一株酵母菌株HF-21及其双相催化制备D-泛解酸内酯的方法

一株酵母菌株hf
‑
21及其双相催化制备d
‑
泛解酸内酯的方法
技术领域
1.本发明涉及一株酵母菌株(saccharomyces sp.)hf
‑
21及其双相催化制备d
‑
泛解酸内酯的方法，属于微生物发酵技术领域。


背景技术：

2.d
‑
泛酸存在于植物以及低等生物的代谢过程中，被称为遍多酸或本多酸，是水溶性维生素b族的一种。d
‑
泛酸广泛应用于食品、饲料和医药工业，市场需求量大。
3.d
‑
泛酸的生产方法，通常采用异丁醛、甲醛、氰化钠合成dl
‑
泛解酸内酯，再通过化学法拆分或生物酶法拆分获得d
‑
泛解酸内酯，最后由β
‑
丙氨酸钙与d
‑
泛解酸内酯直接缩合而得到d
‑
泛酸钙，但这些方法都存在一定的缺点。化学法拆分dl
‑
泛解酸内酯的缺点是：奎宁化合物、手性胺等化学拆分剂成本高；杂质分离困难，且不利于环境保护。生物酶法拆分d
‑
泛解酸内酯的缺点是：普遍酶拆分效率不高，单位体积的生物量低，发酵成本高。因此，减少反应步骤、不需要手性拆分的d
‑
泛酸生产方法，具有重要的研究价值。
4.d
‑
泛解酸内酯是合成d
‑
泛酸的重要中间体。目前，制备d
‑
泛解酸内酯一般采用两种方法：(1)利用高度选择性的酶，将dl
‑
泛解酸内酯中的l
‑
泛解酸内酯加氢分解，得到d
‑
泛解酸内酯，由于加氢分解能力很低、酶活不稳定等因素，该方法很难实现工业化；(2)化学拆分法，用手性试剂与dl
‑
泛解酸内酯形成复盐，利用复盐在溶剂中的溶解度不同，将d
‑
体和l
‑
体的复盐分离，然后通过化学处理得到d
‑
泛解酸内酯，该法由于手性试剂成本高、环保问题等，应用难度很大；(3)不对称还原酶法，通过将酮泛解酸内酯直接还原成右型泛解酸内酯，省取了内酯化以及外消化等处理过程，一步到位获得了d
‑
泛解酸内酯。kuhn和sakayu shimizu发现可用酵母细胞还原酮泛解酸和酮泛解酸内酯，但在操作过程中发现，底物是不稳定物质，易在中性及碱性水溶液中发生水解反应，还有酶的活性有限，受到底物浓度的毒害作用，一直未实现工业化的应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一株酵母菌株hf
‑
21及其双相催化制备d
‑
泛解酸内酯的方法。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一株酵母菌株saccharomyces sp.hf21，已于2021年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no.m 2021728。
7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种双相催化制备d
‑
泛解酸内酯的方法，将酵母菌株hf21的菌体分散于水相中得到水相反应体系，并将底物分散于有机相中得到有机相反应体系，再将水相反应体系与有机相反应体系混合，进行反应后即得含有d
‑
泛解酸内酯的反应液，再进行萃取后即得d
‑
泛解酸内酯。
8.优选的技术方案为：水相与有机相的体积比为4：1
‑
1：1。
9.优选的技术方案为：所述水相为pbs缓冲液。
10.优选的技术方案为：所述有机相为乙酸乙酯、正己烷、乙酸正丁酯和邻苯二甲酸二丁酯中的至少一种。
11.优选的技术方案为：反应的条件为：温度为30
±
1℃，摇床转速为180
‑
22rpm，反应时间为24
‑
48h。
12.由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
13.1、本发明筛选得到一株酵母菌株hf21，能够产生高酶活的酮泛解酸内酯还原酶。
14.2、本发明开发了双相催化发酵方法，既抑制了酮泛解酸在水相中水解，又避免了酵母菌在有机相中失活，实现了酵母在有机相
‑
水相二相界面对底物的催化。
15.3、本发明利用高酶活酵母菌双相催化酮泛解酸内酯，一步催化制备d
