利用深共晶溶剂从迷迭香中提取和制备高纯度鼠尾草酸的方法与流程

1.本技术提供一种共晶溶剂及利用其从迷迭香中提取和制备高纯度鼠尾草酸的方法，属于天然产物分离纯化领域。


背景技术：

2.鼠尾草酸(carnosic acid)，是一种天然酚型二萜类成分，天然分布于唇形科植物鼠尾草(salvia japonica)、迷迭香(rosmarinus officinalis)等植物中。鼠尾草酸是油溶性的抗氧化剂，对多种油脂常温、加热的氧化变质有显著的保护作用，是公认的一种优良天然油脂保鲜成分。鼠尾草酸还具有能延缓新鲜肉类产品变色、蛋白质及脂肪的氧化变质等作用。此外，鼠尾草酸还有显著的抗炎、抗菌、抗肿瘤作用，并对中枢神经系统有保护作用。鼠尾草酸具有广泛的应用价值。
3.深共晶溶剂(deep eutectic solvent，des)概念最早由abbott等在2003年报道，此溶剂的特点是熔点降低，在室温下呈现液体状态。深共晶溶剂主要由氢键供体(多元醇，糖类，尿素和有机羧酸)和氢键受体(季铵盐类，如氯化胆碱等)组成二元和三元体系的共晶溶剂。des具有广泛的液态范围，不燃性和低挥发性等特性，还能够与活性酚类成分形成氢键而增加其溶解性并稳定生物分子。作为一种新型的，可替代离子液体的绿色萃取剂，可用于天然有机成分的分离，如应用于萃取芦丁、从嘉宝果中萃取花青素等。
4.从迷迭香中提取鼠尾草酸的一般采用浓度较高的乙醇作为提取溶剂，cn110467528a采用75％
‑
85％乙醇作为提取溶剂，cn105777530a采用85％
‑
95％乙醇作为提取溶剂，以上涉及溶剂法从迷迭香中提取鼠尾草酸的技术方案，存在的主要问题是：(1)均需要高温加热回流、提取二次才能达到提取目的。鼠尾草酸在有氧的条件下长时间操作不稳定，提取转移率降低。(2)提取后需要浓缩才能进行后续如反萃法、层析法等纯化操作，生产步骤增加，能耗增加。(3)高浓度乙醇易挥发，易燃易爆危险性较大。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的是为解决背景技术中存在的问题，提供一种低挥发性、绿色环保、提取率高且易于后续处理的深共晶溶剂，应用于从迷迭香中提取鼠尾草酸，并提供利用这种溶剂提取联合树脂富集法制备高纯度鼠尾草酸的工艺。
6.为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
7.一种利用深共晶溶剂从迷迭香中提取和制备高纯度鼠尾草酸的方法，包括以下步骤：
8.s1：制备共晶溶液体系；
9.s2：将粉碎的迷迭香植物原料按照料液比w/v＝1:10～1:30加入共晶溶液体系中进行提取，提取后固液分离，收集提取液；
10.s3：采用树脂富集法，从提取液制备高纯度鼠尾草酸产品。
11.所述共晶溶剂的氢键受体为氯化胆碱，氢键供体为丙二醇、乙酸、乳酸中的一种或两种，所述氢键受体和氢键供体按照摩尔比1～2:1～3进行配置。
12.所述氢键供体为丙二醇、乙酸、乳酸中的一种，所述氢键受体和氢键供体按照摩尔比1:2进行配置。
13.具体地，按上述摩尔比例混和作为氢键受体(hba)的氯化胆碱和氢键供体(hbd)，在30
‑
70℃温度条件下搅拌30min，得到澄清、均匀的深共晶溶液，也可在常温或加热的条件下采用25k hz频率超声10
‑
30min促进澄清深共晶溶液的形成。待des溶液冷却到室温,得到深共晶溶液体系。
14.所述迷迭香植物原料为唇形科植物rosmarinus officinalis的茎叶，粉碎后的迷迭香植物原料不小于80目，将干燥的迷迭香植物原料进行粉碎，植物材料可选取迷迭香的叶或茎或二者混合的材料为提取原料，提取原料先经过干燥，含水量控制在7％以下，原料进行粉碎，过80目筛。
15.按料液比加入共晶溶剂中进行提取，提取可采用加热提取，30℃条件下保温60分钟，也可以采用超声提取，常温或30℃条件下采用25k hz频率超声提取30
‑
60min，提取后采用过滤或离心的方式进行固液分离，收集清夜为提取液。
16.所述步骤s3树脂富集法为，将提取液用d
‑
101大孔树脂吸附，然后用30％乙醇洗脱共晶溶剂及杂质，再以浓度为85％乙醇作为洗脱液，以2bv
·
h
‑
1的速度洗脱，收集0.5
‑
3bv洗脱液减压真空浓缩、干燥，得鼠尾草酸产品。
17.具体地：鼠尾草酸的化学式为(4ar,10as)
‑
5,6
‑
dihydroxy
‑
1,1
‑
dimethyl
‑7‑
propan
‑2‑
yl
‑
2,3,4,9,10,10a
‑
hexahydrophen anthrene
