一种circRNA、产品及其应用

一种circrna、产品及其应用
技术领域
1.本发明涉及农业基因工程技术领域，具体涉及一种检测羊皮下脂肪的circrna、产品及其应用。


背景技术：

2.circrna是最早发现于植物病毒以及流感病毒中的一类闭合环状rna分子，经特殊剪切生成。circrna不具5'帽子和3'多聚腺苷酸结构，相较线性rna来说，由于核糖核酸酶不能降解circrna，因此circrna更加稳定。内源性竞争circrna还可以影响mirna活性，进而调控基因表达，推测circrna可能通过以上原理对成脂分化进行调节。研究发现在前体脂肪细胞体外分化体系试验中有31种circrna会随脂肪分化过程显著升高，相关性分析表明这些circrna分子的表达可能与对应的线性rna表达状态相关。有研究在对莱芜猪与大白猪皮下脂肪组织进行探索时发现，circrna_26852和circrna_11897可以靶向那些富集到与脂代谢以及疾病相关通路中的基因。circacc1通过促进lo2肝细胞ampk全酶组装、活性和稳定性，使脂肪酸β氧化得到促进。因此，推测circrna有可能参与了脂质代谢的调节，并可以为脂代谢相关性疾病提供潜在靶点。
3.有关于羊皮下脂肪脂肪相关的研究目前较少，为了进一步发现新的与羊皮下脂肪相关的circrna，发明人基于高通量测序技术，选取脂肪沉淀存在较大差异、具有代表性的多浪羊(d)与小尾寒羊(x)为研究对象，前者属于肉脂兼用型绵羊，脂臀较大，后者属于短瘦尾型绵羊，皮下脂肪较少，筛选鉴定出与脂代谢以及成脂分化关键候选基因，探究脂肪沉积相关的分子机制。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的是提供一种与绵羊脂肪相关的circrna，所述circrna是经过全转录组学测序筛选并使用分子实验验证获得的。
5.一种circrna，序列与seq id no.1具有90％以上序列同源性。
6.优选的，circrna序列与seq id no.1具有95％以上序列同源性；更优选的，长链非编码rna序列为seq id no.1。
7.本发明的第二目的是提供一种产品，所述产品包括检测样品中上述circrna的试剂。
8.优选的，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。
9.优选的，所述试剂包括采用测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测样品circrna的表达水平试剂。
10.优选的，采用高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量pcr技术检测样品circrna的表达水平。
11.优选的，试剂包括特异性识别circrna的探针，或特异性扩增circrna的引物。
12.优选的，所述特异性扩增circrna的引物序列为seq id no.2和seq id no.3。
13.优选的，所述样品为脂肪组织，更优选的脂肪为皮下脂肪或肌内脂肪。
14.本发明的第三目的是提供上述circrna在预测或辅助羊肉品质中的应用。
15.本发明的第四目的是提供上述circrna在制备预测或辅助羊肉品质试剂中的应用。
16.本发明的第五目的是提供上述circrna在选育具有不同肌肉品质羊中的应用。
17.所述肉用性能是指产肉量、胴体组成、肉中脂肪含量、肉品等级、脂肪色泽、肌内脂肪含量等方面的性能。
18.本发明的第六目的是提供上述产品在预测或辅助羊肉品质中的应用。
19.本发明的第七目的是提供上述产品在制备预测或辅助羊肉品质试剂中的应用。
20.本发明的第八目的是提供上述产品在选育具有不同肌肉品质羊中的应用。
21.本发明的第九目的是提供一种检测羊脂肪含量的方法，包括：(1)选取羊脂肪组织；(2)检测样品中上述circrna的表达量。
22.优选的，脂肪为皮下脂肪或肌内脂肪
[0023]“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，经过修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或者是可通过dna或rna聚合酶，或者通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。如此，例如，本文中所定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链dna，包含单链区和双链区的dna，单链和双链rna，及包含单链区和双链区的rna，包含dna和rna的杂合分子，它可以是单链的，或者更典型的是双链的，或者包含单链区和双链区。另外，术语“多核苷酸”在用于本文时指包含rna或dna或rna和dna二者的三链区。此类区中的链可来自相同分子或来自不同分子。所述区可包含一种或多种分子的整个，但是更典型的是只包含有些分子的一个区。三股螺旋区的分子之一常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”明确包括cdna。
[0024]
多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物缀合。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如甲基膦酸酯，磷酸三酯，磷酰胺酯(phosphoamidate)，氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶，毒素，抗体，信号肽，聚l
‑
赖氨酸等)的修饰，具有嵌入剂(例如吖啶，补骨脂素等)的修饰，含有螯合剂(例如金属，放射性金属，硼，氧化性金属等)的修饰，含有烷化剂的修饰，具有经修饰连接(例如α端基异构核酸)的修饰，以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基基团可以用例如膦酸基团，磷酸基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可缀合至固体或半固体支持物。可磷酸化或者用胺或1
‑
20个碳原子的有机加帽基团模块取代5’和3’末端oh。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸也可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2
’‑
氧
‑
甲基
‑
，2
’‑
氧
‑
烯丙基
‑
，2
’‑
氟
‑
或2
’‑
叠氮
‑
核糖，碳环糖类似物，α
‑
