用于核酸提取的组合物和方法与流程

用于核酸提取的组合物和方法
1.本技术是申请日为2014年3月14的中国专利申请 201480015429.6“用于核酸提取的组合物和方法”的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及生物技术领域，更具体涉及核酸提取领域。本发明通过提供用于从细胞来源材料(包括细菌、酵母和福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织)提取核酸的一步方法解决核酸提取的现有技术问题。


背景技术：

3.从细胞来源材料、特别是石蜡包埋的组织样品(例如，福尔马林固定的石蜡包埋的样品：ffpe)提取核酸的现有技术方法涉及复杂的多步骤过程。
4.从痰液中的分枝杆菌提取核酸，例如，是一个挑战，因为痰液是非常粘稠的，且不容易处理用于核酸提取。痰液样品通常使用n
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乙酰基
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l
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半胱氨酸
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氢氧化钠(nalc
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naoh)处理(coulter and charache, sputum digestion/decontamination for mycobacteriology culture
ꢀ–ꢀ
guidelines, smile, john hopkins university, 2008)溶解，且分枝杆菌通过离心沉淀。nalc
‑
naoh处理不杀灭分枝杆菌，且进行通过热和/或化学品的进一步处理来灭活样品。可以使用几种裂解细胞的技术从细胞沉淀提取核酸。超声处理(colin,等人, method and apparatus for ultrasonic lysis of biological cells, 美国专利号6,686,195, 2004)、珠击(melendes,等人, cell disrupting apparatus, 美国专利号5,464,773, 1995)、酶(salazar和asenjo, enzymatic lysis of microbial cells, biotechnol lett (2007) 29:985
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994)、混合(涡旋)、机械剪切和离液溶液(das, 等人, method for detecting pathologenic mycobacteria in clinical specimens, 美国专利号7,638,309, 2009)是一些用于打破沉淀细胞用于核酸提取的方法。这些步骤是除了实际提取程序之外的，且为整个过程添加复杂性和时间。
5.从酵母提取核酸也是核酸(例如，dna)样品制备中更有挑战性的技术之一。酵母是真菌，且具有难以裂解的细胞壁(lipke和ovalle, cell wall architecture in yeast:new structure and new challenges, j bacteriol 1998, 180(15):3735)。使用现有技术的离液盐和去污剂或碱裂解方案的裂解缓冲液在直接裂解酵母细胞中不是非常有效，但用额外步骤使用。这些额外的步骤可以分为两个主要组：物理方法和酶促方法。物理方法可以包括细胞的超声处理(专利号6,686,195)，有或没有存在研磨颗粒、用研磨颗粒的高功率搅拌(美国专利号5,464,773)(珠击、球磨机)，或使用高压力机械剪切(例如，french压力细胞压机，如本领域已知)。酶促方法依赖于特定酶，诸如消解酶(salazar and asenjo，同上；美国专利号5,688,644)，以削弱细胞壁，使得细胞可以通过更多常规技术来裂解。
6.从ffpe材料提取、富集和分离核酸是非常复杂的过程，其需要用有机溶剂将组织脱石蜡，用蛋白酶消化组织，然后从组织提取核酸。这些现有技术方法使用多种溶液和多个步骤。所用有机溶剂通常不与水溶液混溶。
7.因此，需要的是允许从细胞来源材料、特别是分枝杆菌、酵母和ffpe样品有效提取、富集、分离和纯化核酸的组合物和方法。


技术实现要素：

8.本发明通过提供用于从细胞来源材料(包括细菌、酵母和福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织)提取核酸的一步方法解决核酸提取的现有技术问题。在一个实施方案中，本发明包括能够在一个步骤中裂解细胞和纯化核酸的含水提取溶液。
9.本发明涉及允许从包括ffpe组织的样品直接提取核酸的核酸提取方法。该方法利用极性和非极性有机溶剂以及离液剂和去污剂的组合，以增溶石蜡、分解组织且释放核酸。核酸然后可以，例如，捕获在单一溶液中的含有二氧化硅的颗粒上。捕获颗粒，如果使用，可以是磁性的。该方法中没有分开的脱石蜡步骤或蛋白酶消化。所述有机溶剂是完全混溶的，且在该方法中没有相分离。提取方法使用胺单体诸如2,2'
·
(亚乙基二氧基)二(乙胺)组合含有离液剂诸如尿素或硫氰酸胍和去污剂的水溶液。提取方法还可以任选地含有其他有机溶剂，诸如二甲亚砜(dmso)、各种醇类和柠檬烯。该过程是极端简单的。样品(例如，ffpe组织样品)与含有胺单体(例如，2,2'
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亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)、1,3
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二氨基丙烷(dap)、2
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氨基
‑1‑
丁醇(ab)、2
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(2
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氨基乙氧基)乙醇(aee)、2
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氨基
‑6‑
甲基庚烷(amh)、2
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氨基
‑2‑
甲基
‑1‑
丙醇(amp)、氨基
‑2‑
丙醇(a2p)、1,5
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二氨基
‑2‑
甲基戊烷(dmp)和3
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氨基
‑1‑
丙醇(3a1p)中的一种或多种)的提取缓冲液混合。该混合物可以任选地升温或加热以帮助释放核酸。所述核酸可以捕获微粒上(或本领域普通技术人员已知的其他合适的固体基质)。例如，二氧化硅涂覆的磁性颗粒可以添加至混合物，且核酸捕获在颗粒上。本领域普通技术人员已知的捕获核酸的其他方法也适用于本发明。不需要添加额外的溶液，且不存在脱石蜡步骤或蛋白酶消化。洗涤(或另外处理)颗粒以去除任何杂质，且用水或稀缓冲溶液从二氧化硅颗粒释放核酸。
10.关于从其他细胞来源样品(诸如，但不限于，分枝杆菌和酵母)浓缩、提取、分离和纯化核酸，上文概述的方法和组合物也是合适的。
11.本发明的一个优点是，不像现有技术方法，从受试样品提取核酸不需要使用酶用于裂解细胞材料。
12.本发明考虑从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括：提供i)细胞来源材料和ii)包含一种或多种胺单体的含水提取溶液；使所述细胞来源材料与所述提取溶液接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明还考虑胺单体是伯胺单体。本发明进一步考虑，所述胺单体是2,2'
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亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)、1,3
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二氨基丙烷(dap)、2
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氨基
‑1‑
丁醇(ab)、2
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(2
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氨基乙氧基)乙醇(aee)、2
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氨基
‑6‑
甲基庚烷(amh)、2
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氨基
‑2‑
甲基
‑1‑
丙醇(amp)、氨基
‑2‑
丙醇(a2p)、1,5
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二氨基
‑2‑
甲基戊烷(dmp)和3
‑
氨基
‑1‑
丙醇(3a1p)中的一种或多种。进一步考虑，含水提取溶液可以包含离液剂，且所述离液剂选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇中的一种或多种。进一步考虑，所述含水提取溶液可以包含去污剂和醇中的一种或多种，且所述去污剂可以选自tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
‑
40和triton
tm x
‑
100中的一种或多种。此外，所述去污剂的最终浓度可以为约1％至15％、约8％至约15％或约10％。进一步考虑所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种，且所述醇的最终浓度为约10％至约40％或约20至约35％。
13.考虑所述含水提取溶液中的胺单体的浓度为约15％至约50％或约20％至约45％。进一步考虑所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约4m至约5m。
14.本发明考虑所述来源材料可以选自活细胞来源材料和固定细胞来源材料。此外，考虑所述活细胞来源材料可以包含细胞的悬浮液，并且在一些实施方案中，单一的悬浮液包含细菌。所述细菌可以包含分枝杆菌。在其他实施方案中，细胞的悬浮液可以包含酵母。
15.进一步考虑，本发明的含水提取溶液可以不含酶，且，进一步，可以不含蛋白酶。
16.进一步考虑，所述含水提取溶液优选具有约10至约13的ph和更优选约12至约13的ph。
17.进一步考虑，固定细胞来源材料可以包含福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)材料。
18.本发明考虑适于从细胞来源材料提取核酸的含水提取溶液，所述组合物包含一种或多种胺单体；一种或多种离液试剂，一种或多种去污剂和一种或多种有机溶剂。进一步考虑，所述胺单体是伯胺单体，且氨基单体可以选自2,2'
‑
亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)、1,3
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二氨基丙烷(dap)、2
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氨基
‑1‑
丁醇(ab)、2
‑
(2
‑
氨基乙氧基)乙醇(aee)、2
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氨基
‑6‑
甲基庚烷(amh)、2
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氨基
‑2‑
甲基
‑1‑
