2和3；或(2)seq id nos：7、8和9所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或ii)轻链可变区，该轻链可变区含有vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区，其中，vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区可以分别包含如(1)seq id nos：4、5和6；或(2)seq id nos：10、11和12所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
12.本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中vh cdr1区、vh cdr2区、vh cdr3区、vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区可以分别包含如(1)seq id nos：1、2、3、4、5、和6；或(2)seq id nos：7、8、9、10、11和12所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
13.本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包含与seq id nos：13-23中任一具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
14.本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包含与seq id nos：24-32中任一具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
15.本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区可以分别包含如(1)seq id nos：13和24；(2)seq id nos：14和25；(3)seq id nos：15和26；(4)seq id nos：15和27；(5)seq id nos：15和28；(6)seq id nos：16和26；(7)seq id nos：16和27；(8)seq id nos：16和28；(9)seq id nos：17和26；(10)seq id nos：17和27；(11)seq id nos：17和28；(12)seq id nos：18和26；(13)seq id nos：18和27；(14)seq id nos：18和28；(15)seq id nos：19和29；(16)seq id nos：20和30；(17)seq id nos：21和31；(18)seq id nos：21和32；(19)seq id nos：22和31；(20)seq id nos：22和32；(21)seq id nos：23和31；或(22)seq id nos：23和32所示的氨基酸序列；或与上述具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
16.在一个实施方式中，本技术的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链恒定区和/或轻链恒定区，其中重链恒定区可以为igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区，特别是具有fcγr结合力的重链恒定区，例如具有seq id no：33氨基酸序列的人igg1恒定区，或其功能片段。轻链恒定区可以为κ恒定区，例如具有seq id no：34氨基酸序列的人κ恒定区，或其功能片段。其中，重链恒定区的n端与重链可变区的c端连接，轻链恒定区的n端与轻链可变区的c端连接。
17.本技术的抗体在一些实施方式中包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条
轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或cdr序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或cdr序列。本技术的抗体可以是例如igg4、igg1、或igg2的全长抗体。在一些实施方式中，本技术的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如fab或f(ab
′
)2片段。
18.本技术的抗体或其抗原结合部分为拮抗型tigit抗体或其抗原结合部分，可以与人/猴tigit结合，并能够阻断tigit-pvr结合，促进t细胞激活，引起对tigit阳性细胞的adcc，并具有体内抗肿瘤效果。
19.本技术还提供含有本技术抗体或其抗原结合部分的免疫交联物，该抗体或其抗原结合部分与治疗剂例如细胞毒素或抗癌剂相连接。本技术还提供含有本技术抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本技术抗体或其结合部分的结合特异性。在另一方面，本技术的抗体或其抗原结合部分可以是嵌合抗原受体(car)或基因改造t细胞受体(tcr)的一部分。本技术还提供具有上述car和/或tcr的免疫细胞，包括t细胞、nk细胞等。本技术的抗体或其抗原结合部分还可以由溶瘤病毒编码或由溶瘤病毒承载。
20.本技术还包括编码本技术抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。本技术还提供使用含有上述表达载体的宿主细胞来制备tigit抗体的方法，包括：(i)在宿主细胞中表达抗体，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体。
21.本技术还提供药物组合物，其包含本技术的抗体或其抗原结合部分、免疫交联物、双特异性分子、免疫细胞、溶瘤病毒、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
22.一个方面，本技术提供在受试者中增强免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的药物组合物。增强免疫应答包括激活t细胞。
23.一个方面，本技术提供在受试者中治疗或减缓癌症疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本技术药物组合物。癌症可以是实体瘤，包括但不限于，肝癌、直肠癌、子宫内膜癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、多发骨髓瘤和黑色素瘤。在一些实施方式中，至少一种其他抗癌抗体可以与本技术抗体或其抗原结合部分一起施用，例如pd-1抗体、pd-l1抗体、stat3抗体和ror1抗体、tim-3抗体和/或ctla-4抗体，特别是pd-l1抗体。在另一个实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如il-2和/或il-21)或共刺激抗体(例如cd137抗体和/或gitr抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂一起施用，该化疗剂可以是细胞毒性剂。本技术的抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。
24.在一个方面，本技术提供在受试者中治疗或减缓感染性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本技术抗体或其抗原结合部分。感染性疾病可以是由病毒、细菌、真菌、支原体等引起的慢性感染，例如由hiv引起的慢性感染。在一些实施方式中，至少一种其他抗感染剂可以与本技术抗体或其抗原结合部分一起施用，例如抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗支原体剂等。
25.基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本技术中引用的所有文献、genbank记录、专
利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。
26.应当注意的是，在本技术中，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有中国专利法所赋予的意义；而术语例如“基本由。。。组成”具有中国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明的基本或新的特性的元素排除在外。
27.附图描述
28.以下以示例方式给出但不意在将本发明限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。
29.图1示出小鼠tigit抗体在t细胞激活中所起的作用。100μg/ml的tigit抗体，包括70e11和149g11，的处理增加激活后t细胞的ifn-γ分泌(a)。tigit抗体70e11和149g11的处理以剂量依赖方式增加t细胞的ifn-γ分泌(b)。
30.图2示出嵌合tigit抗体对hek293a/人tigit(a)、hek293a/猴tigit(b)以及hek293a/小鼠tigit(c)的结合活性。
31.图3示出嵌合tigit抗体70e11和149g11诱导nk92细胞对hek293a/人tigit细胞产生adcc杀伤效应。
32.图4示出嵌合tigit抗体70e11和149g11阻断tigit与pvr的相互作用。
33.图5示出人源化70e11抗体对hek293a/人tigit(a)、hek293a/猴tigit(b)和hek293a/小鼠tigit(c)的结合活性。
34.图6示出人源化149g11抗体对hek293a/人tigit(a)、hek293a/猴tigit(b)和hek293a/小鼠tigit(c)的结合活性。
35.图7示出70e11的人源化抗体(a)和149g11的人源化抗体(b)阻断tigit与pvr的相互作用。
36.图8示出tigit人源化抗体以剂量依赖方式诱导t细胞分泌ifn-γ。
37.图9示出70e11的人源化抗体(a)和149g11的人源化抗体(b)诱导nk92细胞对hek293a/人tigit细胞产生adcc杀伤效应。
38.图10示出tigit人源化抗体以剂量依赖方式诱导pbmc对hek293a/人tigit细胞产生adcc杀伤效应，其中pbmc分别来自供体1(a)、供体2(b)和供体3(c)。
39.图11示出c57人源化tigit小鼠经人源化tigit抗体149g11h2l3和70e11h5l3、以及tiragolumab处理后的平均肿瘤体积(a)和平均肿瘤重量(b)。
40.图12示出balb/c人源化tigit小鼠经人源化tigit抗体149g11h2l3和70e11h2l4、以及tiragolumab单用，或与pdl1抗体tecentriq联用处理后的平均肿瘤体积(a)，人源化抗体149g11h2l3单用或联合tecentriq抗体处理后的各组小鼠平均肿瘤体积(b)，人源化抗体70e11h2l4单用或联合tecentriq抗体处理后的各组小鼠平均肿瘤体积(c)，人源化抗体tiragolumab单用或联合tecentriq抗体处理后的各组小鼠平均肿瘤体积(d)。
