一种用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的双重PCR引物及检测方法

一种用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的双重pcr引物及检测方法
技术领域
1.本发明属于植物病原物分子检测技术领域，具体涉及一种用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的双重pcr引物及检测方法。


背景技术：

2.荔枝(litchi chinensis)味佳、色美、营养丰富，被誉为“果中之王”，是热带和亚热带地区水果，分布遍及海南、福建、广西、广东、台湾等省，具有重要经济价值。由霜疫霉菌(peronophythora litchii)和荔枝炭疽病菌(colletotrichum gloeosporioides)引起的荔枝霜疫霉病和荔枝炭疽病是目前荔枝生产上最重要病害，严重影响荔枝产量、品质以及鲜果贮运和外销。这两种荔枝病害目前在福建、广东、广西、海南、云南、台湾等地均有严重发生，其危害的直接后果就是导致荔枝产量和果实品质下降，制约了荔枝产业的发展。这两种病害不仅严重为害接近成熟的果实，也为害嫩梢、叶片、花穗、结果小枝、果柄及幼果，引起大量落果和烂果，产量损失高达80％以上，甚至绝收，造成巨大经济损失。近几年这两种荔枝病害流行频率和流行程度有逐渐加重的趋势，已成为荔枝生产上的一个重要障碍。由于这两种荔枝病害的病原菌虽然不同，但是它们的发病流行条件相似，危害荔枝部位(如接近成熟的果实、嫩梢、叶片、花穗、结果小枝、果柄及幼果)基本一致，早期症状均引起大量落果和烂果，也均具有潜伏侵染的特性。因此，鉴于荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌的巨大破坏性，为防止该病扩散蔓延，建立早期快速检测及鉴定区分引起这两种病害的病原菌，为有效指导病害防控具有重要意义。
3.植物病原菌的检测方法通常有生物学、血清学和分子生物学等手段。但就荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌而言，由于两种病菌均在荔枝叶片和果实上引起症状，其早期症状上又非常相似之处，单从症状上区别鉴定这2种病害非常困难；血清学具有快速简便、高通量等优点，但对制备抗体的特异性有较高要求；分子检测技术因其快速、灵敏、特异、准确等优点，被广泛应用于植物病原菌的快速检测和鉴定，以及病害的早期检测与诊断中。随着生物技术的发展，基于核酸的多重检测技术在核酸诊断领域发挥了越来越重要的作用，主要包括以多重pcr、核酸等温扩增、基因芯片为基础的多重核酸检测技术，这些技术可对多个靶标进行同时检测，具有快速、高通量、样品消耗少等特点。多重pcr是一种pcr衍生方法，它的基本原理、反应试剂和操作均与常规pcr相同，区别在于多重pcr体系中含有2对或多对引物，分别扩增不同模板，可对多个靶标进行同时检测。该发明使用的双重pcr(duplex polymerase chain reaction)是在同一个反应体系对2个dna模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的pcr技术，能够一次实现对2种病原菌的检测，其特点是耗时短的同时提高准确性和灵敏度。双重pcr技术具有节省时间、降低成本和提高效率的优势，在植物病原菌的鉴定和检测，尤其是对症状类似或病原菌复合侵染的检测中具有广泛的应用前景。
4.目前，国内外对荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌这2种病菌的分子检测技术已有报道，但是这些研究均只是单独检测一种病菌，目前还未见有同步区分检测荔枝霜疫霉菌和
荔枝炭疽病菌的报道，双重pcr技术可在一次反应中同时检测2种病菌，可大幅节约检测时间，提高检测效率，降低检测成本。因此，本领域亟需建立一种简单快速、特异性好、灵敏度高的用于区分检测荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌的双重pcr技术。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术的不足，本发明提供一种用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的双重pcr引物及检测方法。
6.本发明技术方案主要包括以下内容：
7.根据seq id no.1和seq id no.2所示的核苷酸序列，设计用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌(peronophythora litchii)和炭疽病菌(colletotrichum gloeosporioides)的双重pcr引物，所述双重pcr引物由引物plf1/plr1和cgf1/cgr1组成，引物的核苷酸序列为：