丙醇(amp)、氨基
‑2‑
丙醇(a2p)、1,5
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二氨基
‑2‑
甲基戊烷(dmp)和3
‑
氨基
‑1‑
丙醇(3a1p)中的一种或多种。进一步考虑所述含水提取溶液中的胺单体的浓度为约15％至约50％或约20％至约45％。进一步，可以考虑所述离液剂可以选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇中的一种或多种。进一步考虑所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约4m至约5m。进一步考虑，所述去污剂可以选自tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
‑
40和triton
tm x
‑
100中的一种或多种，且最终浓度可为约1％至15％，约8％至约15％或约10％。进一步考虑，所述醇可以选自乙醇和丁醇中的一种或多种，且所述醇的最终浓度可为约10％至约40％或约20至约35％。
19.本发明考虑从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括：提供i)细胞来源材料和ii)包含氢氧化铵的含水提取溶液；使所述细胞来源材料与所述提取溶液接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含一种或多种离液剂。本发明进一步考虑，离液剂可以选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂选自tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
‑
40和triton
tm x
‑
100中的一种或多种，且所述去污剂的浓度为约1％至15％，约8％至约15％或约10％。本发明进一步考虑，所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种，且所述醇的浓度为约10％至约40％或约20至约35％。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约4m至约5m。本发明进一步考虑，所述细胞来源材料选自活细胞来源材料和固定细胞来源材料。本发明进一步考虑，所述活细胞来源材料包含单细胞的悬浮液。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含细菌。本发明进一步考虑，所述细菌是分枝杆菌。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含酵母。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无酶的。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无蛋白酶的。本发明进一步考虑，固定细胞来源材料包含福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)材料。
20.本发明考虑从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括：提供i)细胞来源材料和ii)包含脲和硫氰酸胍(gitc)中的一种或多种的含水提取溶液；使所述细胞来源材料与所述提取溶液接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明进一步考虑，所述含水提
取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂选自tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
‑
40和triton
tm x
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100中的一种或多种，且所述去污剂的浓度为约1％至15％，约8％至约15％或约10％。本发明进一步考虑，所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种，且所述醇的浓度为约10％至约40％或约20至约35％。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的脲和硫氰酸胍(gitc)中的一种或多种的总浓度为约4m至约5m。本发明进一步考虑，所述细胞来源材料选自活细胞来源材料和固定细胞来源材料。本发明进一步考虑，所述活细胞来源材料包含单细胞的悬浮液。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含细菌。本发明进一步考虑，所述细菌是分枝杆菌。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含酵母。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无酶的。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无蛋白酶的。本发明进一步考虑，固定细胞来源材料包含福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)材料。本发明的含水提取溶液，本实施方案也可以包含15％至约50％或约20％至约45％的浓度的胺单体。
21.本发明考虑灭活和杀灭分枝杆菌的方法，所述方法包括：提供i) 包含分枝杆菌的细胞来源材料和ii)包含一种或多种胺单体的含水提取溶液；使所述细胞来源材料与所述提取溶液接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明进一步考虑，所述胺单体是伯胺单体。本发明进一步考虑，所述胺单体是2,2'
‑
(亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)。本发明进一步考虑，所述胺单体是1,3
‑
二氨基丙烷。本发明进一步考虑，所述胺单体是3
‑
氨基
‑1‑
丙醇。本发明进一步考虑，所述胺单体是2
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氨基
‑1‑
丁醇(ab)、2
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(2
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氨基乙氧基)乙醇(aee)、2
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氨基
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甲基庚烷(amh)、2
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氨基
‑2‑
甲基
‑1‑
丙醇(amp)、氨基
‑2‑
丙醇(a2p)或1,5
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二氨基
‑2‑
甲基戊烷(dmp)。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含离液剂。本发明进一步考虑，所述离液剂可以选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂选自tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
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40和triton
tm x
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100中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂的浓度可为约1％至15％、约8％至约15％或约10％。本发明进一步考虑，所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述醇的浓度为约10％至约40％或约20至约35％。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度为约15％至约50％或约20％至约45％。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约4m至约5m。本发明进一步考虑，包含分枝杆菌的来源材料包含单细胞的悬浮液。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无酶的。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无蛋白酶的。本发明进一步考虑，所述方法进一步从所述分枝杆菌提取核酸。
22.本发明还考虑，所述来源材料可以包含先前通过荧光原位杂交(fish)测定的样品。fish是本领域普通技术人员已知的。fish分析可用于，例如，预先筛选目标或作为伴侣测定。目标阳性的样品然后可以通过用本发明的组合物和程序提取核酸、随后例如pcr定量。
23.在一个实施方案中，本发明考虑从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括：提供i)细胞来源材料和ii)包含一种或多种胺单体的含水提取溶液；使所述细胞来源材料与所述提取溶液接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明进一步考虑，所述胺单体是伯胺单体。本发明进一步考虑，所述胺单体是2,2'
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(亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)。本
发明进一步考虑，所述胺单体选自1,3
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二氨基丙烷和3
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氨基
‑1‑
丙醇。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含离液剂。本发明进一步考虑，所述离液剂可以选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂选自tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
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40和triton
tm x
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100中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂为约8 % v/v至约15 % v/v。本发明进一步考虑，所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述醇的浓度为约15 % v/v至约25 % v/v。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度为约30 % v/v至约50 % v/v。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约4m至约5m。本发明进一步考虑，所述细胞来源材料选自活细胞来源材料和固定细胞来源材料。本发明进一步考虑，所述活细胞来源材料包含单细胞的悬浮液。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含细菌。本发明进一步考虑，所述细菌是分枝杆菌。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含酵母。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无酶的。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无蛋白酶的。本发明进一步考虑，固定细胞来源材料包含福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)材料。
