重症肌无力外周血单细胞转录组文库及制备方法和应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种重症肌无力外周血单细胞转录组文库及制备方法和应用。


背景技术：

2.单细胞转录组测序技术作为本世纪新兴的生物技术之一，使得在个体细胞水平研究免疫系统成为可能，现在广泛应用于免疫学研究，试图解决以往被忽视的细胞异质性。单细胞转录组测序技术在2009年问世，这种方法一次可以检测大量基因，可以更全面的对不同类型细胞的转录表征进行检测。在随后的研究中，各种改进和创新的方法被陆续研发出来。其中，根据建库方式的不同，可分为两大类，一类是全长转录组测序方法，另一类是基于分子5’端或3’端独立分子标签(umi)的测序方法，两类方法各有优劣。全长转录组测序的主要代表是smart
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seq2和 fluidigm c1等，这类方法的优点是3’端偏好较低，覆盖了整个转录组，测序深度较高。使它们适合应用于包括细胞类型发现、组织构成评估、等位基因表达分析，甚至等位基因发现。然而由于建库过程需要人为地将细胞分离至单独的管中，因而该类方法的建库成本较高，过程繁琐且通量较低。而基于umi的测序方法因其流程较前一种方法而言更为简化，因而可通过机器分选的方式进行单细胞建库。以mars
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seq、10x genomics、drop
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seq为代表的umi测序方法可在短时间内将数万个细胞分选为单个细胞的悬液，并将反转录的相关试剂共同包裹至单细胞液滴中，从而实现了快速且高通量的测序。由于umi测序仅限于转录本的一端，与“全长”方法相比，整体的灵敏度降低了。尽管有这些缺点，基于标签的方法的低成本和高通量意味着这些方法现在被广泛应用于基因表达水平、细胞类型发现和组织构成的研究。
3.免疫系统包括由细胞、组织和器官组成的网络。这个网络负责调节宿主对病原体的防御及维持自身正常的稳态。借助流式细胞术，免疫细胞可以根特定的表面或核内标志物分为不同的类型。疾病发生后，血液中的相关基因的转录也发生了变化，这些变化对临床检测来说有极为重要的意义。通过检测比较正常样本和疾病样本的转录变化，可以用于诊断疾病、监测疾病病情的发生发展、指导临床治疗，从而实现疾病的最终治疗目标。然而并非所有的免疫细胞类型都可以通过流式区分出来。此外，利用常规的检测方法，仅能对全转录组进行测序，无法对稀有细胞进行分析。重症肌无力是一种由自身抗体介导的，t细胞、b细胞、dc细胞共同参与的自身免疫性疾病。b细胞、dc细胞在外周血的占比较低，由传统的全转录组测序测得的平均表达信号无法反映其转录的变化。
4.因此，以往的转录组研究很可能忽略了重要的细胞间的变异性。为了更好地理解生物学过程，单个细胞的转录组对于阐明不同细胞的功能以及了解基因表达如何调控有益或有害的状态至关重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种重症肌无力外周血单细胞转录组文库及制备方法和
应用，解决重症肌无力发病机制的探究在单细胞转录组测序技术上还有所欠缺的问题。
6.为解决上述的技术问题，本发明采用的第一种技术方案是：一种外周血单细胞转录组文库的制备方法，包括如下步骤：s1、将5ml外周血在离心机上以500g离心10分钟，然后去除上层清夜，得到第一血液标本；s2、在无菌环境下向第一血液标本内加入等体积的1
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pbs，然后利用巴氏管吹打均匀后得到第二血液标本；s3、取一15ml的第一离心管，向第一离心管中加入2.5ml人淋巴细胞分离液，然后倾斜第一离心管并向其中加入第二血液标本；s4、在室温环境下将第一离心管放入离心机上，以快升慢降的方式离心20分钟；s5、吸取第一离心管内的白雾层pbmc，然后转移至一15ml的第二离心管内，并用10 ml 1
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pbs洗涤2次后在300g下离心20分钟；s6、向第二离心管中加入1mlhbss重悬细胞，并混合均匀得到第三血液样本；s7、使用40