具体实施方式
41.为更好理解本技术，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
42.术语“tigit”是指t细胞免疫球蛋白和itim结构域。该术语包括变体、同源物、直向
同源物和平行同源物。例如，对人tigit特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的tigit蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人tigit蛋白特异的抗体可以完全地对人tigit蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的tigit蛋白交叉反应。
43.术语“人tigit”是指具有人氨基酸序列的tigit蛋白，例如具有ncbi登陆号为np_776160.2的氨基酸序列的tigit蛋白(saleh r et al.，(2020)cancer immunol immunother 69(10)：1989-1999)，或由例如seq id no：35所示核苷酸编码的tigit蛋白。术语“猴tigit”是指具有猴氨基酸序列的tigit蛋白，例如具有genbank登录号为afh31430.1的氨基酸序列的tigit蛋白(zimin a.v.etal.，(2014)biol.direct9(1)：20)，或由例如seq id no：36的核苷酸编码的tigit蛋白。术语“小鼠tigit”是指具有小鼠氨基酸tigit蛋白，例如具有ncbi登录号为np_001139797.1的氨基酸序列的tigit蛋白(schorer m et al.，(2020)nat commun 11(1)：1288)，或由例如seq id no：37的核苷酸编码的tigit蛋白。
44.本文中的术语“抗体”意在包括igg、iga、igd、ige和igm全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)。全长抗体是包含至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称vh)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即c
h1
、c
h2
和c
h3
。各轻链由轻链可变区(简称v
l
)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域c
l
构成。vh和v
l
区还可以划分为称作互补决定区(cdr)的高变区，其由较为保守的骨架区(fr)区分隔开。各vh和v
l
由三个cdr以及四个fr构成，从氨基端到羧基端以fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(c1q)。
45.本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，tigit蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)fab片段，由v
l
、vh、c
l
和c
h1
构成的单价片段；(ii)f(ab
′
)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和c
h1
构成的fd片段；(iv)由抗体单臂v
l
和vh构成的fv片段；(v)由vh构成的dab片段(ward et al.，(1989)nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(cdr)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管fv片段的两个结构域v
l
和vh由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中v
l
和vh区配对形成单价分子(称为单链fc(scfv)；参见例如bird et al.，(1988)science 242：423-426；and huston et al.，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
46.本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与tigit蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合tigit蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人tigit蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的tigit蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
47.术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子
制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
48.术语“鼠源抗体”是指可变区骨架和cdr区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本技术的鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“鼠源抗体”不包括在小鼠骨架序列中插入得自其他哺乳动物物种的cdr序列的抗体。
49.术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。
50.术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改以增加其与人天然生成抗体的相似度的抗体。
51.术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
52.在本文中，“特异结合人tigit”的抗体是指与人tigit(还可能是其他非人物种的tigit)结合但是基本不与非tigit蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人tigit蛋白，即kd值为5.0x10-8
m以下，更优选为1.0x10-9
m以下。
53.术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的kd为1.0x10-6
m以上，更优选1.0x10-5
m以上，更优选1.0x10-4
m以上、1.0x10-3
m以上，更优选1.0x10-2
m以上。
54.术语“高亲和性”对于igg抗体而言，是指对于抗原的kd为1.0x10-6
m以下，优选5.0x10-8
m以下，更优选1.0x10-8
m以下、5.0x10-9
m以下，更优选1.0x10-9m
以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，igm亚型的“高亲和性”结合是指kd为10-6
m以下，优选10-7
m以下，更优选10-8
m以下。
55.术语“ec
50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
56.术语“抗体依赖的细胞毒性”、“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指细胞介导的免疫防御，其中免疫系统效应细胞主动地将细胞膜表面抗原与抗体，例如tigit抗体，结合的靶细胞例如自身免疫疾病中的免疫细胞裂解。
57.术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
58.术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状的本技术抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。
59.术语“拮抗型tigit抗体”是指在能够阻断或抑制由tigit与其配体如pvr相互作用引发的tigit信号通路的tigit抗体。拮抗型tigit抗体可以促进t细胞激活，细胞因子释放，增强免疫效应，可应用于癌症和慢性感染等治疗中。
60.本技术的多个方面在以下更加具体地加以描述。
61.tigit抗体具有对人tigit的结合特异性以及其他有益的功能特征
62.本技术的抗体以可以与人和猴tigit特异性结合，且结合活性与现有技术抗体例如tiragolumab或etigilimab相当或更佳。本技术的抗体还可以阻断tigit-pvr结合或相互
作用，且阻断活性与现有技术抗体例如tiragolumab或etigilimab相当。
63.更重要的是，本技术的抗体具有与现有技术抗体例如tiragolumab或etigilimab相当或更强的t细胞激活能力，且体内抗肿瘤活性与现有技术如tiragolumab或etigilimab相当，甚至更高。
64.优选的本技术抗体是单克隆抗体。此外，抗体可以是例如鼠源的、嵌合的或人源化的单克隆抗体。
65.tigit单克隆抗体
66.本技术的示例性抗体是结构和化学特性在以下描述的单克隆抗体。
67.本技术抗体或其抗原结合部分的重链可变区cdr和轻链可变区cdr通过kabat编号系统确定，且cdr区氨基酸序列的seq id no列于表1中。领域内熟知，重链可变区和轻链可变区cdr可以通过例如chothia、imgt、abm或contact编号系统/方法确定。
68.本技术中示例性抗体或其抗原结合部分的重链/轻链可变区序列的seq id no也列于以下表1中，一些抗体具有相同的vh或v
l
。
69.本技术抗体可以具有重链恒定区，例如可以是igg1恒定区，例如包含如seq id no：33所示氨基酸序列的人igg1恒定区。轻链恒定区可以为κ恒定区，例如人κ恒定区，其可以包含seq id no：34所示的氨基酸序列
70.与人tigit结合的其他tigit抗体的vh和/或v
l
序列(或cdr序列)可以与本技术抗体的vh和/或v
l
序列(或cdr序列)“混合并配对”。优选地，当vh和v
l
(或其中的cdr)混合并配对时，特定vh/v
l
配对中的vh序列可以由结构近似的vh序列取代。相似地，优选特定vh/v
l
配对中的v
l
序列由结构近似的v
l
序列取代。
71.因此，在一个实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分包括：
72.(a)包含列于表1中氨基酸序列的重链可变区；以及
73.(b)包含列于表1中氨基酸序列的轻链可变区，或者另一tigit抗体的v
l
，其中该抗体特异结合人tigit。
74.在另一实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分包括：
75.(a)列于表1中的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3；以及