24.本发明考虑包含适于从细胞来源材料提取核酸的含水提取溶液的组合物，所述组合物包含一种或多种胺单体；一种或多种离液试剂，一种或多种去污剂和一种或多种有机溶剂。本发明进一步考虑，所述胺单体是伯胺单体。本发明进一步考虑，所述胺单体是2,2'
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(亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)。本发明进一步考虑，所述胺单体选自1,3
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二氨基丙烷和3
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氨基
‑1‑
丙醇。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含离液剂。本发明进一步考虑，所述离液剂可以选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂选自tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
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40和triton
tm x
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100中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂为约8 % v/v至约15 % v/v。本发明进一步考虑，所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述醇的浓度为约15 % v/v至约25 % v/v。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度为约30 % v/v至约50 % v/v。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约4m至约5m。
25.本发明考虑从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括：提供i)细胞来源材料和ii)包含氢氧化铵的含水提取溶液；使所述细胞来源材料与所述提取溶液接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含离液剂。本发明进一步考虑，所述离液剂可以选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂选自tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
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40和triton
tm x
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100中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂为约8 % v/v至约15 % v/v。本发明进一步考虑，所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述醇的浓度为约15 % v/v至约25 % v/v。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约4m至约5m。本发明进一步考虑，所述细胞来源材料选自活细胞来源材料和固定细胞来源材料。本发明进一步考虑，所述活细胞来源材料包含单细胞的悬浮
液。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含细菌。本发明进一步考虑，所述细菌是分枝杆菌。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含酵母。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无酶的。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无蛋白酶的。本发明进一步考虑，固定细胞来源材料包含福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)材料。
26.本发明考虑从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括：提供i)细胞来源材料和ii)包含脲和硫氰酸胍(gitc)中的一种或多种的含水提取溶液；使所述细胞来源材料与所述提取溶液接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂选自tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
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40和triton
tm x
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100中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂为约8 % v/v至约15 % v/v。本发明进一步考虑，所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述醇的浓度为约15 % v/v至约25 % v/v。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的脲和硫氰酸胍(gitc)中的一种或多种的总浓度为约4m至约5m。本发明进一步考虑，所述细胞来源材料选自活细胞来源材料和固定细胞来源材料。本发明进一步考虑，所述活细胞来源材料包含单细胞的悬浮液。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含细菌。本发明进一步考虑，所述细菌是分枝杆菌。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含酵母。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无酶的。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无蛋白酶的。本发明进一步考虑，固定细胞来源材料包含福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)材料。
27.本发明考虑灭活和杀灭分枝杆菌的方法，所述方法包括：提供i) 包含分枝杆菌的细胞来源材料和ii)包含一种或多种胺单体的含水提取溶液；使所述细胞来源材料与所述提取溶液接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明进一步考虑，所述胺单体是伯胺单体。本发明进一步考虑，所述胺单体是2,2'
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(亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)。本发明进一步考虑，所述胺单体选自1,3
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二氨基丙烷和3
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氨基
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丙醇的一种或多种。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含离液剂。本发明进一步考虑，所述离液剂可以选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂选自tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
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40和triton
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100中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂为约8 % v/v至约15 % v/v。本发明进一步考虑，所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述醇的浓度为约15 % v/v至约25 % v/v。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度为约30 % v/v至约50 % v/v。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约4m至约5m。本发明进一步考虑，包含分枝杆菌的来源材料包含单细胞的悬浮液。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无酶的。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无蛋白酶的。本发明进一步考虑，所述方法进一步从所述分枝杆菌提取核酸。
28.本发明考虑从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括使细胞来源材料与能够在单一步骤中裂解细胞材料和提取核酸的含水提取溶液接触，其中所述含水提取溶液包含含氮溶剂。
29.本发明考虑从固定组织细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括使细胞来源材料与能够在单一步骤中裂解细胞材料和提取核酸的含水提取溶液接触，其中所述含水提
取溶液包含含氮溶剂。
30.本发明考虑从细菌细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括使细胞来源材料与能够在单一步骤中裂解细胞材料和提取核酸的含水提取溶液接触；其中所述含水提取溶液包含含氮溶剂。
31.本发明考虑从酵母细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括使细胞来源材料与能够在单一步骤中裂解细胞材料和提取核酸的含水提取溶液接触；其中所述含水提取溶液包含含氮溶剂。
附图说明
32.图1显示来自实施例1的测定的扩增曲线。显示了lb
‑
etoh与lb
‑
etoh
‑
edbe和ffpe提取的比较。
33.图2显示对图1的数据的单因素anova分析的结果。
34.图3显示来自实施例2的测定的扩增曲线。显示了含有1,3
‑
二氨基丙烷的lb
‑
etoh和ffpe提取的比较。
35.图4显示对图3的数据的单因素anova分析的结果。
36.图5显示来自实施例3的测定的扩增曲线。显示了lb
‑
etoh与lb
‑
etoh
‑
nh4oh和ffpe提取的比较。
37.图6显示对图5的数据的单因素anova分析的结果。
38.图7显示来自实施例4的提取酵母之后的dna浓度的结果。洗脱物中的dna浓度是ug/ml，显示4个样品的平均值。时间是指在80摄氏度的孵育时间。
39.图8显示实施例4的测定的扩增曲线。
40.图9显示对图8的数据的单因素anova分析的结果。
41.图10显示实施例5的测定的扩增曲线。
42.图11显示通过qiagen、promega和本发明的胺溶剂(3a1p)提取方案从结肠直肠癌(crc)样本的5微米ffpe卷样(未封固在载玻片上)提取dna。显示crc ffpe切片，braf
‑
e测定，3a1p方法，qiagen和csc方法，dcts。
43.图12显示对于图11测定的样品的
∆
ct (dct)。