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m 的细胞过滤器对第三血液样本进行过滤；s8、利用single cell 5’技术处理经s7过滤后的pbmc，然后利用illumina测序平台上机得到单细胞转录组文库。
7.进一步的技术方案是，所述无菌环境为无菌超净工作台，所述无菌超净工作台在使用前利用75%的酒精进行消毒，然后利用紫外灯照射30min。
8.更进一步的技术方案是，所述s7步骤后利用 bio
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rad ct20 细胞计数仪或显微镜细胞计数板台盼蓝染色检测细胞浓度和活性，若未达到所需理想细胞浓度，则加入hbss 培养液进行稀释。
9.更进一步的技术方案是，所述理想细胞浓度为1000
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2000 cells/
µ
l 或1
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2 *106cells/ml。
10.更进一步的技术方案是，所述s3中第一离心管的倾斜角度为45度，第二血液标本沿第一离心管的管壁流入第一离心管。
11.本发明采用的第二种技术方案是：一种单细胞转录组文库，采用上述的制备方法制得单细胞转录组文库。
12.本发明采用的第三种技术方案是：一种上述单细胞转录组文库的应用，将其用于细胞类型的鉴定。
13.本发明采用的第四种技术方案是：一种上述单细胞转录组文库的应用，将其用于重症肌无力患者的单细胞转录组文库和正常人的单细胞转录组文库进行测序对比。
14.本发明采用的第五种技术方案是：一种上述单细胞转录组文库的质控方法，包括如下步骤：步骤一、基于r版本3.6.3，安装seurat包；步骤二、将单细胞转录组文库的基因表达矩阵读入到r环境中；步骤三、将基因表达在3个细胞且至少有200个基因的细胞进行保留，其余过滤。
15.与现有技术相比，本发明至少具有以下的有益效果之一：1、本发明的单细胞测序技术耗时短、通量高具有细胞标签的特点；
2、本发明可以短时间内对外周血的单个核细胞进行全面的分析，对重症肌无力患者的分析具有重要作用；3、本发明利用单细胞转录组测序还具有灵敏度搞的特点，同时结合生物信息学技术，可以在短时间内无偏倚地对大量病理指标进行深入筛查。
附图说明
16.图1（a）为本发明中umap展示重症肌无力病人的分群。
17.图1（b）为本发明中umap展示正常人的分群。
18.图2为本发明中重症肌无力病人对比正常人b细胞的kegg富集通路。
具体实施方式
19.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
20.图1
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2示出了本发明重症肌无力外周血单细胞转录组文库及制备方法和应用的实施例。
21.实施例1：一种外周血单细胞转录组文库的制备方法，包括如下步骤：s1、将5ml外周血在离心机上以500g离心10分钟，然后去除上层清夜，得到第一血液标本；s2、在无菌环境下向第一血液标本内加入等体积的1
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pbs，然后利用巴氏管吹打均匀后得到第二血液标本；s3、取一15ml的第一离心管，向第一离心管中加入2.5ml人淋巴细胞分离液，然后倾斜第一离心管并向其中加入第二血液标本；s4、在室温环境下将第一离心管放入离心机上，以快升慢降的方式离心20分钟；s5、吸取第一离心管内的白雾层pbmc，然后转移至一15ml的第二离心管内，并用10 ml 1
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pbs洗涤2次后在300g下离心20分钟；s6、向第二离心管中加入1mlhbss重悬细胞，并混合均匀得到第三血液样本；s7、使用40
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m 的细胞过滤器对第三血液样本进行过滤；s8、利用single cell 5’技术处理经s7过滤后的pbmc，然后利用illumina测序平台上机得到单细胞转录组文库。
22.其中，无菌环境为无菌超净工作台，无菌超净工作台在使用前利用75%的酒精进行消毒，然后利用紫外灯照射30min。且后续所需器材均需利用75%酒精的无菌纱布擦拭后放到无菌超净工作台。同时在使用的过程中，需注意无菌超净工作台处的通风。
23.其中，s7步骤后利用 bio