‑
4a
‑
carboxylic acid，结构式如式i：
[0018][0019]
本技术能产生的有益效果包括：
[0020]
(1)本技术所提供一种深共晶溶剂系统和用于从迷迭香中提取鼠尾草酸的方法，与传统溶剂和现有技术相比，本法提取鼠尾草酸的效率显著高于传统的有机溶剂乙醇，提取物迷迭香气味较小，叶绿素含量低，提取物中鼠尾草酸较传统溶剂提取稳定，脱杂脱溶过程、设备简单，生产成本低，可连续操作，具有极强的实用性和可操作性。
[0021]
(2)本技术所提供一种深共晶溶剂系统，主要采用氯化胆碱为氢键受体，丙二醇或乙酸、乳酸为氢键供体，具有以下有点：1、原料丰富，价格适中。2、无毒无污染。本技术深共晶系统原料无毒，生物相容性较好。几种原料均容易降解、不挥发，环境友好。综上特点，本技术所提供一种深共晶溶剂系统有较强的实用性。
附图说明
[0022]
图1为实施例2鼠尾草酚和鼠尾草酸混合对照品的hplc色谱图，a为鼠尾草酚(rt 3.123)，b为鼠尾草酚(rt 7.234),进样量：10μl，鼠尾草酚及鼠尾草酸浓度均为0.1mg/ml；
[0023]
图2为实施例3中氯化胆碱：乙酸摩尔比为1：2共晶溶剂提取的鼠尾草酸提取液hplc色谱图，a为鼠尾草酚(rt 3.217)，b为鼠尾草酚(rt 7.583)，进样量：10μl；
[0024]
图3为实施例4中鼠尾草酸提取液经d101大孔树脂富集纯化得到高纯鼠尾草酸产品的hplc色谱图，主峰为鼠尾草酚(rt 6.153)，进样量：10μl，纯度83％。
具体实施方式
[0025]
以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，本技术并不局限于这些实施例。
[0026]
如无特别说明，本技术的实施例中的原料、溶剂和助剂均通过商业途径购买，不进行处理。
[0027]
材料及试剂：鼠尾草酸对照品(carnosic acid,cas no.3650
‑9‑
7,纯度：98％，面积归一,mw：332.43，mf：c
20
h
28
o4，批号：180424)；鼠尾草酚对照品(carnosol,cas no.5957
‑
80
‑
2，99％，面积归一)；甲醇，色谱纯，merck公司；磷酸，分析纯，天津大茂化学试剂厂；甲醇,分析纯，天津大茂化学试剂厂；0.22μm有机滤膜，安捷伦有限公司(美国)；纯净水(娃哈哈)；氯化胆碱：食品级，食品添加剂公司；丙二醇，甘油，乙酸，柠檬酸，乳酸，苹果酸，葡萄糖，蔗糖，果糖均为分析纯，云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司。
[0028]
测试所用仪器：
[0029]
安捷伦高效液相色谱仪，agilent technologies 1100series apparatus，安捷伦公司(美国)；
[0030]
sqp十万分之一分析天平，sartorius科学仪器有限公司；
[0031]
电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；
[0032]
l535r
‑
1离心机，湘仪离心机仪器有限公司；
[0033]
kq5200b超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
[0034]
1.实验原理
[0035]
迷迭香干燥或半干燥样品，粉碎，超声提取制备供试品液，高效液相色谱仪
‑
二极管阵列紫外检测器(hplc
‑
dad)联反相色谱柱分离检测分析，鼠尾草酸、鼠尾草酚含量采用外标法定量。
[0036]
2.色谱条件
[0037]
色谱柱：elite hypersil c
18
(150mm
×
4.6mm，5μm)
[0038]
流速：0.6ml/min
[0039]
温度：40℃
[0040]
进样量：10μl
[0041]
流动相(鼠尾草酸\鼠尾草酚)：80％甲醇
‑
0.5％磷酸，检测波长220nm
[0042]
3.对照品溶液配制和标准曲线测定
[0043]
分别精密称量鼠尾草酸和鼠尾草酚对照品约2.0mg，用流动相溶解后定容成2ml，0.22μm有机滤膜过滤，取续滤液，得迷迭香酸对照品液和鼠尾草酸、鼠尾草酚混合对照液。
以此溶液为基础液,配制混合梯度标准溶液,使鼠尾草酸浓度梯度在0.010mg/ml
‑
1.000mg/ml。在2色谱条件下,对标准溶液进行测定,重复进样一次。根据标准溶液浓度和峰面积,绘制标准曲线。线性关系应达到r2≥0.99。记录标准曲线的线性公式y＝a