76.(b)列于表1中的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3，或者另一tigit抗体的cdr，其中该抗体特异结合人tigit。
77.在另一实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分包括tigit抗体的重链可变区cdr2以及其他结合人tigit的抗体的cdr，例如重链可变区cdr1和/或cdr3，和/或另一tigit抗体的轻链可变区cdr1、cdr2和/或cdr3。
[0078][0079]
此外，领域内公知的是，cdr3结构域，独立于cdr1和/或cdr2，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该cdr3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如klimka et al.，british j.of cancer 83(2)：252-260(2000)；beiboer et al.，j.mol.biol.296：833-849(2000)；rader et al.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.95：8910-8915(1998)；barbas et al.，j.am.chem.soc.116：2161-2162(1994)；barbas et al.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.92：2529-2533(1995)；ditzel et al.，j.immunol.157：
739-749(1996)；berezov et al.，biajournal 8：scientific review 8(2001)；igarashi et al.，j.biochem(tokyo)117：452-7(1995)；bourgeois et al.，j.virol 72：807-10(1998)；levi et al.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.90：4374-8(1993)；polymenis and stoller，j.immunol.152：5218-5329(1994)and xu and davis，immunity 13：37-45(2000)；u.s.pat.nos.6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献军通过引用的方式全部并入本文。
[0080]
在另一实施方式中，本技术的抗体包含tigit抗体的重链可变区的cdr2以及至少tigit抗体的重链和/或轻链可变区的cdr3，或另一tigit抗体的重链和/或轻链可变区的cdr3，其中该抗体能够特异结合人tigit。优选这些抗体(a)竞争结合tigit；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本技术tigit抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含tigit抗体的轻链可变区cdr2，或者另一tigit抗体的轻链可变区cdr2，其中该抗体特异结合人tigit。在另一实施方式中，本技术的抗体可以包括tigit抗体的重链/轻链可变区cdr1，或另一tigit抗体的重链和/或轻链可变区cdr1，其中该抗体特异结合人tigit。
[0081]
保守修饰
[0082]
在另一实施方式中，本技术的抗体包含与本技术tigit抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或cdr1、cdr2和cdr3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，brummell et al.，(1993)biochem 32：1180-8；de wildt et al.，(1997)prot.eng.10：835-41；komissarov et al.，(1997)j.biol.chem.272：26864-26870；hall et al.，(1992)j.immunol.149：1605-12；kelley and o
′
connell(1993)biochem.32：6862-35；adib-conquy et al.，(1998)int.immunol.10：341-6 and beers et al.，(2000)clin.can.res.6：2835-43。
[0083]
因此，在一个实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区和轻链可变区分别包含cdr1、cdr2和cdr3，其中：
[0084]
(a)重链可变区cdr1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
[0085]
(b)重链可变区cdr1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
[0086]
(c)重链可变区cdr3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
[0087]
(d)轻链可变区cdr1、和/或cdr2、和/或cdr3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；且
[0088]
(e)该抗体特异结合人tigit。
[0089]
本技术的抗体具有一个或多个以下功能特征，例如对人tigit的高亲和力，以及引发对tigit表达细胞的adcc或cdc的能力。
[0090]
在多个实施方式中，抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。
[0091]
本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和pcr介导的突变，将修饰引入本技术抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、
半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本技术抗体的cdr区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。
[0092]
基因修饰的抗体
[0093]
本技术的抗体可以以具备本技术tigit抗体的一个或多个vh/v
l
序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，vh和/或v
l
)内(例如，在一个或多个cdr区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，骨架区经修饰成提供人源化的抗体。此外，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。
[0094]
在某些实施方式中，cdr区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(cdr)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，cdr内的氨基酸残基比起cdr外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为cdr序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的cdr序列植入到不同特性的不同抗体的骨架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(riechmann et al.，(1998)nature 332：323-327；jones et al.，(1986)nature 321：522-525；queen et al..(1989)proc.natl.acad；u.s.a.86：10029-10033；u.s.pat.nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
[0095]
因此，本技术的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本技术上述序列的cdr1、cdr2和cdr3，轻链可变区包含具有本技术上述序列的cdr1、cdr2和cdr3。尽管这些抗体包含本技术单克隆抗体的vh和v
l
cdr序列，它们可以含有不同的骨架序列。
[0096]
这样的骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开dna数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系dna序列可以在vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及kabat et al.，(1991)，同上；tomlinson et al.，(1992)j.mol.biol.227：776-798；和cox et al.，(1994)eur.j.immunol.24：827-836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系dna序列可以在genbank数据库中得到。例如，下列hco7 humab小鼠中的重链种系序列的genbank登录号为1-69(ng
‑‑
0010109，nt
‑‑
024637&bc070333)、3-33(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)和3-7(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)。作为另一例子，以下来自hco12 humab小鼠的重链种系序列的genbank登录号为1-69(ng
‑‑
0010109，nt
‑‑
024637&bc070333)、5-51(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)、4-34(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)、3-30.3(caj556644)和3-23(aj406678)。
[0097]
通过使用本领域公知的称为空格(gap)blast的序列相似性搜索方法之一(altschul et al.，(1997))，将抗体蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。
[0098]
用于本技术抗体的优选骨架序列是结构上与本技术抗体所用的骨架序列相似的那些。v