8.plf1：5
’‑
ttcggtctgaactagtagct
‑3’
(seq id no.3)
9.plr1：5
’‑
ttcagcgggtaatcttgcct
‑3’
(seq id no.4)
10.cgf1：5
’‑
tcttctgagtggtacaagc
‑3’
(seq id no.5)
11.cgr1：5
’‑
taaagttactacgcaaagga
‑3’
(seq id no.6)。
12.本发明还可以涉及一种试剂盒，该试剂盒包括上述双重pcr专用引物以及其他必要的pcr反应试剂。该试剂盒和引物可应用于检测、区分荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌。
13.另一方面，本发明还提供一种同步检测荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌的方法，包括以下步骤：
14.1)提取待测样品dna；
15.2)以待测样品dna为模板，用权利要求1所述的双重pcr引物进行双重pcr扩增；
16.3)结果判定：对双重pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物的大小进行结果判定。若扩增获得694bp单一目的条带说明待测样本含有荔枝霜疫霉菌；扩增获得286bp单一目的条带说明待测样本含有荔枝炭疽病菌；扩增获得2条分别为694bp和286bp目的条带说明待测样本同时含有荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌。
17.优选的，双重pcr扩增的反应体系为：
[0018]2×
taq pcr master mixⅱ20μl，10μm引物plf1/plr1共0.5μl，10μm引物cgf1/cgr1共2μl，50μg/ml
‑1dna模板1μl，无菌水补足40μl。
[0019]
优选的，双重pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸5min。
[0020]
本发明所取得的效果：
[0021]
本发明方法适用于植株中同步区分荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中区分荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。
[0022]
本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
[0023]
1、特异性强：本发明检测方法是根据种间变异、种内保守的its序列的保守区和进化区相互间隔的特点设计了一对特异引物组合进行检测。已经对来自不同地区的荔枝霜疫霉菌、荔枝炭疽病菌和其它不同近缘种病菌进行验证，结果具有很强的特异性；
[0024]
2、实用性好：本发明所设计特异性引物组合，可用于对荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽
病菌的高灵敏度快速分子检测，本发明的双重pcr检测方法与传统症状识别、病原菌形态鉴定以及普通单引物pcr或lamp相比，建立的双重pcr检测方法的实用性强，可满足对带菌植株中区分荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；
[0025]
3、操作简便快速：应用本发明方法，对带荔枝霜疫霉菌和(或)荔枝炭疽病菌的dna提取、pcr扩增和常规的琼脂糖凝胶电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程可在数小时内完成；
[0026]
4、省时省力，检测成本低：荔枝霜疫病菌和荔枝炭疽病菌是荔枝生产上最重要也是最常见的致病菌，其发病部位相似，早期症状不易区分，常规需要通过病原分离鉴定。利用本发明可以一次检测两种病原菌，全部反应在2个小时内完成，省时省力。同时，利用本发明不需要昂贵的荧光pcr仪，也不需要合成昂贵的探针及相应的试剂，检测成本低，操作简便，利于推广应用。
附图说明
[0027]
图1：实施例1荔枝霜疫霉菌特异性检测结果图。图中泳道顺序依次为m：dl2000 dna marker；1：荔枝霜疫霉scilzy1；2：西瓜疫霉；3：黄瓜疫霉；4：草莓疫霉；5：芋疫霉；6：寄生疫霉；7：辣椒疫霉；8：樟疫霉；9：豇豆疫霉；10：phytopythium(柑桔)；11：恶疫霉；12：大豆疫霉；13：隐地疫霉；14：掘氏疫霉；15：瓜果腐霉；16：荔枝炭疽；17：荔枝炭疽；18：西瓜炭疽；19：辣椒炭疽；20：致病疫霉；
[0028]
图2：实施例2荔枝霜疫霉菌巢式pcr灵敏性检测结果图。m：dl2000 dna marker；1
‑
8:20μl体系中分别含有10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg dna；