×
c+b。其中,c是鼠尾草酸的浓度,y是这个浓度对应的峰面积,a和b分别为标准曲线的斜率和截距。
[0044]
4.样品溶液制备和测定
[0045]
取粉碎后迷迭香植物样，烘干至恒重，取1g样品精密称定，置100ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度线，超声提取30分钟，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤后，取续滤液得迷迭香植物样品测试液。
[0046]
取鼠尾草酸提取液样，精确吸取1ml，置100ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度线，0.22μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得鼠尾草酸提取液测试液。
[0047]
取高纯度鼠尾草酸产品样，30℃烘干至恒重，取约100mg精密称定，置100ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度线，0.22μm有机滤膜过滤，取续滤液，即得测试液。在2所述色谱条件下,对各试样测试液进行测定,重复进样一次。参考迷鼠尾草酸和鼠尾草酚的相对位置确定出两者的响应峰,记录鼠尾草酸的峰面积y1。
[0048]
5.鼠尾草酸提取率计算
[0049]
5.1鼠尾草酸的浓度c
[0050]
鼠尾草酸的浓度c,单位为毫克每毫升(mg/ml),按式(1)计算:
[0051]
c＝(y1
–
b)/a
ꢀꢀꢀ
(1)
[0052]
式中:
[0053]
y1———试样溶液中的鼠尾草酸的峰面积；
[0054]
b———鼠尾草酸标准曲线公式中的截距；
[0055]
a———鼠尾草酸标准曲线公式中的斜率。
[0056]
5.2鼠尾草酸的提取率e(％)，按式(2)计算:
[0057]
e％＝c*v*v*100/wr
ꢀꢀꢀ
(2)
[0058]
式中:
[0059]
c———试样溶液中的鼠尾草酸的浓度c,单位为毫克每毫升(mg/ml)；
[0060]
v———共晶溶剂体系的体积，单位毫升(ml)；
[0061]
v———样品测试液体积，为100ml；
[0062]
wr———迷迭香原料的重量，单位毫克(mg)。
[0063]
5.3鼠尾草酸的含量鼠尾草酸的含量w(％)，按式(3)计算:
[0064]
w％＝c*v*100/wc
ꢀꢀꢀ
(3)
[0065]
式中:
[0066]
c———试样溶液中的鼠尾草酸的浓度c,单位为毫克每毫升(mg/ml)；
[0067]
v———样品测试液体积，为100ml；
[0068]
wc———高纯度鼠尾草酸产品的重量，单位毫克(mg)。
[0069]
5.4迷迭香植物中鼠尾草酸的含量
[0070]
迷迭香植物中鼠尾草酸的含量(％)，按式(4)计算:
[0071]
con％＝c*v*100/wr
ꢀꢀꢀ
(4)
[0072]
式中:
[0073]
c———试样溶液中的鼠尾草酸的浓度c,单位为毫克每毫升(mg/ml)；
[0074]
v———样品测试液体积，为100ml；
[0075]
wr———迷迭香原料的重量，单位毫克(mg)。
[0076]
6.测定结果
[0077]
本实验所用迷迭香植物原料鼠尾草酸含量为3.52％。
[0078]
各样品测试结果见相关实施例。
[0079]
实施例1：深共晶溶剂体系的制备条件选择
[0080]
如表1所示摩尔比将hba(氯化胆碱)和hbd试剂加入烧瓶中，分别在30、50和70℃温度条件下搅拌30min，搅拌观察共晶溶剂的性状情况，hbd为葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖等固体组加入等重水，分别在30、50和70℃温度条件下搅拌30min，观察共晶溶剂性状情况。
[0081]
实验结果显示：30℃加热搅拌30min，大部分溶剂不能形成透明均匀的液体，50℃加热搅拌30min，所有组均能形成均匀的液体，70℃加热搅拌30min。葡萄糖和蔗糖为hbd试剂的组颜色变黄。因此，优选50℃加热搅拌30min制备共晶溶剂。
[0082]
表1氯化胆碱深共晶溶剂系统组成及不同温度下性状
[0083]
[0084][0085]
实施例2不同天然深共晶溶剂体系条件选择
[0086]
按表2所示摩尔比将hba(氯化胆碱)和hbd试剂加入烧瓶中，50℃加热搅拌30min，放置室温，按重量加入等重量的水，混匀，按料液比(w/v＝1：20)加入80