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rad ct20 细胞计数仪或显微镜细胞计数板台盼蓝染色检测细胞浓度和活性，若未达到所需理想细胞浓度，则加入hbss 培养液进行稀释。理想细胞浓度为1000
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2000 cells/
µ
l 或1
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2 *106cells/ml。
24.其中外周血的采集先利用碘伏擦拭被采集人手肘静脉处，然后用干棉签擦干，再用采血针轻刺肘部皮肤表层，用edta抗凝管采集新鲜外周血5ml。
25.在s3中第一离心管的倾斜角度为45度，第二血液标本沿第一离心管的管壁流入第一离心管。
26.在进行单细胞转录组文库制备时，采用10x 单细胞建库。
27.实施例2：在前述实施例1的基础上本实施例提供一种单细胞转录组文库，采用前述实施例1中的制备方法制得单细胞转录组文库。
28.实施例3：在前述实施例2的基础上本实施例提供一种单细胞转录组文库的应用，将其用于细胞类型的鉴定。
29.实施例4：在前述实施例2的基础上本实施例提供一种单细胞转录组文库的应用，将其用于重症肌无力患者的单细胞转录组文库和正常人的单细胞转录组文库进行测序对比。
30.实施例5：在前述实施例2的基础上本实施例提供一种单细胞转录组文库的质控方法，包括如下步骤：步骤一、基于r版本3.6.3，安装seurat包；步骤二、将单细胞转录组文库的基因表达矩阵读入到r环境中；步骤三、将基因表达在3个细胞且至少有200个基因的细胞进行保留，其余过滤。
31.实施例6：再通过实施例5中的质控完成后，可以基于r版本3.6.3，安装seurat、monocle2、deseq2、clusterprofiler包，从而用主成分分析法无偏倚地降维，将总细胞分成几组细胞群，并用umap进行可视化，umap保留和投射与多分支轨迹相关的信息，有助于拟时间分析。然后通过seurat包计算得到的前述步骤分得的亚群之间的差异，并获得不同细胞簇的标记基因。其中一般认为cd3e为t细胞的标记基因，ms4a1、cd79a为b细胞的标记基因，cd14、fcgr3a为单核细胞的标记基因，lilra4、fcer1a为dc细胞的标记基因，nkg7为nk细胞的标记基因，再用clusterprofiler包对差异基因进行功能富集分析。包括gene ontology (go) 和kyoto encyclopedia of genes and genomes (kegg) 分析。然后再基于细胞亚群，对受试者免疫亚群进行深入分析，阐述疾病的发生机制。
32.实施例7：按实施例1
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6的方案来对年龄性别相匹配的正常人和重症肌无力患者进行对比分析。
33.选取对象为2名正常女性和2名女性重症肌无力患者，4者年龄接近。
34.对4者进行单细胞测序后无偏倚地将外周血单个核细胞分为13群，得到t细胞，b细胞，树突细胞，单核细胞，自然杀伤细胞五个大类，如图1（a）和图1（b）所示。
35.然后基于细胞亚群，对受试者免疫亚群进行深入分析，以b细胞为例：图2为病人和正常人对比deseq2包计算得到差异基因，随后用clusterprofiler包得到的kegg通路富集图（如图2所示）。由这个结果可以看出重症肌无力患者的b细胞在细胞因子介导的信号通路、抗原提呈信号通路、淋巴系统激活、适应性免疫相关的通路均有增强。
36.重症肌无力在此前并未有过关于b细胞亚群的高通量分析，因此，采用单细胞测序
这种方式，能研究一些占比较少的稀有亚群的功能，对疾病机制的探索具有十分重要的意义，应用前景良好。
37.综上所述本方案具有以下优点：1、本方案的单细胞测序技术耗时短、通量高具有细胞标签的特点；2、本方案可以短时间内对外周血的单个核细胞进行全面的分析，对重症肌无力患者的分析具有重要作用；3、本方案利用单细胞转录组测序还具有灵敏度搞的特点，同时结合生物信息学技术，可以在短时间内无偏倚地对大量病理指标进行深入筛查。
38.尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本技术公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本技术公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。