h cdr1、cdr2、和cdr3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者cdr序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个
突变的骨架区中。例如，在一些情况下，将骨架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如u.s.pat.nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
[0099]
另一类的可变区修饰是将vh和/或v
l
cdrl、cdr2和/或cdr3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或pcr介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变cdr区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。
[0100]
此外，在另一实施方式中，本技术提供分离的tigit单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)v
h cdr1区，包含本技术的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)v
h cdr2区，包含本技术的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)v
h cdr3区，包含本技术的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)v
l cdr1区，包含本技术的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)v
l cdr2区，包含本技术的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)v
l cdr3区，包含本技术的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。
[0101]
本技术的基因改造抗体包括在vh和/或v
l
的骨架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。通常而言，这些骨架修饰用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过将抗体骨架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。
[0102]
另一类的骨架修饰包括对骨架区的、或者甚至一个或多个cdr区的一个或多个残基进行突变，以去除t细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。
[0103]
此外，作为骨架或cdr区内修饰之外的另一种选择，本技术的抗体可以基因改造成在fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本技术的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。
[0104]
在一个实施方式中，c
h1
的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变c
h1
铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。
[0105]
在另一个实施方式中，对抗体的fc铰链区进行突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入fc铰链片段的c
h2-c
h3
连接区，从而抗体相对于天然fc-铰链结构域spa结合而言，具有减弱的spa结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。
[0106]
在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体
immunol 172：5489-94；wallick et al(1988)j exp med 168：1099-109；spiro(2002)glycobiology 12：43r-56r；parekh et al(1985)nature 316：452-7；mimura et al.，(2000)mol immunol 37：697-706)。糖基化已知发生在含有n-x-s/t序列的基序中。在一些情况下，优选tigit抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。
[0112]
在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在n-g或d-g序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。
[0113]
各抗体将具有独特的等电点(pi)，基本落在6-9.5的ph范围内。igg1抗体的pi通常落在7-9.5的ph范围内，而igg4抗体的pi基本落在6-8的ph范围内。推测pi在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选tigit抗体的pi值落在正常范围内。这可以通过选择pi在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。
[0114]
编码本技术抗体的核酸分子
[0115]
在另一方面，本技术提供编码本技术抗体或其抗原结合部分的重链/轻链可变区或cdr的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本技术的核酸可以为例如dna或rna，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cdna分子。
[0116]
本技术的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cdna可以通过标准pcr扩增或cdna克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。
[0117]
优选的本技术核酸分子包括编码tigit单克隆抗体的vh和v
l
序列或cdr的那些。一旦获得了编码vh和v
l
的dna片段，这些dna片段可以进一步通过标准的重组dna技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、fab片段基因或scfv基因。在这些操作中，编码vh或v
l
的dna片段与编码另一蛋白的另一dna片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个dna片段连接在一起，从而两个dna片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。
[0118]
编码vh区的分离dna可以通过可操作地连接vh编码dna与编码重链恒定区(c
h1
、c
h2
和c
h3
)的另一dna分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的dna片段可以通过标准pcr扩增而获得。重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，但是优选为iggl或igg4恒定区。对于fab片段重链基因，编码vh区的dna可以可操作地与仅编码重链c
h1
恒定区的另一dna分子连接。
[0119]
编码v
l
区的分离dna可以通过可操作地连接v
l
编码dna与编码轻链恒定区c
l
的另一dna分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的dna片段可以通过标准pcr扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
[0120]
为创建scfv基因，编码vh和v
l
的dna片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(gly4-ser)3的另一片段连接，从而vh和v
l
序列可以作为连续的单链蛋白进行表
达，其中vh和v
l
区域通过该柔性接头连接(参见，例如bird et al.，(1988)science 242：423-426；huston et al.，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883；mccafferty et al.，(1990)nature 348：552-554)。
[0121]
本技术单克隆抗体的制备
[0122]
本技术的单克隆抗体可以使用kohler and milstein(1975)nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括b淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。
[0123]
制备本技术单克隆抗体的转染瘤的生成
[0124]
本技术的抗体还可以使用例如重组dna技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如morrison，s.(1985)science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的dna插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。
[0125]
术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如goeddel(gene expression technology.methods in enzymology 185，academic press，san diego，calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(admlp)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如srα启动子系统，其包含来自sv40早期启动子的序列和人t细胞白血病i型病毒的长末端重复(takebe et al.，(1988)mol.cell.biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。
[0126]
抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过插入到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而vh与载体中的ch可操作地连接，v
l
与载体中的c
l
可操作地连接。或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
[0127]