‑
泛解酸内酯，产物得率达到54％，比磷酸盐缓冲液水相催化效率提升了42.6％，且底物自发水解率降低了52.2％。
附图说明
16.图1为本发明工艺分流程图。
17.图2为酵母菌株hf
‑
21形状。
18.图3为不同催化时间对底物的催化效率。
19.图4为不同双相体系对底物的催化效率。
20.图5为酮泛解酸内酯还原酶的催化流程图。
21.图6为酮泛解酸内酯标准曲线。
22.图7为d
‑
泛解酸内酯标准曲线。
23.图8为底物酮泛解酸内酯与产物d
‑
泛解酸内酯的gc色谱图。注：峰1(3.693min)：d
‑
泛解酸内酯；峰2(4.308min)：酮泛解酸内酯。
24.图9为催化产物的gc
‑
ms色谱图。
具体实施方式
25.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
26.请参阅图1
‑
9。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
27.实施例1：一株酵母菌株hf
‑
21及其双相催化制备d
‑
泛解酸内酯的方法
28.(1)筛选高活性酮泛解酸内酯还原酶的酵母菌株
29.通过从土壤中分离获得了几种酵母菌，包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和产阮假丝酵母等，通过初筛和复筛来获得菌株，验证对酮基泛解酸内酯的催化效果。
30.菌种分离纯化：
31.选取土壤样品1g，加入9ml无菌生理盐水，旋涡振荡10min充分混匀，取10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑
6 4个不同的稀释度涂布于ypd固体平板培养基(葡萄糖10g，大豆蛋白胨5g，酵母膏15g，琼脂20g，加入去离子水定容到1000ml，自然ph)，每个稀释度做3个平行，在28℃恒温培养箱中培养2天；再将具有典型酵母菌菌落特征的单菌落挑出，接种于和平板培养基配方相同的斜面试管中，28℃恒温培养箱中培养2天，置于4℃冰箱中保存备用。
32.酮泛解酸内酯还原酶高产突变菌株的筛选：
33.上述原始菌株通过n+离子束注入诱变选育，筛选到酮基泛解酸内酯还原酶高活性突变菌株hf21。具体步骤如下：
34.①
将上述原始酵母菌株的菌体悬浮液适当稀释。
35.②
用玻璃涂棒将100μl菌丝体稀释液均匀涂布于直径为90mm空白玻璃平皿中，置于超净工作台面用均匀风速吹干制成菌膜。
36.③
n
+
离子注入实验在中国科学院强合肥物质科学研究院离子束生物工程装置上进行，选择不同能量的n
+
离子注入和不同剂量的n+离子注入。即5～30kev，获得诱变菌株50株；3～20
×
2.6
×
1014ions/cm2，获得诱变菌株50株。
37.④
n
+
离子注入后将处理样品用1ml无菌水、无菌玻璃涂棒均匀刮下，吸取100μl于ypd平板培养基中培养，2天后进行单菌落记数，并计算致死率。将单菌落挑到ypd斜面培养基中28℃培养2天，长好的斜面菌种4℃保存待用。
38.⑤
挑选经过n
+
离子注入诱变后的单菌落100株，进行摇瓶发酵，发酵制备的菌体细胞进行催化酮泛解酸内酯实验(初筛)，根据技术方案(7)计算产物d
‑
泛解酸内酯的得率，筛选产物得率>10％的菌株进行复筛实验，根据复筛实验结果筛选得到高产突变菌株hf21。
39.高产菌株鉴定：
40.酵母菌株hf21主要生物学特征为：菌落颜色白色或乳白色，菌落形态凸起、圆整、光滑，直径大小为2
‑
3mm。
41.根据18srdna保守序列的通用引物：
42.正向引物：5
’‑
tcctctaaatgaccaagtttg
‑3’
43.反向引物：5
’‑
ggaagggrtgtatttattag
‑3’