44.图13显示通过qiagen、promega和本发明的胺溶剂(3a1p)提取方案从肺癌样本的5微米ffpe卷样(未封固在载玻片上)提取dna。显示肺ffpe切片，braf
‑
e测定，3a1p方法，qiagen和csc方法，fam和cy5 dcts。
45.图14显示对于图13测定的样品的
∆
ct (dct)。
46.图15显示通过qiagen、promega和本发明的胺溶剂(3a1p)提取方案从黑色素瘤样本的5微米ffpe卷样(未封固在载玻片上)提取dna。显示黑素瘤ffpe切片，3a1p方法，qiagen和csc方法，fam和cy5 dcts。
47.图16显示对于图15测定的样品的
∆
ct (dct)。
48.图17显示在载片封固的ffpe样品上使用的胺溶剂提取方案。所述样本是乙型肝炎病毒内部对照(hbv
‑
ic；abbott laboratories, abbott park, il)。选择这些载片，因为dna的量是已知变量。在用csc分离或与载玻片在lb
‑
3a1p中孵育的lb
‑
etoh
‑
3a1p中提取hbv ic载片，然后在提取后添加dna分离etoh。该图显示载玻片结合显著量的dna。
49.图18显示在提取程序过程中添加磁性微粒(mmp)导致等效于无载玻片的回收率的回收率。
50.图19显示乳腺肿瘤ffpe载玻片上的等效实验。
51.图20显示提取1至4个载片，表明将载片添加至提取程序可以增加回收率。上图显示乳腺组织ffpe载片，下图显示pathvysion
‑
a probe chek nomal载片。
52.图21显示图20中的数据的单因素anova分析。
53.图22(a和b)显示白色念珠菌和金黄色葡萄球菌分别通过溶剂的数据的单因素分析的结果。
具体实施方式
54.在一个实施方案中，本发明包括能够在一个步骤中裂解细胞和纯化核酸的含水提取溶液。在这方面，本发明提供了适于使用含水或水基提取溶液(提取组合物)从细胞来源材料提取核酸的方法和组合物，所述提取溶液包含一种或多种具有至少一个含氮基团的化合物。在一个优选的实施方案中，所述化合物是胺单体。含水和水基被定义为具有水作为溶剂。然而，这不排除包括非含水组分，条件是它们是与水混溶的。
55.术语“细胞来源材料”在本文中被定义为意指包含细胞，或在一些情况下，细胞物质(即，先前裂解的细胞成分)的任何生物材料。细胞来源材料可以是新鲜的(即，不固定的)或可以通过本领域普通技术人员已知的方法固定。福尔马林固定(和使用其他醛的程序)是常见的固定程序，尽管存在其他方法，并且是本领域普通技术人员已知的。细胞来源材料还可以由一种或多种组织构成。
[0056]“核酸的提取”应当意指，在本文中，在核酸可以从裂解物移取用于进一步处理(如果需要的话)的程度上从细胞来源材料以足够量从其他细胞成分释放核酸。换言之，富集核酸。
[0057]
关于本发明的核酸的“富集(enriched)”或“富集(enrichment)”应当意指，核酸相对于细胞来源材料的其他组分的浓度比细胞材料经受本发明的方法和组合物之前更高。换言之，核酸是“部分纯化的”或“部分分离的”。
[0058]
关于本发明的核酸的“纯化(purification)”或“纯化(to purify)”应当意指从样品去除细胞来源材料的组分(continuants)。如本文所使用，术语“纯化”是指从它们的天然环境移取、分离或分开的核酸序列。关于本发明的核酸的“分离”和“纯化”应当意指，核酸多于10 %不含、多于20 %不含、多于30 %不含、多于40 %不含、多于50 %不含、多于60 %不含、多于70 %不含、多于80 %不含、多于90 %不含、多于95 %不含且多于99 %不含它们天然相关的其他细胞组分。
[0059]
如本文所使用的“单一步骤”，意指在一个步骤中从细胞来源材料提取核酸、由此使dna从材料释放且富集或纯化的方法。
[0060]
在本发明的涉及固定组织的一个实施方案中，本文所述的单一步骤方法，无需对材料单独脱石蜡或酶促消化材料以释放dna。在某些实施方案中，将dna捕获在固体支持物(例如，含有二氧化硅的表面)上，而无需对材料脱石蜡或酶促消化材料以释放dna。在本发明的涉及固定组织的实施方案中，本文所述的单一步骤方法，无需其他裂解方法或酶促消化材料。在某些实施方案中，将dna捕获在固体支持物(例如，含有二氧化硅的表面)上，而无
需裂解样品以便从细胞来源材料释放dna。在某些实施方案中，将酵母dna捕获在固体支持物(例如，含有二氧化硅的表面)上，而无需裂解样品以便从细胞来源材料释放dna。在本发明的涉及细菌细胞来源材料的实施方案中，本文所述的单一步骤方法无需其他裂解方法或酶促消化材料。在某些实施方案中，dna从所述材料释放且富集或纯化，而无需灭活细菌。在某些其他实施方案中，将dna捕获在固体支持物(例如，含有二氧化硅的表面)上，而无需裂解样品或酶促消化材料以便从细胞来源材料释放dna。
[0061]
本发明不限于用于细胞来源材料的任何特定来源源。细胞来源材料可以获得自任何类型的含有核酸的细胞或组织。这包括病毒和含有病毒的细胞，细菌(例如，分枝杆菌属中的一种或多种，例如，结核分枝杆菌)和含有细菌的细胞，其他所有原核细胞，酵母(例如，酵母属细胞或念珠菌属中的一种或多种，例如，白色念珠菌)，所有其他真菌，植物(即植物)和动物细胞等。细胞来源材料可以最近获得且是活的或可以不是活的。同样，细胞来源材料可以是经由本领域普通技术人员已知的保存和固定化合物和技术(其简述可见下文)来保存。福尔马林固定、石蜡包埋(ffpe)组织特别适用于本发明。本发明的方法和组合物裂解分枝杆菌和其他致病生物体，由此杀灭它们，且减轻或消除来自样品的污染的危险。
[0062]
本发明不需要任何预处理或预操作新鲜(即非固定)细胞来源材料。进一步，如果使用预处理或预操作程序，则本发明不限于任何特定预处理或预提取操作程序。然而，在一些情况下，预处理或预提取细胞来源材料可以是有利的。例如，可期望通过离心浓缩悬浮细胞。此外，大组织(新鲜、固定固定且包埋)，如果处理(例如，切割或研磨)成较小切片，则更容易处理。适合于预处理样品的方法是本领域已知的，且包括，但不限于，在有或没有存在研磨颗粒的情况下细胞的超声处理(专利号6,686,195)，混合(例如，涡旋)，用研磨颗粒的高功率搅拌(美国专利号5,464,773)(珠击、球磨机)，或使用高压力机械剪切(例如，french压力细胞压机，如本领域已知)。进一步，酶促方法使用特定酶，诸如消解酶(salazar and asenjo，同上；美国专利号5,688,644)，以削弱细胞壁。又进一步，如果靶向特定细胞类型，则可以优选从较大群体分离该特定细胞类型。然而，这些程序被表明易于操作和方便性，且不是因为本发明需要预处理或预操作。
[0063]
在本发明的一个实施方案中，本发明使用包含一种或多种胺单体的提取溶液(组合物)。尽管本发明不限于任何具体理论，在本发明的上下文中，据信具有一种或多种胺单体的试剂作为溶剂发挥功能。包含一种或多种胺单体的试剂的实例是，例如，包括2,2'
‑
亚乙基二氧基)二(乙胺):c6h
16
n2o2) (edbe)。edbe是伯胺单体。进一步，本发明不限于任何特定胺单体或伯胺单体。例如，伯胺单体二氨基丙烷(例如，1,2
‑
二氨基丙烷和1,3
‑
二氨基丙烷)也可用于本发明中，如下面所例举。进一步，3
‑
氨基
‑1‑
丙醇(3a1p)可用于本发明中，如下面所例举，且表现出比上面命名的其他两种胺单体更低的毒性。本发明的提取溶液中的胺单体的最终浓度是约15％至约50％或约20％至约45％或约40％。初步结果表明，氢氧化铵(nh4oh)作为胺单体的替代物是有效的，尽管具有降低的有效性。
[0064]
关于本发明，“伯胺”被定义为其中氨分子中仅一个氢原子已经被替代的胺。这意味着，伯胺的式将是rnh2。仲胺被定义为其中氨分子中两个氢原子已经被替代的胺。这意味着，伯胺的式将是rnhr。“叔胺”被定义为其中氨分子中三个氢原子已经被替代的胺。“胺单体”是具有一个或多个胺基团的化合物。
[0065]
在其他实施方案中，考虑试剂的组合可用于本发明的具有合适结果的含水提取溶
液中。例如，上面讨论的胺单体(2,2'
‑
亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)、1,3
‑
二氨基丙烷(dap)、2
‑
氨基
‑1‑
丁醇(ab)、2
‑
(2
‑
氨基乙氧基)乙醇(aee)、2
‑
氨基
‑6‑
甲基庚烷(amh)、2
‑
氨基
‑2‑
甲基
‑1‑
丙醇(amp)、氨基
‑2‑
丙醇(a2p)、1,5
‑
二氨基
‑2‑
甲基戊烷(dmp)和3
‑
氨基
‑1‑
丙醇(3a1p)中的一种或多种)可以与脲和/或gitc和/或nh4oh使用。本领域普通技术人员能够仅用常规实验确定可接受的浓度和条件。
[0066]
在另一个实施方案中，考虑本发明的含水提取溶液可以包含尿素和/或gitc，而不添加胺单体。再次，本领域普通技术人员将能够仅用常规实验确定可接受的浓度和条件。
[0067]
本发明的提取溶液(组合物)也可以任选地包含其他有机溶剂诸如，例如，二甲亚砜(dmso)、醇类和柠檬烯。本发明的提取组合物中的有机溶剂的最终浓度，如果存在，为约10％至30％，约15％至约25％或约20％。
[0068]
本发明的提取溶液(组合物)也可以包含离液剂，诸如，例如，尿素、硫氰酸胍(gitc)、乙醇或丁醇。其他是本领域技术人员已知的。离液剂是破坏大分子诸如蛋白的结构和变性大分子诸如蛋白的物质。离液剂通过干扰非共价力诸如氢键介导的分子间相互作用而发挥作用。本发明的提取组合物中的离液剂的最终浓度为约3.0 m至约6.0 m、约4.0 m至约5.0 m或约4.7 m。
[0069]
进一步，本发明的提取溶液(组合物)包含一种或多种去污剂。去污剂的特征在于亲水性头部和疏水性尾部。去污剂通常用于细胞和组织工作中。非离子去污剂是优选的。适用于本发明中的去污剂包括，但不限于，tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
‑
40和triton
tm x
‑
100 (sigma
‑
aldrich, st. louis, mo)。本发明的提取组合物中的去污剂的最终浓度是约1％至15％、约8％至约15％或约10％。尽管本发明不受理论限制，通常认为，中等浓度的轻度(即非离子)去污剂损害细胞膜的完整性，由此促进细胞的裂解和可溶性组分的提取。
[0070]
本发明的裂解溶液的ph为高于约7。本发明的裂解溶液的ph可以为高达约ph 10
ꢀ–ꢀ
13或12
ꢀ–ꢀ
13。可以通过选择本发明的提取组合物的组分或通过使用缓冲剂来调节和维持ph。使用缓冲剂是本领域普通技术人员众所周知的。示例性缓冲剂是tris
‑
hcl。
[0071]
进一步，不像现有技术方法，可以进行本方法，而不使用酶(例如，蛋白酶)，用于降解，例如，组织，尽管酶的使用不是禁忌的。
[0072]
该混合物可以任选地升温或加热以帮助释放核酸。使用的温度的范围可以是约70℃至约90℃和约80℃至约90℃和约85℃的温度。
[0073]
本发明适用于固定的细胞和组织。固定剂和固定程序的非限制性实例包括，例如，交联固定剂(例如，醛类，诸如戊二醛、甲醛(福尔马林)，等)。交联固定剂通过在组织中的蛋白之间生成共价化学键而发挥作用。这些交联固定剂，尤其是甲醛，趋于保持蛋白的二级结构，并且同样可以保护重要的三级结构。沉淀(或变性)固定剂诸如甲醇、乙醇、乙酸和丙酮也是已知的。
[0074]
氧化固定剂可以与蛋白和其他生物分子的各种侧链反应，允许形成稳定组织结构的交联。四氧化锇、重铬酸钾、铬酸和高锰酸钾所有都可用于某些特定组织学制备物中。
[0075]
hepes
‑
谷氨酸缓冲剂介导的有机溶剂保护作用(hope)给出福尔马林样形态，优异保持蛋白抗原的免疫组织化学和酶组织化学，良好的rna和dna产量且缺乏蛋白交联。
[0076]
通常包埋固定细胞来源材料样品，诸如组织和细胞样品以保持所有结构且为进一
步处理提供支持。传统上，此类样品已经包埋于石蜡中。固定细胞来源材料样品通常固定于，例如，福尔马林中，然后石蜡包埋，生成福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)的样品。用于固定细胞和组织和包埋细胞和组织的程序是本领域普通技术人员已知的(例如，参见leeson和leeson, histology, 1981, w. b. saunders co., pages 6
ꢀ–ꢀ
8 and on the world wide web at en.wikipedia.org/wiki/histology#embedding)。在现有技术中，已经仅通过使用困难、多步、耗时的程序完成从ffpe细胞来源材料提取核酸。本发明的组合物和程序涉及简化、有效的程序。
[0077]