除抗体链基因和调控序列外，本技术的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如g418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于g418选择)。
[0128]
对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源dna导入原核或真核宿主细胞的技术，
例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、deae-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本技术抗体在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。
[0129]
优选的用于表达本技术重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho细胞)(包括与dhfr可选择标记物一起施用的dhfr-cho细胞，在urlaub and chasin，(1980)proc.natl.acad.sci.usa 77：4216-4220中有过描述，dhfr可选择标记物在例如r.j.kaufman and p.a.sharp(1982)j.mol.biol.159：601-621中描述)、nso骨髓瘤细胞、cos细胞和sp2细胞。特别在使用nso骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是gs基因表达系统，记载于wo 87/04462、wo 89/01036和ep 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。
[0130]
免疫交联物
[0131]
本技术的抗体或其抗原结合部分可以与治疗剂交联，形成免疫交联物，例如抗体-药物交联物(adc)。合适的治疗剂包括细胞毒素、烷化剂、dna小沟结合分子、dna嵌入剂、dna交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶i或ii的抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在adc中，抗体和治疗剂优选地通过接头交联，该接头可切割，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如val-cit、ala-val、val-ala-val、lys-lys、ala-asn-val、val-leu-lys、ala-ala-asn、git-git、val-lys、lys、cit、ser或glu。adc可以如美国专利7,087,600；6,989,452；和7,129,261；pct公开wo 02/096910；wo 07/038,658；wo 07/051,081；wo 07/059,404；wo 08/083,312；和wo 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295中描述般进行制备。
[0132]
双特异性分子
[0133]
另一方面，本技术涉及包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的一种或多种本技术抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
[0134]
在实施方式中，除fc结合特异性和tigit结合特异性外，双特异性分子还具有第三特异性。第三特异性可以针对pd-1、pd-l1或ctla-4，以增强免疫系统应答。或者，第三特异性可以是针对增强因子(ef)，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合并从而增加针对靶细胞的免疫应答的分子。例如，增强因子抗体可以与细胞毒性t细胞(例如，通过cd2、cd3、cd8、cd28、cd4、cd40或icam-1)或其他免疫细胞结合，引起增强的针对靶细胞的免疫应答。
[0135]
双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scfv)构成，称为bs(scfv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的f(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学
法进行制备。参见，例如kufer et al，cited supra；cao and suresh，bioconjugate chemistry，9(6)，635-644(1998)；和van spriel et al.，immunology today，21(8)，391-397(2000)。
[0136]
嵌合抗原受体
[0137]
本技术还提供包含tigit单链抗体scfv的嵌合抗原受体，该scfv包含本技术中所述的重链和轻链cdr、或重链和轻链可变区。
[0138]
tigit嵌合抗原受体可以包含(a)含有tigit scfv的胞外抗原结合域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号转导结构域。
[0139]
编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒
[0140]
溶瘤病毒偏好地侵染并杀灭癌细胞。本发明的抗体与溶瘤病毒一起使用。此外，编码本发明抗体的溶瘤病毒可以引入人体中。
[0141]
药物组合物
[0142]
在另一方面，本技术提供一种药物组合物，其包含本技术的一种或多种抗体或其抗原结合部分、抗体或抗原结合部分编码载体、免疫交联物、免疫细胞、双特异抗体、和/或溶瘤病毒，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗肿瘤抗体、抗感染抗体、或免疫增强抗体，或者非抗体类抗肿瘤剂、抗感染剂、或免疫增强剂。本技术的药学组合物可以与例如另一抗癌剂、另一抗感染剂、或另一免疫增强剂联合使用。
[0143]
药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在gennaro，ed.，remington：the science and practice of pharmacy，20th ed.(lippincott williams&wilkins 2003)中有教导。
[0144]
优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本技术的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。
[0145]
药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。
[0146]
与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分。
[0147]
给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起
产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。
[0148]
对于抗体的施用，剂量可以为约0.001-100mg/kg宿主体重。示例性的治疗方案涉及每周施用一次。本技术tigit的优选给药方案包括静脉内施用。
[0149]“治疗有效量”的本技术tigit抗体引起疾病症状严重程度的降低、无症状期频率和持续时间的增加。例如，对于带瘤受试者的治疗，“治疗有效量”优选地，与未治疗受试者相比，将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选地抑制至少约60％，且更优选地抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者可以是人或另一哺乳动物。
[0150]
药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，sustained and controlled release drug delivery systems，j.r.robinson，ed.，marcel dekker，inc.，new york，1978。
[0151]
药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。
[0152]
在某些实施方式中，本技术的单抗可以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本技术的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29：685；umezawa et al.，(1988)biochem.biophys.res.commun.153：1038；bloeman et al.，(1995)febs lett.357：140；m.owais et al.，(1995)antimicrob.agents chemother.39：180；briscoe et al.，(1995)am.j.physiol.1233：134；schreier et al.，(1994)j.biol.chem.269：9090；keinanen and laukkanen(1994)febs lett.346：123；和killion and fidler(1994)immunomethods 4：273。
[0153]
本技术的用途和方法
[0154]
本技术的药物组合物具有多种体外和外内应用，涉及例如癌症、和感染性疾病的治疗，或者更笼统地讲，用于癌症和感染性疾病患者的免疫增强。抗体可以施用至人受试者，以例如体内抑制肿瘤生长、减少或消除病原体。
[0155]
考虑到本技术药物组合物的抑制肿瘤细胞增殖和存活的能力，本技术提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向该受试者施用本技术的药物组合物，从而在该受试者中肿瘤生长被抑制。可以由本技术抗体治疗的肿瘤的非限制性例子包括但不限于肝癌、直肠癌、子宫内膜癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、多发骨髓瘤和黑色素瘤，原发或转移的。此外，难治的或复发的恶性肿瘤可能可以用本技术的抗体抑制。
[0156]
本技术的药物组合物可以用于减少或消除病原体，本技术提供治疗感染性疾病的方法，包括向该受试者施用本技术的药物组合物。感染性疾病可以是由病毒、细菌、真菌、支原体等引起的，例如由hiv引起的慢性感染。
[0157]
本技术的这些和其他方法在以下进一步讨论。
[0158]
联合疗法
[0159]