[0029]
图3：实施例3双重pcr检测荔枝霜疫霉和荔枝炭疽菌结果图。m：dl2000 dnamarker；1：荔枝霜疫霉scilzy1；2：荔枝霜疫霉xp
‑
19；3：荔枝炭疽菌fzx
‑
14；4：荔枝炭疽菌lzw
‑
9；5：荔枝霜疫霉scilzy1与荔枝炭疽菌fzx
‑
14混合dna；6：荔枝霜疫霉xp
‑
19与荔枝炭疽菌lzw
‑
9混合dna；7：阴性对照(dd.h2o)。
具体实施方式
[0030]
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
[0031]
实施例1：检测引物对荔枝霜疫霉菌的特异性扩增
[0032]
(1)特异性检测pcr反应体系：25.0μl，包括2
×
taq pcr master mix12.5μl，10μmol/l的荔枝霜疫霉引物(plf1/plr1)各0.5μl，50ng dna模板，不足部分由dd h2o补足。pcr反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸5min。
[0033]
plf1：5
’‑
ttcggtctgaactagtagct
‑3’
[0034]
plr1：5
’‑
ttcagcgggt aatcttgcct
‑3’
[0035]
(2)检测结果：检测的特异性：除了来自不同地区的荔枝霜疫霉菌dna可特异地扩增出694bp的产物外，检测了14种不同卵菌及5种真菌dna均未能扩增出任何产物，具有很强的特异性。
[0036]
实施例2：引物对荔枝霜疫霉菌的灵敏度检测
[0037]
1.dna浓度稀释：提取的荔枝霜疫霉菌基因组dna，经分光光度计测定浓度后，采用
系列浓度稀释。
[0038]
2.荔枝霜疫霉菌的灵敏度检测
[0039]
采用10倍浓度系列稀释法将提取的荔枝霜疫霉菌dna依次稀释成10ng/μl、1ng/μl，100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl共8个不同浓度梯度，采用巢式pcr对引物的灵敏度进行测定。
[0040]
分别取1μl不同浓度的荔枝霜疫霉菌基因组dna为模板，以引物plf1/plr1进行第一轮pcr扩增，反应体系25.0μl，包括2
×
taq pcr master mix 12.5μl，10μmol/l的引物(plf1/plr1)各1.0μl，50ng dna模板，不足部分由dd h2o补足。pcr反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸5min。反应结束后将pcr产物稀释100倍，分别取1μl做为dna模板，用引物(plf2/plr2)进行第二轮pcr扩增，反应体系25μl，包括：2
×
taq pcr master mix12.5μl，10μmol/l的引物(plf2/plr2)各0.5μl，25ng dna模板，不足部分由dd h2o补足。pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共28个循环；72℃延伸5min。
[0041]
pl f2：5
’‑
cagacgtgaagtgtcttgca
‑3’
(seq id no.7)
[0042]
pl r2：5
’‑
tacatagctacggttcaccaa
‑3’
(seq id no.8)
[0043]
3.检测结果：在25μl反应体系中，荔枝霜疫霉菌基因组dna可获得明显扩增条带，检测灵敏度可达10fg/25μl反应体系。
[0044]
实施例3：同步检测荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌的双重pcr扩增
[0045]
(1)提取待测样品dna，以待测样品dna为模板进行双重pcr扩增。双重pcr反应体系为：2
×
taq pcr master mixⅱ20μl，10μm引物plf1/plr1共0.5μl(2条各0.25μl)，10μm引物cgf1/cgr1共2μl(2条各1μl)，50μg/ml
‑1dna模板1μl，无菌水补足40μl。双重pcr反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸5min。
[0046]
(2)检测结果：对双重pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若获得694bp单一目的条带说明待测样本含有荔枝霜疫霉菌，若获得286bp单一目的条带则说明待测样本含有荔枝炭疽病菌，若扩增获得2条分别为694bp和286bp目的条带说明待测样本同时含有荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌。
[0047]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。