本发明涉及新的且非显而易见的方法，其无需组织的脱石蜡和蛋白酶消化步骤，用于核酸的提取、浓缩、分离和/或纯化。单一水基溶液用于提取核酸且使核酸结合至固体基质(如果期望结合)。溶液中含有的有机溶剂是完全混溶的，而无需相分离有机溶剂。通过本领域普通技术人员已知的任何其他方法，ffpe组织与溶液混合，破坏组织，释放核酸，且将核酸捕获于，例如，固体基质诸如含有二氧化硅的固体基质上或者从溶液去除。所述基质可以是颗粒，且可以是磁性颗粒。核酸捕获于固体基质上之后，所述方法使用简单的洗涤步骤，且从基质洗脱核酸，用于最终纯化或使用。如果需要，可以通过本领域普通技术人员已知的方法，进一步纯化提取的核酸。
[0078]
可以通过本领域普通技术人员已知的任何程序使用提取的核酸。此类使用的实例包括杂交测定(northern印迹、southern印迹，等)、扩增测定(参见，例如，美国专利申请号4,683,195)、测序、复制、并入表达载体或任何有用组合。进一步，本发明的组合物和方法适合于先前用于fish(荧光原位杂交)分析或其中不破坏核酸的其他方案的样品。
[0079]
本说明书中提到的所有引文(专利、专利申请出版物、期刊文章、教科书和其它出版物)表明本公开涉及的本领域技术人员的技术水平。所有此类出版物通过引用并入本文，其程度等同于每个单独出版物被具体且单独地通过引用并入。
[0080]
本文说明性描述的本发明可以在本文未具体公开的任何要素或限制不存在的情况下合适地实施。因此，例如，本文中的术语“包含”、“基本上由...组成”和“由......组成”中任一个的每种情况可以用其他两个术语中的任一个替代。同样地，单数形式“一个/种(a)”，“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“方法”包括本文描述和/或在阅读本公开内容之后对于本领域技术人员变得显而易见的该类型的一种或多种方法和/或步骤。
[0081]
在单一步骤中从细胞来源材料提取核酸的实施方案在一个实施方案中，本发明涉及从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括使细胞来源材料与能够在单一步骤中裂解细胞材料和提取核酸的含水提取溶液接触。在一个实施方案中，所述含水提取溶液包含选自一种或多种胺单体和一种或多种酰胺的含氮溶剂。在一个实施方案中，所述含水提取溶液包含胺单体和酰胺。在另一个实施方案中，所述含水提取溶液包含伯胺单体。在一个实施方案中，所述胺单体是2,2'
‑
(亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)。在一个实施方案中，所述胺单体是1,3
‑
二氨基丙烷。在一个实施方案中，所述胺单体是3
‑
氨基
‑1‑
丙醇。在一个实施方案中，同时使用两种或更多种胺单体。在一个实施方案中，所述胺单体选自2,2'
‑
亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)、1,3
‑
二氨基丙烷(dap)、2
‑
氨基
‑1‑
丁醇(ab)、2
‑
(2
‑
氨基乙氧基)乙醇(aee)、2
‑
氨基
‑6‑
甲基庚烷(amh)、2
‑
氨基
‑2‑
甲基
‑1‑
丙醇(amp)、氨基
‑2‑
丙醇(a2p)、1,5
‑
二氨基
‑2‑
甲基戊烷(dmp)和3
‑
氨基
‑1‑
丙醇
(3a1p)中的一种或多种。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约15％至约50％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约20％至约45％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约45％至约50％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包括离液剂。在一个实施方案中，所述离液剂选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的离液剂为约4m至约5m。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的离液剂为约4.5m至约5m。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。合适的去污剂包括tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
‑
40和triton
tm x
‑
100。合适的醇包括乙醇、丁醇。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约1％至约15％或约8％至约15％。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约10％至约15％。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约12％至约15％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约15％至约25％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约10％至约40％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约20％至约35％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约20％至约25％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约23％至约25％。在另一个实施方案中，所述细胞来源材料选自组织、动物组织、哺乳动物组织、人组织、人肿瘤组织、含有病毒的人组织、固定人组织、动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、含有病毒、细菌、分枝杆菌、真菌、酵母的人细胞和植物组织或植物细胞、含有细胞的血液、含有细胞的痰液。
[0082]
在单一步骤中从固定组织细菌来源材料提取核酸的实施方案在一个实施方案中，本发明涉及从固定组织细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括使细胞来源材料与能够在单一步骤中裂解细胞材料和提取核酸的提取水溶液接触。在一个实施方案中，固定细胞来源材料是福尔马林固定石蜡包埋材料。在一个实施方案中，所述含水提取溶液包含选自一种或多种胺单体和一种或多种酰胺的含氮溶剂。在一个实施方案中，所述含水提取溶液包含胺单体和酰胺。在另一个实施方案中，所述含水提取溶液包含伯胺单体。在一个实施方案中，所述胺单体是2,2'
‑
(亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)。在一个实施方案中，所述胺单体是1,3
‑
二氨基丙烷。在一个实施方案中，所述胺单体是3
‑
氨基
‑1‑
丙醇。在一个实施方案中，同时使用两种或更多种胺单体。在一个实施方案中，所述胺单体选自2,2'
‑
亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)、1,3
‑
二氨基丙烷(dap)、2
‑
氨基
‑1‑
丁醇(ab)、2
‑
(2
‑
氨基乙氧基)乙醇(aee)、2
‑
氨基
‑6‑
甲基庚烷(amh)、2
‑
氨基
‑2‑
甲基
‑1‑
丙醇(amp)、氨基
‑2‑
丙醇(a2p)、1,5
‑
二氨基
‑2‑
甲基戊烷(dmp)和3
‑
氨基
‑1‑
丙醇(3a1p)中的一种或多种。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约15％至约50％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约20％至约45％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约45％至约50％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包括离液剂。在一个实施方案中，所述离液剂选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的离液剂为约4m至约5m。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的离液剂为约4.5m至约5m。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。合适的去污剂包括tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
‑
40和triton
tm x
‑
100。合适的醇包括乙醇、丁醇。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约1％至约15％或约8％至约15％。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约10％至约15％。在一个实施方案中，所述
去污剂的浓度为约10％至约40％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约20％至约35％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约20％至约25％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约23％至约25％。
[0083]
在单一步骤中从细菌细胞来源材料提取核酸的实施方案在一个实施方案中，本发明涉及从细菌细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括使细胞来源材料与能够在单一步骤中裂解细胞材料和提取核酸的提取水溶液接触。在一个实施方案中，所述细菌细胞来源材料是分枝杆菌细胞。在另一个实施方案中，所述细菌细胞来源材料是结核分枝杆菌。在另一个实施方案中，所述细菌存在于人痰液中。在另一个实施方案中，在单一步骤中灭活所述细菌。在一个实施方案中，所述含水提取溶液包含选自一种或多种胺单体和一种或多种酰胺的含氮溶剂。在一个实施方案中，所述含水提取溶液包含胺单体和酰胺。在另一个实施方案中，所述含水提取溶液包含伯胺单体。在一个实施方案中，所述胺单体是2,2'
‑
(亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)。在一个实施方案中，所述胺单体是1,3
‑
二氨基丙烷。在一个实施方案中，所述胺单体是3
‑
氨基
‑1‑
丙醇。在一个实施方案中，同时使用两种或更多种胺单体。在一个实施方案中，所述胺单体选自2,2'
‑
亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)、1,3
‑
二氨基丙烷(dap)、2
‑
氨基
‑1‑
丁醇(ab)、2
‑
(2
‑
氨基乙氧基)乙醇(aee)、2
‑
氨基
‑6‑
甲基庚烷(amh)、2
‑
氨基
‑2‑
甲基
‑1‑
丙醇(amp)、氨基
‑2‑
丙醇(a2p)、1,5
‑
二氨基
‑2‑
甲基戊烷(dmp)和3
‑
氨基
‑1‑
丙醇(3a1p)中的一种或多种。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约15％至约50％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约20％至约45％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约45％至约50％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包括离液剂。在一个实施方案中，所述离液剂选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的离液剂为约4m至约5m。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的离液剂为约4.5m至约5m。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。合适的去污剂包括tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
‑
40和triton
tm x
‑