本技术提供本技术药物组合物与一种或多种其他抗体或非抗体类治疗剂一起施用的联合疗法，其能有效抑制受试者中的肿瘤生长。在一个实施方式中，本技术提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用tigit药物组合物以及一种或多种其他抗体，例如pd-l1抗体、pd-1抗体和/或ctla-4抗体。在某些实施方式中，受试者是人。在另一个方面，本技术提供癌症治疗方法，其中本技术的tigit药物组合物与化疗剂一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂。其他可以与tigit药物组合物联合的疗法包括但不限于免疫原性剂施用、白介素2(il-2)施用、放疗、手术或激素去除。
[0160]
本技术还提供本技术药物组合物与一种或多种其他抗体或非抗体类治疗剂一起施用的联合疗法，其能有效减少或消除受试者中的病原体，例如病毒、细菌、真菌、支原体。例如，本技术的药物组合物可以与抗感染剂联用，包括，但不限于，抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂和抗支原体剂等。
[0161]
本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。
[0162]
此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。
[0163]
本技术还通过以下实施例进行进一步描述，实施例不应当解读为限制性的。所有附图和在本技术中通篇引用的所有参考文献、genebank序列、专利和公开专利申请都通过引用的方式全部并入本文。
[0164]
实施例
[0165]
实施例1稳定表达人、猴或小鼠tigit、或人pvr的hek293a细胞株的构建
[0166]
使用hek293a细胞来构建稳定过表达人、猴或小鼠tigit的细胞系。简单而言，合成人、猴或小鼠tigit、人pvr的cdna序列(氨基酸序列分别如seq id nos：35、36、37和38所示)，并经酶切克隆到plv-egfp(2a)-puro载体(北京英茂盛业生物科技有限公司，中国)中。将得到的plv-egfp(2a)-puro-tigit或者plv-egfp(2a)-puro-pvr与pspax和pmd2.g质粒通过脂质体转染的方式转染到hek293t细胞(南京科佰公司，中国)中，产生慢病毒，具体转染方法与lipofectamine 3000试剂盒(thermo fisher scientific，美国)说明书步骤完全一致。转染三天后，从hek293t细胞的细胞培养基(dmem培养基(cat#：sh30022.01，gibco)，补充有10％fbs(cat#：fnd500，excell))中收获慢病毒。然后用慢病毒转染hek293a细胞(南京科佰公司，中国)，得到稳定表达人、猴、或小鼠tigit的hek293a细胞(分别称为hek293a/人tigit、hek293a/猴tigit、hek293a/小鼠tigit)，或转染a549细胞(南京科佰公司，中国)，得到稳定表达人pvr的细胞系a549/人pvr细胞。转染的hek293a细胞和a549细胞培养在含有0.2μg/ml嘌呤毒素(cat#：a11138-03，gibco)的dmem+10％fbs培养基中7天。人和猴tigit的表达使用市售可得的tigit抗体(pe-人tigit抗体，cat#：372703，biolegend，美国)通过流式分析仪经facs分析。相似地，小鼠tigit的表达通过市售可得的小鼠tigit抗体(pe-小鼠tigit抗体，cat#：622205，biolegend，美国)经facs确证。人pvr的表达通过市售可得的人pvr抗体(pe-人pvr抗体，cat#：566718，bd，美国)经facs确证。
[0167]
实施例2制备产生小鼠抗人tigit的杂交瘤细胞系
[0168]
小鼠抗人tigit单克隆抗体通过常规杂交瘤融合技术获得，方案略做改动。
[0169]
免疫
[0170]
10只balb/c小鼠(维通利华，中国)通过交叉注射重组人tigit(ecd)-hfc蛋白(cat#：10917-h02h，义翘神州，中国)和猴tigit(ecd)-hfc蛋白(cat#：tit-c5254，义翘神州，中国)进行免疫，具体免疫流程如表2所示。人tigit(ecd)-hfc蛋白和猴tigit(ecd)-hfc蛋白用等体积的完全freund佐剂(cat#：f5881-10*10ml，sigma，美国)、不完全freund佐剂(cat#：f5506-6*10ml，sigma，美国)或pbs超声乳化。
[0171]
表2.免疫方案
[0172][0173]
每次加强免疫后1周，从每只小鼠鼠尾取50μl血清，经elisa检测滴度，具体使用重组人tigit(ecd)-his(cat#：10917-h08h，义翘神州，中国)、猴tigit(ecd)-hfc(cat#：tit-c5254，义翘神州，中国)进行结合测试。还通过使用实施例1中制备的过表达人、猴、小鼠tigit的hek293a细胞经facs进行滴度测试。
[0174]
基于最后一次加强之后的elisa检测和facs检测结果，血清滴度较高的8只小鼠被选出用于下一步的杂交瘤细胞系制备。
[0175]
杂交瘤细胞系的制备
[0176]
通过常规的杂交瘤融合技术制备杂交瘤细胞系，方案略做修改。
[0177]
在最后一次免疫加强4天后，处死小鼠，取脾脏，在pbs中制备成单细胞混悬液。脾细胞用dmem培养基(cat#：sh30243.01b，hyclone，美国)清洗3次。处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(crl-1581，atcc，美国)与上述分离的小鼠脾细胞按1∶4的比例混匀后用dmem清洗2次。细胞融合通过peg(cat#：p7181，sigma，美国)融合的方式进行。融合后的细胞用deme清洗3次，并重悬在细胞生长培养基中(rpmi 1640(cat#：c22400500cp，gibco)+10％fbs+1xhat(h0262，sigma))。将细胞混悬液在96孔培养板上铺板，每孔200μl，5
×
104细胞每孔，将细胞放于37℃、5％co2的潮湿细胞培养箱培养7天。之后，将培养基换成新鲜培养基(dmem+10％fbs+1xhat)。2-3天以后，吸取细胞培养液上清，经elisa和facs筛选杂交瘤细胞。
[0178]
通过elisa筛选杂交瘤细胞系
[0179]
通过高通量的elisa结合检测来筛选与人tigit结合的杂交瘤克隆，在elisa中使用人tigit(ecd)-his(cat#：10917-h08h，义翘神州，中国)。对与人tigit结合的杂交瘤克隆
进一步测试其与猴tigit结合的能力，在elisa中使用猴tigit(ecd)-hfc(cat#：tit-c5254，义翘神州，中国)作为检测抗原。
[0180]
经上述elisa，筛选出85个与人和猴tigit有特异结合力的杂交瘤细胞系。
[0181]
通过facs检测筛选杂交瘤细胞系
[0182]
对筛选出的85个杂交瘤细胞系进一步测试其与hek293a细胞上表达的人、猴或小鼠tigit的结合能力，使用实施例1中的制备hek293a/人tigit细胞、hek293a/猴tigit细胞、和hek293a/小鼠tigit细胞。
[0183]
基于上述facs筛选，得到58个对hek293a/人tigit细胞以及hek293a/猴tigit细胞有高结合力、但不与hek-293a/小鼠tigit细胞结合的杂交瘤克隆。
[0184]
产生tigit抗体的杂交瘤细胞的亚克隆
[0185]
对上述58个杂交瘤克隆进行2轮亚克隆。在亚克隆过程中，选出各克隆的多个亚克隆(n＞3)，并经上述的elisa和facs检测进行特征确证。经该步骤得到的亚克隆确定为单克隆杂交瘤细胞系。最终得到28个对人和猴tigit呈现出高结合力的亚克隆，每个亚克隆得自不同的原始母克隆。
[0186]
实施例3小鼠tigit单克隆抗体的纯化
[0187]
从实施例2得到的28个克隆中，挑取20个对人和猴tigit具有高结合力的克隆，进行进一步的研究。首先将20个所选克隆的单克隆小鼠抗体进行纯化。简单而言，各个亚克隆的杂交瘤细胞在t175细胞培养瓶中生长，各个培养瓶含100ml新鲜无血清杂交瘤培养基(gibco，美国，cat#：12045-076)和1％ht补充液(gibco，cat#：11067-030)。细胞在37℃、5％co2的培养箱中培养10天。收集培养物，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。单克隆抗体通过预平衡的蛋白-a亲和柱(cat#：17040501，ge，美国)来富集纯化。后用洗脱缓冲液(20mm柠檬酸，ph3.0-ph3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在pbs(ph 7.0)中，并通过nanodrop检测抗体浓度。
[0188]
通过使用κ和λ-小鼠快速分型试剂盒(thermal，美国，cat#：26179)和小鼠单克隆抗体分型试剂(sigma，美国，cat#：is02-1kt)来确定纯化抗体的亚型，检测步骤与试剂盒说明书中的一致。
[0189]
大部分克隆，包括70e11和149g11，产生igg1/κ抗体，而少量其他克隆产生igg2a/κ抗体。克隆70e11和149g11的表达滴度分别为1.2和24.2mg/l。
[0190]
实施例4纯化的小鼠tigit抗体与人和猴tigit结合
[0191]
纯化的小鼠tigit单克隆抗体首先通过elisa检测来确定其与重组人或者猴tigit蛋白的结合活性。
[0192]
elisa板用100μl 500ng/ml人tigit (ecd)-his(cat#：10917-h08h，义翘神州，中国)4℃包被过夜。各孔用200μl封闭液(pbs+1％bsa+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2个小时，然后加入100μl梯度稀释的tigit抗体(最高浓度40μg/ml)，室温孵育1小时。elisa板用pbst(pbs+0.05％吐温20)洗3遍后加入5000倍稀释的山羊抗小鼠igg-hrp(cat#：a9309-1ml，simga，美国)，室温孵育1小时。elisa板用新鲜配制的ultra-tmb(bd，美国，cat#no.：555214)室温显色5分钟。
[0193]
20个tigit单克隆抗体对猴tigit的物种交叉反应性进一步通过直接elisa进行测试。具体地，将100μl 500ng/ml猴tigit(ecd)-hfc(cat#：tit-c5254，义翘神州，中国)包被
在96孔elisa板中，并与100μl梯度稀释的tigit抗体(最高浓度40μg/ml)共同孵育。之后使用hrp-山羊抗小鼠igg(sigma，美国，cat#：a9309-1ml)。
[0194]
tigit抗体tiragolumab(根据us20170088613a1中公开的氨基酸序列进行制备，具有人igg1/κ恒定区，也可参照http：//www.imgt.org/3dstructure-db/cgi/details.cgi？pdbcode＝10644中的序列inn 10644_h和inn 10644_l进行制备)用作参照。
[0195]
代表性抗体的结合力的ec
50
总结在表3中。数据示出，所有20个克隆的抗体与人以及猴tigit结合，所有克隆的抗体与小鼠tigit无交叉反应(未示出)。
[0196]
表3.代表性小鼠tigit单抗对人或者猴tigit的结合力
[0197][0198]