44.利用上述引物对酵母菌株hf21的18s rdna序列进行pcr扩增。pcr循环条件：95℃预变性5min，循环参数95℃变性1min，52℃复性45s，72℃延伸2min，重复35个循环后，72℃再延伸10min，最后4℃保温。用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。选用条带清晰的产物进行纯化。扩增产物经凝胶电泳回收，并连接到t载体后进行测序，获得了该菌株18srdna一级结构的序列。通过在genebank数据库中进行blast同源性比对，结果发现hf21与酿酒酵母saccharomvces cerevisiae的18s rdna序列相似性为99.5％。
45.因此，hf21属于酿酒酵母菌株，但它不同于已知的酿酒酵母。saccharomyces sp.hf21是一株新的酮基泛解酸内酯还原酶高活性酵母菌株。
46.(2)双相催化发酵体系的构建
47.所述可选择的有机溶剂源于乙酸乙酯、正己烷、乙酸正丁酯和邻苯二甲酸二丁酯中的一种。
48.水相是指100mm ph5.2的pbs缓冲液(kh2po4‑
na2hpo4)。
49.有机相是指100％的有机溶剂。
50.双相溶剂体系是指在单一水相或者离子液体的溶剂中加入有机溶剂作为萃取剂，形成双相溶剂体系。而本方案中的加入的有机溶剂既作为溶解剂，来稳定酮泛解酸内酯的理化性质，又作为萃取剂，来减少产物和底物的副反应。本方案构建的双相溶剂体系，有机相和水相体积比为1:1～4:1之间。
51.(3)发酵过程
52.斜面培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母膏15g，琼脂20g，加入去离子水定容到1000ml，自然ph。取30
×
200mm玻璃试管，每支装20ml培养基，经121℃灭菌20min，冷却到50
‑
60℃摆斜面。斜面接种环接入酵母hf21的菌体后在28
±
2℃条件下培养。
53.种子培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，瓶装液量为250ml三角瓶装25ml，121℃灭菌20min。接种铲接种上述斜面培养的菌体，培养温度30
±
1℃、200rpm，摇床振荡培养24
‑
26h，得到种子液。
54.发酵培养基：葡萄糖2％，酵母粉1％，磷酸二氢钾0.15％，摇瓶装液量为250ml三角瓶装25ml，121℃灭菌20min。将种子液以5
‑
10％(v/v)的接种量接入，在30
±
1℃、200rpm摇床振荡培养24
‑
48h。
55.(4)菌体细胞预处理(孵育)
56.按照上述方案培养好的发酵液，8000rpm离心20min收集菌体细胞，加入100mm ph5.2的pbs缓冲液洗涤2次，4000rpm离心8min收集湿菌体。取适量湿菌体，加入30ml pbs缓冲液振荡混匀，再加入5％葡萄糖，在30℃、200rpm条件下孵育1h后，4000rpm离心8min，弃上清液。收集菌体置于三角瓶中，加入30ml含5％葡萄糖的pbs缓冲液(100mm，ph5.2)，孵育2min，得到菌体细胞酶液。
57.(5)催化反应过程
58.取适量预处理后的发酵菌体，加入30ml pbs缓冲液振荡混匀，再加入5％葡萄糖，30℃、200rpm孵育1h。4000rpm离心8min，弃去上清液，收集菌体置于三角瓶中，加入30ml含5％葡萄糖的pbs缓冲液(100mm，ph5.2)，孵育2min后，加入76mg酮泛解酸内酯，继续振荡48h。收集反应液萃取分离产物。
59.(6)产物的提取过程
60.通过分液漏斗按反应液与乙酸乙酯体积比为1:1.2萃取二次，合并萃取液，萃取液进行旋蒸浓缩(50℃，真空度0.075mpa以下)，将得到的浓缩液置于三口烧瓶中，通过油泵减压操作，进行减压蒸馏处理(真空度0.096mpa)，收集温度约110℃
‑
120℃的馏分，即为d
‑
泛解酸内酯。
61.旋蒸：使用旋蒸仪将萃取液中的乙酸乙酯旋干，获得浓缩液；
62.pbs缓冲液配置：各配0.1m的磷酸二氢钾和磷酸氢二钠100ml，取磷酸二氢钾30ml和70ml磷酸氢二钠互溶，得100ml pbs缓冲液。