100。合适的醇包括乙醇、丁醇。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约1％至约15％或约8％至约15％。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约10％至约15％。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约10％至约40％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约20％至约35％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约20％至约25％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约23％至约25％。
[0084]
在单一步骤中从酵母细胞来源材料提取核酸的实施方案在一个实施方案中，本发明涉及从酵母细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括使细胞来源材料与能够在单一步骤中裂解细胞材料和提取核酸的提取水溶液接触。在一个实施方案中，所述含水提取溶液包含选自一种或多种胺单体和一种或多种酰胺的含氮溶剂。在一个实施方案中，所述含水提取溶液包含胺单体和酰胺。在另一个实施方案中，所述含水提取溶液包含伯胺单体。在一个实施方案中，所述胺单体是2,2'
‑
(亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)。在一个实施方案中，所述胺单体是1,3
‑
二氨基丙烷。在一个实施方案中，所述胺单体是3
‑
氨基
‑1‑
丙醇。在一个实施方案中，同时使用两种或更多种胺单体。在一个实施方案中，所述胺单体选自2,2'
‑
亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)、1,3
‑
二氨基丙烷(dap)、2
‑
氨基
‑1‑
丁醇(ab)、2
‑
(2
‑
氨基乙氧基)乙醇(aee)、2
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氨基
‑6‑
甲基庚烷(amh)、2
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氨基
‑2‑
甲基
‑1‑
丙醇(amp)、氨基
‑2‑
丙醇(a2p)、1,5
‑
二氨基
‑2‑
甲基戊烷(dmp)和3
‑
氨基
‑1‑
丙醇(3a1p)中的一种或多种。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约15％至约50％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约20％至约45％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约45％至约50％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包括离液剂。在一个实施方案中，所述离液剂选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的离液剂为约4m至约5m。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的离液剂为约4.5m至约5m。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。合适的去污剂包括tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
‑
40和triton
tm x
‑
100。合适的醇包括乙醇、丁醇。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约1％至约15％或约8％至约15％。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约10％至约15％。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约10％至约40％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约20％至约35％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约20％至约25％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约23％至约25％。
[0085]
在单一步骤中从fish
‑
测定的细胞来源材料提取核酸的实施方案在一个实施方案中，本发明涉及从fish
‑
测定的细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括使细胞来源材料与能够在单一步骤中裂解细胞材料和提取核酸的提取水溶液接触。在一个实施方案中，所述含水提取溶液包含选自一种或多种胺单体和一种或多种酰胺的含氮溶剂。在一个实施方案中，所述含水提取溶液包含胺单体和酰胺。在另一个实施方案中，所述含水提取溶液包含伯胺单体。在一个实施方案中，所述胺单体是2,2'
‑
(亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)。在一个实施方案中，所述胺单体是1,3
‑
二氨基丙烷。在一个实施方案中，所述胺单体是3
‑
氨基
‑1‑
丙醇。在一个实施方案中，所述胺单体选自2,2'
‑
亚乙基二氧基)二(乙胺)(edbe)、1,3
‑
二氨基丙烷(dap)、2
‑
氨基
‑1‑
丁醇(ab)、2
‑
(2
‑
氨基乙氧基)乙醇(aee)、2
‑
氨基
‑6‑
甲基庚烷(amh)、2
‑
氨基
‑2‑
甲基
‑1‑
丙醇(amp)、氨基
‑2‑
丙醇(a2p)、1,5
‑
二氨基
‑2‑
甲基戊烷(dmp)和3
‑
氨基
‑1‑
丙醇(3a1p)中的一种或多种。在一个实施方案中，同时使用两种或更多种胺单体。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约15％至约50％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约20％至约45％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约45％至约50％。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包括离液剂。在一个实施方案中，所述离液剂选自脲、硫氰酸胍(gitc)、乙醇和丁醇。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的离液剂为约4m至约5m。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的离液剂为约4.5m至约5m。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。合适的去污剂包括tween
tm
、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠(sds)、np
‑
40和triton
tm x
‑
100。合适的醇包括乙醇、丁醇。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约1％至约15％或约8％至约15％。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约10％至约15％。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约10％至约40％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约20％至约35％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约20％至约25％。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约23％至约25％。
[0086]
已经采用的术语和表述用作描述而非限制的术语。在这方面，当本文定义、描述或
讨论某些术语时，所有此类定义、描述和讨论意欲归因于此类术语。此外，使用此类术语和表述不意欲排除显示和描述的特征的任何等效方案或其部分。
[0087]
应当认识到，各种改变在所要求保护的发明的范围之内是可能的。因此，应当理解的是，尽管在优选实施方案和任选特征的上下文中已经具体公开了本发明，但本领域技术人员可以付诸本文公开的概念的改变和变化。此类改变和变化被认为在如随附权利要求定义的发明的范围之内。
实施例
[0088]
实施例1本发明的概念是，可以使用单一步骤裂解缓冲液从例如甲醛固定的石蜡包埋(ffpe)组织容易地富集、纯化或分离核酸，其将允许dna从样品释放且捕获在固体支持物上(例如，含有二氧化硅的表面)，或以其他方式富集或分离，而不需要将样品脱石蜡，也不需要酶促消化样品以便从细胞来源材料(例如，固定组织)释放dna。本领域普通技术人员将理解，本发明的程序也适用于从没有ffpe的样品(诸如，但不限于，细菌、酵母、组织等)提取、纯化、分离和富集核酸。
[0089]
提取中使用的基本裂解缓冲液(lb)含有4.7 m硫氰酸胍(gitc)、10 % tween
‑
20和100 mm tris缓冲液, ph 7.8。使用70 ml裂解缓冲液且添加35 ml 95％乙醇制备裂解
‑
乙醇(lb
‑
etoh)溶液。通过将9 ml lb
‑
etoh溶液与6 ml于lb
‑
etoh中的40% edbe溶液的edbe混合(lb
‑
etoh
‑
edbe)制备含有2,2
’‑
(亚乙基二氧基)双(乙胺)(edbe, cas号929
‑
59
‑
9)的ffpe提取溶液。用于所有样品的洗涤1溶液是lb
‑
etoh溶液。用于所有样品的洗涤2溶液是70％乙醇和水。洗脱溶液是水。方案中使用的二氧化硅涂覆的磁性微粒(mmp)是abbott laboratories mmicroparticlesdna编码项md205a，尽管等效颗粒是市售的(例如，promega corp., madison, wi; life technologies, grand isle, ny; bangs laboratories, fishers, in)。
[0090]
使用promega maxwell提取器进行样品提取。该方法在含有提取方案中使用的各种溶液的药筒中的各腔室之间转移磁性颗粒。提取方案涉及磁性颗粒从一个腔室转移至另一个腔室。通过将磁性颗粒捕获在腔室中已经插入磁性棒的柱塞的表面上进行转移。然后将柱塞转移至不同腔室，且通过将磁性棒移出柱塞而从柱塞的表面释放颗粒。无磁性棒的柱塞可用于通过在流体中上下运动而混合腔室中的流体。在用于ffpe提取的方案中，在室温进行裂解物和颗粒孵育和洗涤。在加热至70℃的单独洗脱管中进行洗脱步骤。提取药筒具有七个腔室。第一腔室用于ffpe裂解物溶液，且其他腔室用于盛装容纳磁性颗粒或洗涤溶液。腔室2含有200微升(μl)lb
‑
etoh和25微升mmp。腔室3含有800微升洗涤剂1。腔室4、5和6含有900微升洗涤剂2。腔室7是空的。洗脱管含有100微升水。方案首先将mmp从腔室2转移至含有ffpe裂解物溶液的腔室1。ffpe裂解物溶液与磁性颗粒混合十分钟。将所有洗涤步骤混合一分钟。洗脱步骤在混合的情况下孵育十分钟。
[0091]
样品材料由ffpe甲状腺组织块组成，所述ffpe甲状腺组织块被切片成5微米切片，其中单一含石蜡切片置于2ml扣盖聚丙烯离心管。将切片相继在管中编号。
[0092]
以下面方式提取十个连续切片。向每个切片添加1.5 ml lb
‑
etoh或1.5 ml lb
‑
etoh
‑
edbe，使得每隔一个切片含有相同的裂解缓冲液。奇数样品含有lb
‑
etoh且偶数样品
含有lb
‑
etoh
‑
edbe。以这种方式，尽可能减小石蜡切片中的任何差异。然后所有样品在固定温度控制的加热块中在78℃孵育四小时，而不混合。完成加热步骤之后，将裂解物直接添加至promega maxwell提取药筒的腔室1，且如上所述提取。
[0093]
使用针对人基因组dna的pcr测定分析来自提取的洗脱物。pcr是本领域普通技术人员众所周知的。该测定检测braf基因的外显子13的存在。该基因编码参与引导细胞生长的被称为b
‑