端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖，木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。多核苷酸可含有一处或多处不同类型的
本文中描述的修饰和/或多处相同类型的修饰。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括rna和dna。
[0025]
如本文中所使用的，“寡核苷酸”一般指短的，单链的多核苷酸，其在长度上小于约250个核苷酸，但这不是必须的。寡核苷酸可以是合成的。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样且完全可适用于寡核苷酸。
[0026]
如本文所用“引物”指能够与核酸杂交并允许互补核酸的聚合作用(一般通过提供游离的3
’‑
oh基团)的单链多核苷酸。
[0027]
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术。
[0028]
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于rna在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将rna逆转录成dna。
[0029]
核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的dna的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些dna片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板dna进行测序。
[0030]
核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ish)、微阵列和southern或northern印迹。原位杂交(ish)是一种使用标记的互补dna或rna链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ish)中的特异性dna或rna序列的杂交。dna ish可用于确定染色体的结构。rna ish用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mrna和其他转录本(例如，ncrna)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ish也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
[0031]
本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncrna)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt
‑
pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，pcr)需要在扩增前将rna逆转录成dna(例如，rt
‑
pcr)，而其他扩增技术则直接扩增rna(例如，tma和nasba)。
[0032]
通常称为pcr的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；tma的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和ph的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个rna拷贝自身催化地生成另外的拷贝；lcr的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补dna寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为nasba的基于核酸序列的扩增；使用rna复制酶(通常称为qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；
以及自我维持的序列扩增。
[0033]
在本发明中，产品包括检测circrna的试剂，以及选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。
[0034]
本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择
[0035]
本发明的优点和有益效果：(1)首次发现了序列如seq id no：1所示的circrna及其与绵羊肉用性能相关；(2)在实际生产中，可以通过调控circrna的表达，从而改善绵羊的肉用性能，提高肉感，因此本发明为畜牧业生产提供了理论基础和技术启示。
附图说明
[0036]
图1为脂肪组织差异表达circrna go注释；
[0037]
图2为脂肪组织差异表达circrna kegg通路富集分析；
[0038]
图3为circrna基因差异表达qrt
‑
pcr验证结果。
具体实施方式
[0039]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
[0040]
实施例1样品的采集剂rna提取
[0041]
1.1样品的采集
[0042]
本试验以脂肪沉积存在差异的多浪羊(d)与小尾寒羊(x)为对象进行研究。选取的羊只均为成年雌性，并且个体体况良好、健壮无病，体重相近(约50kg)，每组有三个生物学重复。
[0043]
1.2样本rna的提取和质量检测
[0044]
取出各样品中等量的脂肪组织用作提取总rna，确保整个流程在无菌环境下进行，步骤如下：
[0045]
(1)分别在加有液氮的研钵里研磨脂肪组织；
[0046]
(2)将研磨好的组织放入加有trizol试剂的离心管中静置；
[0047]
(3)加入氯仿混匀并在室温下静置10分钟；
[0048]
(4)放入离心机中，在4℃条件下，转速12000，离心15分钟；
[0049]
(5)将最上层无色液体放入rnase free管中，用等量异丙醇来沉淀rna，室温下混合均匀静置10分钟；
[0050]
(6)再次在温度为4℃、转速为12000条件下离心15分钟；
[0051]
(7)将上清液去除，在沉淀中加入乙醇(75％)充分混匀后，再一次在上述条件下离心；
[0052]
(8)去除上清液，继续加乙醇清洗rna2
‑
3次；
[0053]
(9)弃乙醇，沉淀干燥处理5
‑
10分钟；
[0054]
(10)最后沉淀物用rna无酶水处理。