实施例5小鼠tigit单克隆抗体与hek293a细胞表达的人和猴tigit结合
[0199]
为进一步确定tigit抗体是否与hek293a细胞表达的人、猴或小鼠tigit结合，分别使用实施例1构建的稳定过表达人、猴或小鼠tigit的hek293a细胞进行facs细胞结合检测。简单而言，将100μl培养基中的105个hek293a细胞在96孔板上铺板，并加入50μl梯度稀释的tigit抗体。4℃孵育1个小时后，96孔板用pbst清洗3遍。之后，加入500倍稀释的apc-山羊抗小鼠igg(cat#：405308，biolegend，美国)。4℃孵育1小时后，96孔板用pbs清洗3遍，然后使用facs检测仪(bd)检测细胞荧光。
[0200]
两种代表性抗体的结合力的ec
50
总结在表4中。数据表明，所有小鼠tigit单克隆抗体均对人以及猴tigit表现出高结合力，但不与小鼠tigit结合。
[0201]
表4.小鼠tigit抗体与人、猴以及小鼠tigit的结合亲和力
[0202][0203]
实施例6抗原表位竞争
[0204]
通过竞争elisa的方法检测抗体之间的抗原结合表位竞争。简单而言，96孔elisa检测板用100μl 0.5μg/ml的人tigit(ecd)-his(义翘神州，中国，cat#：10917-h08h)包被4度包被过夜。这些孔用200μl封闭液(pbs+1％bsa+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2小时。tiragolumab抗体、hel抗体(lifetein，美国，cat#：lt12031)或者etigilimab(按照专利us20160376365a1中的氨基酸序列合成表达，恒定区为igg1/κ)稀释到5μg/ml加入孔中，每孔100μl，室温孵育1小时。板用pbst清洗3遍，加入1μg/ml纯化的本技术抗体，室温孵育1小时。elisa板用pbst洗3遍后加入20000倍稀释的抗小鼠fc-hrp(cat#：a9309-1mc，simga，美国)，室温孵育1小时。继续用pbst洗液洗3遍后，用新鲜配制的ultra-tmb(huzhou yingchuang，中国，cat#：tmb-s-003)室温显色5分钟，并用酶标仪(thermo multiscan fc)
在450nm进行读值。
[0205]
在20种小鼠抗体中，有7种小鼠抗体，包括克隆70e11和149g11抗体，与tiragolumab存在抗原表位竞争，表明这些抗体与tiragolumab结合相同或相似的抗原表位。没有抗体与etigilimab存在抗原表位竞争，表明这些抗体与etigilimab结合完全不同的抗原表位。
[0206]
实施例7小鼠tigit抗体抑制人tigit-pvr相互作用
[0207]
研究表明pvr是tigit的主要配体。通过facs手段进行细胞体系的阻断实验，检测鼠源tigit抗体对tigit-pvr相互作用的阻断效应。使用实施例1制备的稳定过表达人pvr的a549细胞进行阻断检测，经facs测量。简单而言，梯度稀释的tigit抗体与终浓度是5μg/ml的tigit(ecd)-hfc蛋白(cat#：10917-h02h，义翘神州，中国)37度混合孵育1小时，加入到96孔板中。将在100μl培养基中的105个a549/人pvr细胞在96孔板上铺板，并加入100μl上述抗体与融合蛋白的混合物。4℃孵育1个小时后，板用pbst清洗3遍。之后，加入500倍稀释的pe-山羊抗人igg(cat#：pai-86078，thermofisher，美国)。4℃孵育1个小时后，板用pbst清洗3遍，使用facs仪(bd)检测细胞荧光度。
[0208]
数据示出，在20种抗体中，包括70e11和149g11的14种抗体均可以阻断tigit和pvr之间的相互作用。能够阻断tigit和pvr之间的相互作用的两种代表性抗体70e11和149g11的ec
50
值总结在表5中。
[0209]
表5.小鼠tigit抗体对tigit-pvr相互作用的阻断力
[0210]
抗体阻断检测ec
50
(m/l)tiragolumab4.2e-0870e114.3e-08149g114.1e-08
[0211]
实施例8小鼠tigit抗体促进t细胞激活
[0212]
小鼠tigit抗体对t细胞活性的调控作用通过一个t细胞活性检测进行研究。
[0213]
简单而言，通过梯度密度离心收集健康人供体血样中的pbmc，重悬于rpmi1640培养基中。使用invitrogen dynabeads不接触人cd4+t细胞分离试剂盒(cat#：11346d，thermal fisher scientific，美国)从pbmc中分离出cd4+t细胞。cd4+t细胞重悬于rpmi完全培养基(90％rpmi培养基+10％胎牛血清)中，将密度调整为1.0
×
106/ml。t细胞中添加cd3/cd28的激活磁珠(gibco，美国，cat#：11132d)在37度5％的co2中继续培养10天以激活t细胞。
[0214]
收集上述培养的cd4+t细胞，用rpim培养基清洗3遍，将细胞浓度调整为2
×
105细胞/ml。在96孔细胞培养板中预先用50μl 0.25 μg/ml cd3抗体(okt3，义翘神州，中国，cat#：gmp-10977-h001)和50μl 0.25μg/ml pvr-hfc融合蛋白(义翘神州，中国，cat：10109-h02h)4℃包被过夜。板子用pbs清洗3遍，然后用含1％牛血清白蛋白的pbs缓冲液37度封闭90分钟。细胞培养板用pbs清洗3遍，加入上述cd4
+
t细胞150μl，以及50μl终浓度为50μg/ml或者梯度稀释的抗tigit抗体，细胞在37度细胞培养箱中继续培养3天。使用制造商的方法步骤，经elisa(cat#：sif50，r&d，美国)确定ifn-γ浓度。实验设三个重复。
[0215]
如图1中a所示，20个检测抗体中有9个抗体能够提高t细胞的活性，增加ifn-γ的分泌，其中70e11的激活效果最强，149g11的激活效果也较好。且相对于hel对照，这些抗体
以剂量依赖的方式增加t细胞分泌ifn-γ(图l，b)。其中70e11在某些浓度下对t细胞的激活能力比阳性对照更强。
[0216]
实施例9嵌合tigit抗体的表达和纯化
[0217]
选取70e11和149g11进行进一步的研究。首先通过pcr方法对选定抗体的杂交瘤细胞进行重链/轻链可变区序列的克隆，使用文献中提及的引物(juste et al.，(2006)，anal biochem.349(1)：159-61)，并测序。序列总结在表1和表10中。通过将编码可变区和人igg1/k恒定区(重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于seq id nos：33和34)的序列插入到pcdna3.1(invitrogen，美国)的限制性酶切位点xhoi/bamhi之间来构建表达载体。
[0218]
将上述获得的表达载体pei转染hek-293f细胞(cobioer，中国)。具体而言，hek-293f细胞在free style
tm
293表达培养基(cat#：12338-018，gibco)中培养，并用聚乙烯亚胺(pei)转染的方式将各表达载体转染至细胞，dna与pei的比例是1∶3，每毫升细胞培养液中加入dna的量是1.5μg。转染后的hek-293f细胞在37℃、5％co2的培养箱中以120rpm转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，按照实施例3的方法步骤纯化单克隆抗体。
[0219]
实施例10嵌合tigit单克隆抗体与人或猴tigit结合
[0220]
根据实施例5的方法步骤，对获得的嵌合抗体检测它们与实施例1制备的hek293a/人tigit细胞、hek293a/猴tigit细胞以及hek293a/小鼠tigit细胞的结合力。结果分别显示在图2。
[0221]
如图2所示，嵌合抗体对人tigit(图2，a)和猴tigit(图2，b)均有高结合力，且不结合小鼠tigit(图2，c)。
[0222]
实施例11嵌合tigit单克隆抗体的adcc活性
[0223]
进一步检测嵌合tigit抗体对hek293a/人tigit细胞的抗体依赖的细胞毒性效应(adcc)。简而言之，hek293a/人tigit细胞如实施例1所示般通过慢病毒转染系统而生成。hek293a/人tigit细胞和效应细胞nk92mi-cd16a(huabo bio)均以1200rpm离心5分钟。这些细胞随后混悬在adcc检测培养基中(mem培养基，gibco，cat#：12561-056；1％fbs，ex-cell，cat#：fnd500；1％bsa，vetec，cat#：v900933-1kg)，根据细胞计数看，细胞活力为约90％。调整hek293a/人tigit的细胞密度为4x105/ml，nk92mi-cd16a的细胞密度调整为2x106/ml，两种细胞各加50μl到96孔板的各孔中(效靶比是5：1)。将待测抗体分别稀释成不同浓度加入各孔，使抗体终浓度分别为32000ng/ml、6400ng/ml、1280ng/ml、256ng/ml、51.2ng/ml、10.24ng/ml、和2.048ng/ml。样本在37℃孵育4小时，然后以100μl/孔加入ldh显色液(细胞毒性检测试剂盒plus(ldh)，roche，cat#：04744926001)。避光常温放置20分钟后，板在md spectramax i3上进行读数。hel同型对照抗体(lifetein，llc，cat.#：lt12031)作为阴性对照，tiragolumab作为阳性抗体对照。
[0224]
如图3所示，嵌合抗体70e11和149g11都能显著诱导nk92mi-cd16a对hek293a/人tigit细胞的杀伤，且活性与阳性对照相当。
[0225]
实施例12嵌合tigit单克隆抗体阻断tigit-pvr之间的相互作用
[0226]
进一步检测嵌合抗体对tigit蛋白和pvr蛋白之间相互作用的阻断效果，采用实施例1中制备的a549/人pvr细胞系和实施例7中的实验方法。结果如图4所示，两个嵌合抗体都能显著地阻断tigit和pvr之间的相互作用。
[0227]
实施例13 tigit抗体的人源化改造
[0228]
基于上述相关的功能试验，对70e11和149g11进行人源化改造和进一步研究。小鼠抗体的人源化改造通过互补决定区(cdr)移植法(美国专利5,225,539)进行，具体方法详见下文。
[0229]
为选出鼠源抗体70e11和149g11的人源化受体框架，将70e11和149g11的轻链和重链可变区序列与ncbi网站的人免疫球蛋白基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对。选择与70e11和149g11同源度最高的人种系igvh和igvk作为人源化改造的框架。对于70e11，所选择的重链种系受体序列是人ighv1-46*01，所选择的轻链种系受体序列是人igkv3-20*01。对于149g11，所选择的重链种系受体序列是人ighv1-46*01，所选择的轻链种系受体序列是人igkv4-1*01。
[0230]
对70e11和149g11的可变结构域进行三维结构模拟，以确定可能对于维持cdr环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。