raf的蛋白。pcr测定用于测量从样品分离的dna的相对量。在测定中，由荧光探针生成的信号随着pcr扩增中的每个加热
‑
冷却循环增加。原始样品中的dna越多，越早检测到信号。检测到信号的循环被称为循环阈值(ct)。基因组dna的量是另一个样品的两倍的样品将具有比其他样品低1 ct的ct值。dna的量是另一个样品的四倍的样品将具有比其他样品低2 ct的ct值。使用该方法测定提取物的ct值。对于每个样品进行两次重复测定。来自测定的扩增曲线显示于图1。图1显示用lb
‑
etoh裂解缓冲液和lb
‑
etoh
‑
edbe裂解缓冲液提取的样品之间的明显差异。循环阈值的计算显示，两种裂解缓冲液之间存在超过2 ct差异，这被转化为用含有edbe的裂解缓冲液提取的dna的量增加超过四倍。图2显示对图1中呈现的数据的单因素平均值anova检验。
[0094]
图2的单因素anova的平均值。
[0095]
实施例2使用第二溶剂1,3
‑
二氨基丙烷进一步探索本发明的概念。如上所述进行提取，尽管用每种裂解缓冲液仅进行两个重复样品。第一裂解缓冲液是lb
‑
etoh缓冲液，且第二裂解缓冲液是含有20％1,3
‑
二氨基丙烷(dp, cas号109
‑
76
‑
2)的lb
‑
etoh。ffpe切片来自如上使用的相同组织样品。孵育、提取和测定条件与上述相同。来自测定的扩增曲线下面显示于图3。图3显示用lb
‑
etoh裂解缓冲液和lb
‑
etoh
‑
二氨基丙烷裂解缓冲液提取的样品之间的明显差异。循环阈值的计算显示，两种裂解缓冲液之间存在超过2 ct差异，这被转化为用含有1,3
‑
二氨基丙烷的裂解缓冲液提取的dna的量增加超过四倍。图4显示对图3中呈现的数据的单因素平均值anova检验。
[0096]
图4的单因素anova的平均值。
[0097]
实施例3使用氢氧化铵添加至裂解缓冲液铵进一步探索本发明，以确定上述使用的溶剂上存在的氨基是否影响从ffpe样品提取dna。提取如上所述进行，但测试的第二裂解缓冲液含有约0.6％氢氧化铵(nh4oh)。这通过将200微升浓氢氧化铵(28％至30％)添加至10 ml lb
‑
etoh来进行。用每种提取缓冲液使用含有上述相同的样品材料的五个重复样品。如上所述用braf测定一式两份测定洗脱物。来自测定的扩增曲线下面显示于图5。图5显示用lb
‑
etoh裂解缓冲液和lb
‑
etoh
‑
nh4oh裂解缓冲液提取的样品之间的差异。循环阈值的计算显示，两种裂解缓冲液之间存在超过1.4 ct差异，这被转化为用含有nh4oh的裂解缓冲液提取的dna的量增加超过两倍。图6显示对图5中呈现的数据的单因素平均值anova检验。尽管用含有
nh4oh的裂解缓冲液提取的dna的增加似乎没有与用其他两种溶剂提取的dna的增加那样大，但其确实显示铵离子或胺基团的存在在从ffpe样品提取dna中是重要的。
[0098]
图5的单因素anova的平均值。
[0099]
实施例4实施例 从全血提取白色念珠菌。
[0100]
针对从来自全血的酵母提取核酸进一步探索本发明。将该方法与使用珠击以裂解酵母的用于来自全血的酵母的标准提取方法进行比较。
[0101]
使用的样品是200个菌落形成单位/每毫升人全血的白色念珠菌。提取中使用的裂解缓冲液和其他试剂描述于实施例1中。lb
‑
etoh
‑
edbe溶液含有20％ edbe，且通过将15 ml edbe与60 ml lb
‑
etoh混合来制备。
[0102]
通过将1.25 ml样品添加至3.75 lb
‑
etoh
‑
edbe且在80℃孵育45、60、75和90分钟来进行edbe提取。给予提取交错的开始，使得所有孵育同时完成。每种条件处理四个样品。还将四个样品与lb
‑
etoh (无添加的edbe)孵育90分钟。
[0103]
使用abbott plexidbb组以6200速度三次珠击90秒循环进行样品的珠击。每个样品含有1.25 ml样品、150微升裂解缓冲液(无乙醇)和约950毫克氧化锆/钇beads glenn mills (clifton, nj) #7361
‑
00010。珠击之后，将试管在beckman 22r离心机中以14,000 rpm离心3分钟。然后提取上清液的总体积连同edbe处理的裂解物。
[0104]
提取使用plexidsp提取器用以下方案进行，所述方案具有裂解物与二氧化硅涂覆的磁性颗粒的室温孵育。提取器使用24孔板，其中每块板含有单独的提取试剂。所述试剂描述于实施例1。结合步骤用孔中的125微升磁性颗粒在室温下持续15分钟。含有珠击裂解物的孔含有125微升磁性颗粒加上1.5 ml lb
‑
etoh，而edbe裂解物仅具有磁性颗粒，而没有额外试剂。该方案使用具有2 ml lb
‑
etoh的单一洗涤1板和具有2 ml 70％乙醇的三块洗涤2板。洗脱板含有300微升用于洗脱的水。洗脱步骤在70℃持续10分钟。
[0105]
使用nanodrop lite (thermo scientific, wilmington, de)测量样品的dna含量。参见，图7 a。在edbe处理的样品中可存在比珠击更少的核酸。无edbe或珠击的样品给出较低得率。珠击方案从溶液消除了大量蛋白，且具有珠击步骤的核酸提取似乎更有效。用edbe样品的a260/a280比率更高。参见，图7b。
[0106]
测定洗脱物。如上设置测定。持续30次测定白色念珠菌测定1)引物idt #42562400
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.075 ul/rx
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.25 ul2)引物idt #42562401
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.075 ul/rx
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.25 ul3)探针186591515
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5 ul/rx
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.5 ul4)2x taqman缓冲液ab #4324018
ꢀꢀꢀ
12.5 ul/rx
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
375 ul5)10x ipc混合物 ab #4308332
ꢀꢀꢀꢀ
2.5 ul/rx
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
75 ul6)50x ipc模板 ab #4304662
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5 ul/rx
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15 ul
7)水.(md203a
‑
洗脱缓冲液)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4.3 ul/rx
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
129 ul制备母液混合物且将20 ul添加至板中的每个孔8)样品
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5.0 ul/rx
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
每个单独当完成时将样品放在
‑
20℃。
[0107]
装载24个位置
‑
然后添加5 ul样品。
[0108]
taqman缓冲液是applied biosystems (life technologies, grand island, ny) 通用 pcr母液混合物, part #4324018。ipc混合物(#408332)和ipc模板(#4304662)是来自applied biosystems的外源内部阳性对照。使用b132中的循环仪am01789中的程序ibisqpcr (ngul) lda以扩增核酸。将扩增负载至multianalyse 4中。图8a组合来自图8b
ꢀ–ꢀ
f的结果。图8b显示珠击和90分钟无edbe的结果。图8c显示珠击、45分钟edbe和90分钟无edbe的结果。图8d显示珠击、60分钟edbe和90分钟无edbe的结果。图8e显示珠击、75分钟edbe和90分钟无edbe的结果。图8f显示珠击、90分钟edbe和90分钟无edbe的结果。
[0109]
图9显示扩增核酸之后的ct结果。与edbe孵育75和90分钟与并入珠击的现有技术一样有效。无edbe的样品没有很好地提取酵母样品，其中样品中的酵母dna降低超过10倍。
[0110]
实施例5从痰液edbe提取结核分枝杆菌(mtb)。
[0111]
痰液样品用于测试lb
‑
etoh
‑
edbe溶液裂解和从mtb提取核酸的能力。如下将三个痰液样品等分入配衡的15 ml聚丙烯管。移除圆锥端的5 ml移液管用于转移痰液。计算管中的痰液的体积，且然后将热杀灭的mtb培养物以3000 cfu/ml添加至样品，其中每ml痰液添加12.3微升。
[0112]
目标是热杀灭mtb。储备物为245,000 cfu/ml，且稀释至3000 cfu/每ml痰液。12.3 ul/每ml痰液。添加量参见下面。
[0113]
向痰液样品添加lb
‑
etoh
‑
20%edbe的3倍的痰液体积。
[0114]
将管放入80℃的加热块组中，且孵育70分钟。提取使用如上所述的abbott plexidsp实施。使用的试剂如上所述。样品已经孵育之后，将裂解物添加至提取板。最大负载量为5ml。
[0115]
使用b130中的nanodrop lite am03366测量核酸(dna)含量。
[0116]
使用针对mtb dna的pcr测试测试提取的样品。图10a显示从图10b
ꢀ–ꢀ
e组合的结果。图10b显示阴性对照和30,000个拷贝(阳性对照)的结果。图10c显示痰液样品a的结果，4次重复测定两次提取中的每次。还显示高阳性对照样品。图10d显示痰液样品b的结果，4次重复测定四次提取中的每次。还显示高阳性样品。图10e显示痰液样品c的结果，4次重复测定两次提取中的每次。还显示高阳性样品。lb
‑
etoh
‑
edbe混合物可以溶解痰液，且一步提取mtb。
[0117]
实施例6适用于从细胞材料提取核酸的胺单体的鉴定。几种额外的胺单体被鉴定为适合于从细胞来源材料(包括但不限于新鲜、固定和ffpe材料)提取核酸(例如，dna、rna等)。选择测试的胺单体，因为它们似乎没有edbe溶剂那么危险且具有与edbe类似的特性。进行初始筛选以确定是否任何溶剂在从全血提取酵母(白色念珠菌)和金黄色葡萄球菌dna中起作用。casa(白色念珠菌和金黄色葡萄球菌样品混合物；参见下文)用作对照。edbe能够从ffpe材料和从全血中列出的目标提取dna。本实施例测试下面列出的7种胺单体，且与用edbe提取进行比较。
[0118]
以2:1比率混合裂解缓冲液(lb：参见上文)和乙醇，使得混合物具有33.3％乙醇(etoh)。洗涤剂1为50% etoh。洗涤剂2为约74% etoh。将样品稀释至200 cfu/ml的白色念珠菌或金黄色葡萄球菌。将血液以9:1添加至目标样品。将18 μl的casa标准品(casa标准品含有100,000 cfu.ml白色念珠菌和100,000 cfu.ml金黄色葡萄球菌)添加至阴性稀释剂(经设计以模拟血浆的组成的制剂；abbott molecular产品编号#60217; abbott park, il;)。测试每种的三个重复连同lb
‑
etoh对照和naoh对照。
[0119]
提取每种混合物的三个重复。每种混合物的三个重复。
[0120]
第一次运行。十五个2ml管具有1.5 ml上述试剂(各混合物的3次重复)。制备新鲜测试样品，且将50微升样品添加至每个管中。将样品在58℃孵育4小时。在maxwell (promega, madison wi)中设置盒用于pcr，其中每个孔中具有50 μl mmp。裂解之后，将样品倒入裂解孔且如下处理：将样品在洗涤剂1中洗涤2次，且在洗涤剂2中洗涤2次。洗涤的mmp用100μl洗脱溶液洗脱。
[0121]
第二次运行。将样品在80℃裂解45分钟。其余与第一次运行相同。
[0122]
裂解和处理之后，如下对每个样品进行pcr。如下对每个样品进行pcr。
[0123]