63.(7)测定菌株催化活性方法：利用gc测定酮泛解酸内酯的转化率和产率(公式如下)：
64.[0065][0066][0067]
所述的gc测定酮泛解酸内酯，具体检测方法为：色谱条件为柱温140℃保持6min，气化温度和火焰离子检测器(fid)的温度均为250℃。氮气作载气，柱流量为2ml/min，进样量为1μl，分流比为25:1。制备的d
‑
泛解酸内酯馏分溶于乙酸乙酯后，直接用gc检测。
[0068]
实施例2：
[0069]
酵母菌株是从安徽省亳州市一果园土壤中获得的原始菌株，经初步形态观察，符合酵母菌的基本特征。通过诱变选育，获得的一株高产酮泛解酸内酯水解酶的酵母菌株hf21。
[0070]
原始菌株经过n
+
离子注入诱变处理后挑选单菌落100株进行初筛。首先通过摇瓶发酵制备菌体细胞，用菌体细胞进行催化酮泛解酸内酯实验，筛选产物(d
‑
泛解酸内酯)得率>10％的菌株14株。将14株初筛菌株，摇瓶发酵后离心收集菌体，加入催化反应体系中，催化反应48h，收集反应液用乙酸乙酯萃取分离产物，减压蒸馏收集110℃
‑
120℃的馏分，用gc检测d
‑
泛解酸内酯的生成量，结果如表1。在14株初筛菌株中，hf21催化效果最佳，产物得率超过30％，因此将其作为后续的目标菌株，hf21在平板培养基上的生长特征如图1，菌落表面光滑饱满，呈乳白色，整体呈凸状圆形，易挑起。hf21经过18s rdna鉴定，为一株酵母菌株，该酵母菌株能够催化酮泛解酸内酯生成d
‑
泛解酸内酯。
[0071]
表1不同的酵母菌催化反应的产物得率
[0072][0073]
实施例3：
[0074]
(1)斜面菌体的制备和培养：葡萄糖10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂20g，加入去离子水定容到1000ml，自然ph。取30
×
200mm玻璃试管，每支装20ml培养基，经121℃灭菌
20min，冷却到50
‑
60℃摆斜面。斜面接种环接入酵母hf21的菌体后在28
±
2℃条件下培养。
[0075]
(2)种子培养基配方：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，瓶装液量为250ml三角瓶装25ml，经121℃灭菌20min。接种铲接种上述斜面培养的菌体，培养温度30
±
1℃、200rpm，摇床振荡培养24
‑
26h，得到种子液。
[0076]
(3)发酵培养基配方：葡萄糖2％，酵母粉1％，磷酸二氢钾0.15％，摇瓶装液量为250ml三角瓶装25ml，经121℃灭菌20min。将种子液以5
‑
10％(v/v)的接种量接入，在30
±
1℃、200rpm摇床振荡培养24
‑
48h，收集菌体。
[0077]
实施例4：
[0078]
(1)取实施例2的36h培养后的发酵液，离心收集菌体，加入100mlpbs缓冲液洗涤2次，4000rpm离心8min收集湿菌体，冷藏备用。
[0079]
(2)取适量湿菌体，加入30ml pbs(100mm，ph 5.2)振荡混匀，4000rpm离心8min，弃去上清液，加入30ml pbs缓冲液振荡混匀，再加入5％葡萄糖，在30℃、200rpm条件下孵育1h后，4000rpm离心8min，弃上清液。
[0080]
(3)收集菌体置于三角瓶中，加入30ml含5％葡萄糖的pbs缓冲液(100mm，ph5.2)，孵育2min，得到菌体细胞酶液。
[0081]
实施例5：
[0082]
取实施案例3的孵育活化的菌体细胞溶液，加入76mg酮基泛解酸内酯，继续振荡48h。分别在12h、24h、36h、42h、48h取样品，通过分液漏斗，加入二倍体积的乙酸乙酯萃取二次，合并有机相，通过gc进样检测。如图2，通过gc检测结果，结合底物和产物标准曲线，确定了hf21的催化不对称还原反应的最佳期间，分别处于36
‑
42h，为该菌种的最大催化效率。
[0083]
实施例6：