[0055]
为保证总rna纯度及完整性，将其进行质量检测：
[0056]
建库测序的要求是rna总量不少于2ug，对longrna(mrna、lncrna、circrna)的文库构建采用truseqtm stranded total rna kit试剂盒，rna总量为2μg，浓度在100ng/μl以上，od260/280范围是1.8
‑
2.2。
[0057]
分别对多浪羊和小尾寒羊的6个皮下脂肪组织提取总rna并进行质量检测，结果可见28s条带亮度相对于18s来说均显著较高；各样本rna浓度高于200ng/μl；rin值均大于8，od260/280≥1.8，od260/230≥1.0，说明rna没有被碳水化合物和蛋白质等杂质污染，且完整性较好，可在后续试验中继续应用。
[0058]
实施例2测序及数据分析
[0059]
使用illumina novaseq 6000测序平台测序。circrna呈封闭的环形，由分别处在上游与下游的外显子剪接受体与供体位点反向连接而成，属于非编码rna分子，rna外切酶对其没有影响，更不易降解，所以更加稳定。线性rna片段可以通过线性比对软件进行比对，但是处于环状rna的反式剪切位置的reads无法直接比对上基因组。基于back splice junction(bsj)reads，利用相关软件(ciri2+find_circ取并集)进行circrna预测，并与数据库circbase(动物)进行比较。
[0060]
根据circrna在基因组上的起始点和终止点进行分类。第一类终止点和起始点均位于基因的外显子区域为exon circrna。第二类起始点或终止点某一端位于基因的内含子区域为intron circrna。第三类起始点或终止点某一端位于基因间区或当起始点和终止点均位于基因外显子区域，但两个外显子不在同一个基因上时，circrna分类为inergenic circrna。
[0061]
样本表达量差异分析。使用rpm(reads per millon reads)，作为定量指标，计算公式为：
[0062]
rpm＝total exon reads/mapped reads(millions)
[0063]
其中，total exon reads表示某个样本mapping到特定基因外显子上的全部reads；mapped reads代表某个样本的全部reads总量。在多浪羊与小尾寒羊皮下脂肪组织中共得到18947个circrna，对这些数据进行差异表达分析，(以|fold change|≥2.0，pvalue<0.05为标准进行筛选)，在两品种羊皮下脂肪组织中共存在141个差异表达的circrnas，其中有61个差异基因上调表达，80个下调表达。其中差异表达显著的circrna——nc_040256.1_12467238_12540333是本技术首次发现，作为我们后续的候选分子中。
[0064]
为了了解差异表达基因以及基因产物的功能，使用go注释对差异表达基因进行三方面的注释分析，包括生物过程、细胞成分和分子功能。对差异circrna的来源基因进行分析，发现共富集到379个条目，以pvalue<0.01为条件筛选到了99个条目。如图1，差异表达circrna来源基因在分子功能，主要富集在翻译抑制活动(translation repressor activity)、瘦素受体结合(leptin receptor binding)、三磷酸酶活性(triphosphatase activity)等条目；在细胞组分，主要富集在核糖核蛋白颗粒(ribonucleoprotein granule)、纤维状胶原三聚体(fibrillar collagen trimer)、核苷酸激活的蛋白激酶复合物(nucleotide
‑
activated protein kinase complex)、细胞质核糖核蛋白颗粒
(cytoplasmic ribonucleoprotein granule)；在生物过程，蛋白质激活级联(protein activation cascade)、质膜结合细胞投射组件(plasma membrane bounded cell projection assembly)、囊泡细胞骨架运输(vesicle cytoskeletal trafficking)和tor信号的调节(regulation of tor signaling)等过程。通过go功能研究发现，差异表达circrna的来源基因通过调控瘦素受体结合酶、三磷酸酶等与脂肪沉积相关的酶活性调节参与到脂肪发育中来。
[0065]
在多浪羊和小尾寒羊的皮下脂肪组织中，circrna的来源基因共富集到110条通路中(图2，以pvalue<0.05为条件进行筛选，共得到了3个显著富集通路，蛋白质消化吸收(protein digestion and absorption)、胰高血糖素信号通路(glucagon signaling pathway)和调节脂肪细胞中的脂肪分解(regulation of lipolysis in adipocytes)。通过kegg通路分析表明，差异表达circrna来源基因在多浪羊与小尾寒羊皮下脂肪组织中参与到脂肪代谢相关的通路中，富集到通路中的差异基因可能对于两品种羊皮下脂肪沉积具有重要的调控作用。
[0066]
实施例3实时荧光定量pcr检测验证
[0067]
本实验分别收集20只多浪羊和小尾寒羊，在两个组之间对差异表达的circrna进行pcr检测，每个基因3个重复，验证nc_040256.1_12467238_12540333基因差异表达情况。
[0068]
主要方法如下：
[0069]
用circrna cdna synthesis kit(genepool，cat#gpq1805)进行反转录，反应体系为：2
×
fastsybr mixture，10μl；下游引物(10um)与上游引物(10um)各0.4μl；模板，2μl；灭菌蒸馏水至20μl。引物信息见表。
[0070]
表1 pcr反应结果
[0071][0072]
反应结束后导出数据，用2
‑
δδct
法计算样本相对表达情况，t
‑
检验统计分析相对表达情况，数据显示为平均数
±
标准差(mean
±
sd)，p＜0.05为显著。pcr数据分析及结果，利用2
‑△△
ct
法计算circrna基因在各个样本间的相对表达量，数据表示为平均数
±
标准差(mean
±
sd)，p<0.05表示该基因在两组间差异显著。结果表明，nc_040256.1_12467238_12540333基因在小尾寒羊羊皮下脂肪组织中显著上调表达。
[0073]
本技术通过功能注释及富集分析筛选得到与脂肪沉积紧密相关的circrna基因，荧光定量pcr实验结果进一步验证了该结论。