图22显示白色念珠菌和金黄色葡萄球菌分别通过溶剂的数据的单因素分析的结果。图22显示从由全血提取的白色念珠菌和金黄色葡萄球菌细胞生成的fam ct值。将血液样品与白色念珠菌和金黄色葡萄球菌两者(casa样品)的储备物，且在相同反应中提取。白色念珠菌是致病性酵母，且金黄色葡萄球菌是致病性革兰氏阳性细菌。尽管两种生物体的细胞壁的结构和内容物不同，但它们都已知难以裂解用于dna提取。图22a显示使用添加至abbott裂解缓冲液的各种溶剂提取白色念珠菌的结果。当与使用lb
‑
etoh看到的结果相比时，在具有添加的各种胺溶剂的所有条件下，白色念珠菌信号得到改善(较低ct值)。lb
‑
etoh是来自m2000sample preparation systemdna提取试剂盒的abbott裂解缓冲液，其具有添加的33％乙醇。将naoh添加至提取确实似乎有点改善提取，但没有用胺溶剂看到的程度。第二个图显示用在与上述相同的条件下从全血提取的金黄色葡萄球菌获得的结果。再次，在该情况下，所有胺溶剂都改善提取，但naoh的使用也比用白色念珠菌所看到更加改善提取。该图在右手侧具有数据的统计分析。不接触的圆被认为是彼此统计学差异的。如两个图中可见，不具有添加组分的lb
‑
etoh提取是效率最低的方法(具有最高的ct值)，并且与其他方法是统计学差异的。下面提供额外数据。
[0124]
白色念珠菌平均值和标准偏差
。
[0125]
金黄色葡萄球菌平均值和标准偏差。
[0126]
3a1p、a2p和dmp对于白色念珠菌最好起作用，其显示相比于lb
‑
etoh对照约五倍ct改善。所有都略好于edbe。amp、dmp和naoh用金黄色葡萄球菌良好起作用。进一步研究证实dmp、aee、2a1b、3a1p和a2p用于从所述测试样品提取dna的功效(数据未显示)，显示关于对于dna提取有效的胺单体对于本发明的广泛适用性。又进一步，发现广泛范围的涉及温度和时间的条件适用于本发明，尽管一些温度和时间得到更好结果(数据未显示)。
[0127]
实施例7ffpe样品的3
‑
氨基
‑1‑
丙醇(3a1p)提取。测试三种类型的样品。crc(结肠直肠癌)、黑色素瘤和肺组织。将样品与本领域已知且得自qiagen (valencia, ca)和promega (madison, wi)的ffpe提取系统进行比较。相继取来自石蜡块的样品切片(5微米厚，没有封固在载玻片上)，使得每第三个样品测试相同提取条件，以减轻切片变异性。用于本发明的方法(3a1p提取)的本实验的裂解条件如下。裂解条件：60％裂解缓冲液(lb)；20％乙醇和20％ 3a1p，总体积1.5 ml。在78℃和94℃且持续30分钟至4小时的时间段测试孵育。裂解孵育之后，将mmp (25 μl)添加至样品。捕获时间为在室温(rt)下10分钟。mmp在室温用0.5 ml lb和33% etoh洗涤一次持续2分钟，随后在室温用70% etoh洗涤两次，每次2分钟。将样品干燥5分钟，且在70℃用100μl di水洗脱10分钟。根据制造商的说明处理用qiagen和promega方案处理的样品。pcr用于检测braf
‑
e。braf
‑
e测定用fam检测基因突变，用cyc5检测正常基因。测定ct值，pcr反应中目标的浓度的相对量度，如本领域普通技术人员已知。crc样品的ct数据显示于图11，δ
‑
ct (dct：对照和测试样品之间的ct值的变化)显示于图12。小于13的dct值被认为对于测试的肿瘤标志物是阳性的。如从数据可见，本发明的胺提取程序与本领域qiagen和promega方法是至少一样好的(如果不是更好)，同时要求较少的处理步骤和更快的处理时间。更详细地，在图11中，说明两个信号的循环阈值(ct值)。循环阈值是指pcr反应中的循环数，其中信号显著高于背景。测定中更大量的目标允许用较低量循环生成信号，
所以较低量表明较高量的目标。该图显示来自结肠直肠癌组织c9和c13的ffpe材料的两个独立块的结果。从所述块制备连续切片，且用三种不同的方法提取数字代表的分离切片。fam信号是蓝色柱，且cy5信号是红色柱。来自qiagen处理的切片的信号用淡蓝色和红色柱代表，且标记为qia。来自promega处理的切片的信号用深蓝色和红色柱代表，且标记为csc。这两种方法都在从ffpe组织分离dna中使用蛋白酶消化。来自abbott胺溶剂系统的信号由亮蓝色和红色柱代表。如图中可见，来自abbott提取的信号与用其他两种方法获得的信号相当。图12显示图11中的fam和cy5信号之间的差异。该dct值用于帮助确定提取的组织是否是癌性的。小于13的差异表明样品中存在相对较高量的突变基因(较低ct值)，且样品可以是癌性的。这三种不同的方法通过分别针对qiagen、promega和abbott方法的浅绿色、深绿色和亮绿色柱说明。在c9和c13样品两者中，abbott方法给出与其他两种方法相当的dct值。
[0128]
在图13和图14中，显示肺肿瘤ffpe组织的循环阈值(ct值)和dct值。该图显示来自肺肿瘤组织l1和l4的ffpe材料的两个独立块的结果。再次，从所述块制备连续切片，且通过数字代表的分开切片用三种不同的方法提取。fam信号是蓝色柱，且cy5信号是红色柱。来自qiagen处理的切片的信号用淡蓝色和红色柱代表，且标记为qia。来自promega处理的切片的信号用深蓝色和红色柱代表，且标记为csc。这两种方法都在从ffpe组织分离dna中使用蛋白酶消化。来自abbott胺溶剂系统的信号由亮蓝色和红色柱代表。如图中可见，来自abbott提取的信号与用promega系统和用qiagen方法处理的样品之一(l1)获得的信号相当。然而，l4样品处理的qiagen方法不像promega或abbott方法那样好地分离dna。图14显示图13中的fam和cy5信号之间的差异。这三种不同的方法通过分别针对qiagen、promega和abbott方法的浅绿色、深绿色和亮绿色柱说明。在两种l1样品中，abbott方法给出与其他两种方法相当的dct值，而qiagen方法似乎没有一样好地提取l4样品。
[0129]
对黑色素瘤样品一式两份进行提取方案实验。提取和处理条件如上。图15显示ct数据，且图16显示dct数据。在图15中，说明两个信号的循环阈值(ct值)。循环阈值是指pcr反应中的循环数，其中信号显著高于背景。测定中更大量的目标允许用较低量循环生成信号，所以较低量表明较高量的目标。该图显示来自黑色素瘤组织m11和m14的ffpe材料的两个独立块的结果。从所述块制备连续切片，且通过数字代表的分开切片用三种不同的方法提取。fam信号是蓝色柱，且cy5信号是红色柱。来自qiagen处理的切片的信号用淡蓝色和红色柱代表，且标记为qia。来自promega处理的切片的信号用深蓝色和红色柱代表，且标记为csc。这两种方法都在从ffpe组织分离dna中使用蛋白酶消化。来自abbott胺溶剂系统的信号由亮蓝色和红色柱代表。如图中可见，来自abbott提取的信号与用其他两种方法获得的信号相当。图16显示图15中的fam和cy5信号之间的差异。该dct值用于帮助确定提取的组织是否是癌性的。小于13的差异表明样品中存在相对较高量的突变基因(较低ct值)，且样品可以是癌性的。这三种不同的方法通过分别针对qiagen、promega和abbott方法的浅绿色、深绿色和亮绿色柱说明。在m11样品中，abbott方法似乎给出比其他两种方法更好的dct值(较低dct)。m14样品显示有趣的模式，其中该组织的一些切片具有高dct值，但随着切片进一步进入样品，它们降低。这表明，组织块的一些切片可不含肿瘤细胞，且必须测试多个切片。下面讨论从多个切片分离dna的能力。
[0130]
这三个实验显示，本发明的胺溶剂提取过程与qiagen和promega方案表现至少一样好，同时要求较少的处理步骤和更快的处理时间。
[0131]
实施例8本发明的组合物和方法的多功能性提供相对于现有技术程序的改善。例如，对于载片封固的样本，现有技术程序要求从载玻片刮擦样品。该步骤经受操作者误差。所需刮擦是耗时的，使用锋利器具，且具有交叉污染的高可能性。本发明的组合物和方法允许直接从载片提取dna，而不从载片刮擦样品。此外，多个载片可以一起处理，以减轻切片变化引起的可能测定变化(即，样品切片之间的变化引起的“有或无(hit or miss)”)，或者帮助检测低水平目标。可以在设计用于盛装多个载片的接受容器(rv)中处理载片。样品中的dna对于mmp比对于载玻片具有更大的亲和力(这可以是不同类型的玻璃和/或添加至过量的mmp的结果)。图17显示具有本发明针对乙型肝炎病毒对照的组合物和方法处理的结果的图，图18显示在裂解
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孵育程序过程中添加mmp的相同程序。在方案中的该点添加mmp导致dna捕获在mmp上。在乳腺ffpe载片上进行的实验证明了该程序的有效性。用lb
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etoh
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3a1p或lb
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3a1p提取样品，其中在孵育之后添加etoh。还在有或没有mmp的情况下孵育样品。对于每种条件，所述孵育在90℃持续2小时20分钟。图19显示，在有或没有etoh的情况下在裂解孵育中添加mmp导致dna结合至mmp，如由drn值所示。drn代表均一化响应的差值，这是其已经使用程序基线化之后来自pcr反应的荧光信号的值，所述程序被称为multianalyze4 (abbott molecular in
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house software program, abbott park, il。其他合适的方案是市售的，如本领域普通技术人员已知，这通过网址诸如www.gene
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quantification.de/hkg.html和类似网址的教导所教导)。从drn通过drn的特定阈值的点生成ct值。
[0132]
实施例9在本实施例中，同时处理多个载片。在相同反应容器中处理1至4个载玻片。在处理少于4个切片的条件下，空白载片用作占位物(placeholders)。一次处理多于一个载片可以帮助检测低拷贝数目标。图20显示同时处理1至4个载片的结果。用每次处理额外载片改进检测。测试乳腺组织ffpe和pathvysion
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a probe chek normal载片(abbott laboratories, abbott park, il)。图21显示数据的单因素anova分析。
[0133]
更详细地，图20是当在相同的反应容器中提取1至4个含有ffpe材料的载片时生成的扩增曲线的图示。使用两个不同的载片集合。一个集合由仍含有石蜡的乳腺组织ffpe载片组成。另一个集合含有pathvyson
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a probe chek normal载片(ffpe处理的细胞)，其已经使用fish方法检测，且在fish处理过程中已经去除石蜡。图21具有两个图。第一个显示两个提取集合的cy5 ct值。b1、b2、b3和b4分别含有1、2、3、4个乳腺组织载片。ct随着每个额外载片降低，这表明，在具有更大数目载片的扩增反应中存在更多dna。所述水平在3个载片后没有降低，且可以表明在该点提取最大水平的材料。mr值代表最大比率(maxratio)，且表明扩增反应的幅度。较高mr值表明扩增反应更强健。mr值确实随着具有4个载片的乳腺组织样品降低，这可以表明，用该组织的3个载片提取最大水平的材料，且增加水平的石蜡可能是一个问题。来自fish处理的载片(pv1至pv4)的材料还显示ct值的降低，反应中具有更大数目的载片，和因此更多的dna。ct值随着第四个载片继续下降。mr值不随着添加的载片而减小。这载片集合没有石蜡，并且这可以反映在该数据中。
[0134]
实施例10在本实施例中，先前处理用于荧光原位杂交(fish)分析的载片用本发明的组合物和方法进行处理。结果显示，核酸从先前处理用于fish分析的载片提取，且分离的dna适用
于从fish过程载片提取之后的进一步分析。
[0135]
实施例11从结核分枝杆菌(mtb)提取核酸。用3a1p裂解组合物裂解将溶解痰液，且从mtb提取核酸。此外，该组合物可以用于灭活目标mtb。尽管不希望本发明受到理论限制，据信，本发明的3a1p裂解组合物的高ph可以负责目标mtb的灭活。