‑
100目干燥的迷迭香植物原料(含水量<7％，鼠尾草酸含量为3.52％)，加热到30摄氏度提取60分钟，提取完毕后4000rpm离心10min，收集离心清液，减压浓缩至膏状，得鼠尾草酸提取物，每组平行三次。取样按实施例1方法检测和计算鼠尾草酸含量。得表2所示结果。鼠尾草酸典型图谱见附图1。
[0087]
表2氯化胆碱深共晶溶剂系统组成及提取率(n＝3)
[0088]
[0089][0090]
实验结果显示传统溶剂含水乙醇一次提取率随乙醇浓度的增加而增加，无水乙醇同等条件下提取率最高。实验结果还显示hbd为丙二醇、乙酸和乳酸组共晶溶剂体系同等条件下从迷迭香植物原料中提取鼠尾草酸的提取率(分别为3.35％，3.21％及3.02％)均优于无水乙醇对照组(2.98％)。因此优选氯化胆碱与丙二醇、乙酸或乳酸分别按1：2，1：2，1：3组成深共晶溶剂体系，最优选氯化胆碱与丙二醇1：2组成深共晶溶剂体系，因原料的鼠尾草酸的含量是3.52％，最优选体系提取率为3.35％，一次提取鼠尾草酸已达到95.2％的转移率。
[0091]
按表3所示摩尔比将hba(氢键受体)和hbd(氢键供体)试剂加入烧瓶中，50℃加热搅拌30min，放置室温，按重量加入等重量的水，混匀，按料液比(w/v＝1：20)加入80
‑
100目干燥的迷迭香植物原料(含水量<7％，鼠尾草酸含量为3.52％)，采用超声提取，常温条件下采用25khz频率超声提取40min，收集离心清液，减压浓缩至膏状，得鼠尾草酸提取物，每组平行三次。取样检测和计算鼠尾草酸含量。得表3所示结果。
[0092]
表3共晶体系溶剂系统组成及提取率(n＝3)
[0093]
[0094][0095]
通过以上测试结果可知，在氯化胆碱作为氢键受体情况下，采用超声提取鼠尾草酸的效果更好，均达到了3％以上，而通过不同的供体进行搭配混合的情况下，提取效果也非常的好，分别达到3.15％、3.36％、3.41％。
[0096]
实施例3提取条件料液比优化
[0097]
按表2所示摩尔比将hba(氯化胆碱)和hbd试剂加入烧瓶中，50℃加热搅拌30min，放置室温，按重量加入等重量的水，混匀，按表4所示料液比(w/v)加入80
‑
100目干燥的迷迭香植物原料(含水量<7％)，加热到30摄氏度提取60分钟，提取完毕后4000rpm离心10min，收集离心清液，减压浓缩至膏状，得鼠尾草酸提取物，每组平行三次。取样按实施例1方法检测和计算鼠尾草酸含量。得表4所示结果。鼠尾草酸典型图谱见图2。
[0098]
表4氯化胆碱深共晶溶剂不同料液比提取率(n＝3)
[0099]
[0100][0101]
实验结果显示各组溶剂鼠尾草酸提取率随提取溶量的增加而增大，对于三种深共晶溶剂体系，料液比(v/w)为1：20组与1：30组差别较小，考虑成本经济因素，料液比(v/w)优选1：20。
[0102]
实施例4树脂富集法制备高纯度鼠尾草酸
[0103]
按表4称取氯化胆碱及丙二醇混匀，50℃加热搅拌30min，放置室温，按重量加入水，混匀，加入80
‑
100目干燥的迷迭香植物原料(含水量<7％)，加热到30摄氏度搅拌提取150分钟，提取完毕后4000rpm离心10min，收集离心清液，减压浓缩至原体积1/15，用d101大孔吸附树脂为层析材料进行柱层析(1bv＝4l)，柱径高比选用1：7，上样量为50g/lbv(柱床体积),上样速度为0.5bv/h，然后用1
‑
1.5bv，浓度为30％乙醇洗脱共晶溶剂及杂质，再以浓度为85％乙醇作为洗脱液，以2bv
·
h
‑
1的速度洗脱鼠尾草酸部分，收集0.5
‑
3bv洗脱液减压真空浓缩、干燥，得高纯度鼠尾草酸产品。取样按实施例1所述方法检测和计算鼠尾草酸含量。实验平行3次，得表5所示结果。高纯度鼠尾草酸产品典型图谱见图3。
[0104]
表5 3批样品树脂富集制备高纯度鼠尾草酸产品纯度
[0105][0106][0107]
*
产品得率＝(恒重后高纯度鼠尾草酸产品/迷迭香)*100计算
[0108]
实验结果显示，上述提取和富集工艺制备的鼠尾草酸产品含量>80％。产品得率>3％。
[0109]
尽管这里参照本技术的多个解释性实施例对本技术进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本技术公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本技术公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。