[0231]
基于上述的结构建模，70e11重链鉴定出8个潜在的回复突变(m70l、r72a、m48i、t74k、r38k、a40t、r67k、v68a)，轻链鉴定出9个潜在的回复突变(r46k、d71s、q43a、a44s、f72y、l21m、s22t、i59v、d61a)。149g11重链鉴定出7个潜在的回复突变(m48i、m70l、r72a、r87t、r38k、a40r、q43h)，轻链鉴定出4个潜在的回复突变(y42f、v89l、i21v、p49s)。基于这些潜在的回复突变，对抗体框架区进行人源化设计。
[0232]
如表6所示，对于tigit抗体70e11，共设计出5个人源化重链可变区和4个轻链可变区。
[0233]
表6.设计用于tigit抗体70e11的回复突变
[0234][0235]
如表7所示，对于tigit抗体149g11，共设计出4个人源化重链可变区和3个轻链可变区。
[0236]
如表1所示，对于70e11，共得到13个人源化抗体。对于149g11，共得到7个人源化抗体。所有序列信息总结在表1和表10中。
[0237]
表7.设计用于tigit抗体149g11的回复突变
[0238][0239]
合成编码人源化重链可变区加人igg1恒定区的序列、以及编码轻链可变区加人κ恒定区的序列，重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于seq id nos：33和34，并分
别利用ecor i/xho i和cla i/hind iii限制性酶切位点克隆到gs表达载体(invitrogen，美国)中。所有表达构建均经测序证实。用表达载体转染expicho表达系统(invitrogen，美国)，并瞬时表达20个人源化tigit抗体，方法步骤如实施例9所述。
[0240]
实施例14人源化tigit抗体对人和猴tigit抗原结合力的鉴定
[0241]
根据实施例5的方法步骤，检测人源化抗体与实施例1制备的hek293a/人tigit细胞、hek293a/猴tigit细胞以及hek293a/小鼠tigit细胞的结合力。结果分别显示在图5和图6。
[0242]
表8.tigit抗体对人/猴tigit的结合亲和力
[0243][0244]
还通过biacore
tm 8k(ge life sciences，美国)来定量测定人源化tigit抗体对人和猴tigit的结合亲和力。具体地，将100-200ru(反应单位)的人tigit(ecd)-his蛋白(义翘神州，中国，cat#：10917-h08h)或猴tigit(ecd)-hfc蛋白(义翘神州，中国，cat#：tit-c5254)耦联到cm5生物芯片(cat#：br-1005-30，ge life sciences，美国)上，随后用1m氨基乙醇封闭芯片上的未反应基团。梯度稀释(浓度从0.3μm到10μm)的抗体注入到spr反应液(hbs-ep缓冲液，ph7.4，cat#：br-1006-69，ge life sciences，美国)中，速度控制在30μl/分钟。抗体的结合力计算时，扣减空白对照孔的ru。结合速率(ka)和解离速率(kd)使用bia评估软件中的1∶1配对模型的公式进行计算。平衡解离常数kd通过kd/ka计算得到。
[0245]
如图5和图6所示，人源化tigit抗体的结合力与其各自的嵌合抗体相似，即对人和猴tigit有高的亲和力，但是不结合鼠tigit抗原。
[0246]
通过biacore
tm
测量的人源化抗体的结合亲和力显示在表8中。
[0247]
实施例15人源化tigit抗体对tigit-pvr结合阻断
[0248]
进一步检测人源化抗体对tigit蛋白和pvr蛋白之间相互作用的阻断效果。采用实施例1中制备的a549/人pvr细胞系，采取实施例7中的实验方法进行检测。结果如图7所示，所有人源化抗体都能显著地阻断tigit和pvr之间的相互作用。
[0249]
实施例16人源化tigit抗体对t细胞激活功能的鉴定
[0250]
进一步检测人源化抗体对t细胞的激活效果。采取实施例8中的实验方法进行检测。ifn-γ的分泌通过商品化检测试剂盒(r&d，us，cat#：sta00c)按照说明书进行操作检
测。
[0251]
实验结果如图8所示，所有检测的人源化抗体都能促进t细胞的活性，增加ifn-γ的分泌。在检测抗体中，70e11vh2vl4和149g11vh4vl3有着最强的t细胞激活效应，特别是低浓度下的效果，高于tiragolumab。
[0252]
实施例17人源化tigit抗体对tigit阳性细胞的adcc诱导效应
[0253]
进一步检测人源化抗体诱导nk92细胞对hek293a/人tigit细胞的adcc杀伤效果。采取实施例11中的实验方法进行检测。
[0254]
对人源化tigtit抗体进一步分析其经人pbmc引发对实施例1中制备的hek293a/人tigit细胞的adcc效应，其中，hek293a/人tigit细胞通过表达gfp蛋白的plv-egfp(2a)-puro载体的侵染而得到。人pbmc使用淋巴分离液通过密度梯度离心而获得，并在培养基(ripm1640+10％fbs+300iuil-2)中培养过夜。adcc效应检测通过live/dead死细胞染色试剂盒(thermo fisher，usa，cat#：l34964)进行。靶细胞和效应细胞pbmc 1200rpm离心5分钟。细胞用adcc实验培养基(ripm1640培养基+1％fbs)重悬，根据细胞计数，细胞活率为约90％。靶细胞密度调整成4x105/ml，pbmc细胞密度调整成8x106/ml。各取50μl(效靶比20∶1)加入各孔。在样品检测孔中加入稀释好的各种检测抗体，以hek293a/人tigit为靶细胞的抗体终浓度分别为2000ng/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.64ng/ml、0.128ng/ml、0.0256ng/ml、0.00512ng/ml和0.001024ng/ml。然后样本于37℃孵育6小时。混合物用pbs洗3遍，然后与live/dead死细胞染料于37℃孵育30分钟。细胞用pbs洗3遍，用facs进行检测。计算出gfp阳性细胞(hek293a/人tigit细胞)的细胞死亡率。
[0255]
如图9和表9所示，所检测的人源化抗体都能诱导nk92细胞杀伤tigit阳性细胞，并且，诱导杀伤的ec
50
均低于tiragolumab和etigilimab。
[0256]
表9.nk92细胞对hek293a/人tigit细胞的adcc杀伤效果ec
50
总结
[0257]
抗体ec
50
(m/l)抗体ec
50
(m/l)149g11vh2vl37.95e-1270e11vh1vl14.36e-12149g11vh4vl31.77e-1170e11vh5vl37.14e-12149g11vh3vl31.40e-1170e11vh4vl29.12e-12149g11vh2vl21.62e-1170e11vh2vl41.72e-11149g11vh4vl21.84e-1170e11vh3vl31.91e-11149g11vh3vl21.30e-1170e11vh4vl37.286e-12tiragolumab4.65e-11etigilimab2.36e-11hel/
[0258]
如图10所示，所有检测的人源化tigit抗体都能诱导pbmc细胞特异性杀伤hek293a/人tigit细胞，其诱导杀伤效果略强于tiragolumab。
[0259]
实施例18人源化抗体有体内抗肿瘤效果
[0260]
对抗体70e11vh5vl3和149g11vh2vl3的体内抗肿瘤效果进行研究，这些抗体具有人igg1/κ恒定区，所使用的动物模型通过对tigit靶点人源化的转基因小鼠(gempharmatech co.ltd，中国)植入hepal-6小鼠肝癌而建立。小鼠在第0天在侧腹部皮下注射7
×
106hepal-6细胞，随机分成六组，每组8只。小鼠在第0、4、7、11、14和18天腹腔注射70e11vh5vl3、149g11vh2vl3、tiragolumab或pbs，10mg/kg(10mg抗体/kg老鼠体重)。
[0261]
随时间追踪肿瘤大小和小鼠体重。用游标卡尺测量肿瘤的长边(d)和短边(d)，并通过公式tv＝0.5xdxd2计算肿瘤体积。在溶剂对照组肿瘤达到3.5cm3前停止实验。用单因素方差分析来确定肿瘤体积差异。
[0262]
结果如图11所示，所有tigit抗体均能显著抑制人源化tigit小鼠中肿瘤的生长，且抗体149g11vh4vl3和70e11vh5vl3的体内抗肿瘤效果优于tiragolumab。
[0263]
实施例19人源化tigit抗体增强pd-l1抗体的体内抗肿瘤效果
[0264]
对上述抗体70e11vh2vl4、149g11vh2vl3和阳性对照抗体tiragolumab与pd-l1抗体的体内抗肿瘤协同效果进行研究。所使用的动物模型通过对tigit靶点人源化的转基因balb/c小鼠(gempharmatechco.ltd，中国)植入ct26小鼠肠腺癌而建立。
[0265]
小鼠在第0天在侧腹部皮下注射1
×
106ct26细胞，随机分组，每组8只。各组小鼠在第0、4、7、11、14和18天分别腹腔注射70e11vh2vl4(10mg/kg)、149g11vh2vl3(10mg/kg)、tiragolumab(10mg/kg)、(10mg/kg)、(10mg/kg)、(10mg/kg)、以及
[0266]
随时间追踪肿瘤大小和小鼠体重。用游标卡尺测量肿瘤的长边(d)和短边(d)，并通过公式tv＝0.5xdxd2计算肿瘤体积。在溶剂对照组肿瘤达到3.5cm3前停止实验。用单因素方差分析来确定肿瘤体积差异。
[0267]
结果如图12所示。其中图12a汇总示出了70e11vh2vl4、149g11vh2vl3、tiragolumab单用以及分别与pd-l1抗体联用时对人源化tigit小鼠中肿瘤生长的抑制作用。为了更清楚地展示数据，图12b、12c和12d分别示出了70e11vh2vl4、149g11vh2vl3、tiragolumab与pd-l1抗体联用时均具有协同效果。
[0268]
具体而言，如图12a所示，虽然抗肿瘤效果在各个小鼠中存在较大个体差异，但是70e11vh2vl4和149g11vh2vl3与对照溶剂相比能显著抑制小鼠肿瘤的生长。如图12b、12c和12d所示，当pd-l1抗体与tigit抗体联用时，抗肿瘤效果比任何一个抗体单用的抗肿瘤效果更好。此外，如图12a所示，70e11vh2vl4不管单用还是与pd-l1抗体联用，其抗肿瘤效果显著优于tiragolumab，149g11vh2vl3不管单用还是与pd-l1抗体联用，其抗肿瘤效果与tiragolumab相当。
[0269]
本技术中提及的序列总结在表10中。
[0270]
表10.序列
[0271]
[0272]
[0273][0274][0275]
尽管本发明已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本发明不限
于这些实施方式，且上述描述意在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修饰和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式全部并入本文。