[0084]
取实施例3的孵育活化的菌体细胞溶液，称取76mg酮泛解酸内酯，先溶解到有机溶剂体系中，再将含有底物的有机溶剂加到菌体细胞溶液中，置于30℃摇床振荡反应36h，转速为200rpm。
[0085]
反应体系分别为100％pbs缓冲体系(100mm，ph7)、100％乙酸乙酯、100％乙酸丁酯、100％邻苯二甲酸二丁酯、含30％邻苯二甲酸二丁酯的pbs缓冲体系(100mm，ph7)、含50％邻苯二甲酸二丁酯的pbs缓冲体系(100mm，ph7)以及含70％邻苯二甲酸二丁酯的pbs缓冲体系(100mm，ph 7)。
[0086]
待反应结束后，通过分液漏斗萃取反应液，分别加入二倍体积的乙酸乙酯萃取二次，合并有机相，通过gc进样。
[0087]
如图3，根据gc检测结果，结合底物和产物标曲，确定水相体系产率仅34％，转化率为47％；而pbs缓冲液
‑
邻苯二甲酸二丁酯双相体系能最大程度地降低底物酮泛解酸内酯的自发水解反应，减少有机溶剂以及底物对酶的毒害作用，提高催化效率，产率达到54％，比pbs缓冲液水相催化效率提升了42.6％，且底物自发水解率降低了52.2％，证明该双相催化技术的可行性。
[0088]
实施例7：
[0089]
(1)取实施例2的36h培养后的发酵液，离心收集菌体，加入100mlpbs缓冲液洗涤2次，4000rpm离心8min收集湿菌体，冷藏备用。
[0090]
(2)取15g湿菌体进行酶催化反应，加入100ml pbs缓冲液振荡混匀收集菌体，再加
入5％葡萄糖，30℃、200rpm孵育1h。
[0091]
(3)孵育结束后4000rpm，离心8min，弃去上清液，收集菌体置于500ml三角瓶中，加到45ml含有5％葡萄糖的pbs缓冲液(100mm，ph5.2)，孵育2min。
[0092]
(4)称取0.45g酮泛解酸内酯，先溶解到105ml的邻苯二甲酸二丁酯有机溶剂中，再将含有底物的有机溶剂加入到含有菌体的pbs体系中，最后置于30℃摇床振荡反应36h，转速为200rpm。
[0093]
(5)待反应结束后，通过分液漏斗萃取反应液，分别加入二倍体积的乙酸乙酯萃取二次，合并有机相，通过gc进样检测。
[0094]
(6)将合并后的萃取液进行旋蒸处理，得到浓缩液。将产物放入三口烧瓶中，进行减压蒸馏(在0.096mpa真空度以下)脱除水分，收集110～120℃的馏分，即为d
‑
泛解酸内酯产品，重量为0.21g，d
‑
泛解酸内酯的产品收率为64.8％。
[0095]
gc色谱检测方法
[0096]
检测手段：色谱条件为柱温140℃保持6min，气化温度和火焰离子检测器(fid)的温度均为250℃。氮气作载气，柱流量为2ml/min，进样量为1μl，分流比为25:1。
[0097]
实施例8：一株酵母菌株hf
‑
21及其双相催化制备d
‑
泛解酸内酯的方法
[0098]
一株酵母菌株(saccharomyces sp.)hf21，已于2021年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no.m 2021728。
[0099]
一种双相催化制备d
‑
泛解酸内酯的方法，将酵母菌株hf21的菌体分散于水相中得到水相反应体系，并将底物分散于有机相中得到有机相反应体系，再将水相反应体系与有机相反应体系混合，进行反应后即得含有d
‑
泛解酸内酯的反应液，再进行萃取后即得d
‑
泛解酸内酯。
[0100]
水相与有机相的体积比为3：1。
[0101]
所述水相为pbs缓冲液。
[0102]
所述有机相为乙酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯中按照1：1的体积比混合后构成。
[0103]
反应的条件为：温度为30
±
1℃，摇床转速为180rpm，反应时间为24h。
[0104]
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。