猪圆环病毒4型制备方法及其应用

1.本发明属于病毒分子生物学技术及生物工程领域，具体涉及一种猪圆环病毒4型(porcine circovirus，pcv4)制备方法，人工制备的pcv4用于pcv4感染及致病机制的研究、疫苗研发等。


背景技术：

2.猪圆环病毒4型(porcine circovirus，pcv4)是近几年在家猪中检测到的一种新型猪圆环病毒，在世界部分国家已有报道。pcv4的基因组大小为1770nt，包含12个可能的开放阅读框(orf)，其orf1和orf2是两个主要的开放阅读框。orf1大小为891nt，编码296个氨基酸的rep蛋白；orf2大小为687nt，编码228个氨基酸的cap蛋白。
3.猪圆环病毒4型在患有呼吸系统疾病、腹泻和皮炎与肾病综合征的病猪中被发现，表明猪圆环病毒4型可能对养猪业构成潜在威胁。但目前尚未获得分离纯化的猪圆环病毒4型样品，也没有关于猪圆环病毒4型感染性克隆与病毒颗粒及其制备方法的研究报道。


技术实现要素：

4.本发明提供一种人工制备的猪圆环病毒4型及制备方法，得到的猪圆环病毒4用于疫苗研发、病毒感染检测方法的建立、病毒感染及致病机制的研究。
5.本发明提供一种人工制备的猪圆环病毒4型，其基因序列为如seq id no.1所示的人工合成pcv4基因序列。
6.本发明所述的人工合成pcv4基因序列是在如seq id no.4所示的pcv4全基因组序列上游和下游插入调控序列得到，如seq id no.2所示的调控序列位于pcv4全基因组序列上游，如seq id no.3所示的调控序列位于pcv4全基因组序列下游。
7.本发明提供的猪圆环病毒4型的制备方法如下：
8.s1、在如seq id no.4所示的pcv4全基因组序列上游和下游插入调控序列得到如seq id no.1所示的人工合成pcv4基因序列，如seq id no.2所示的调控序列位于pcv4全基因组序列上游，如seq id no.3所示的调控序列位于pcv4全基因组序列下游；
9.s2、用所述的人工合成的pcv4基因序列替换pbluescript sk(+)质粒上kpn i和saci位点之间序列，构建成pcv4重组质粒psk
‑
pcv4，即为pcv4感染性克隆psk
‑
pcv4；
10.s3、将psk
‑
pcv4转染进pk
‑
15细胞后培养后，收集上清液离心过滤获得人工制备的猪圆环病毒4型原液。
11.本发明还提供一种以所述的人工制备的猪圆环病毒4型为活性成分的活疫苗或灭活疫苗。
12.本发明的疫苗是以所述人工制备的猪圆环病毒4型作为种毒，参照猪圆环病毒灭活疫苗的生产工艺进行生产，本发明的灭活疫苗内可以加入免疫佐剂与疫苗赋形剂等，本领域技术人员可以容易的进行生产。
13.本发明提供的人工制备的猪圆环病毒4型为活性成分的灭活疫苗能达到较好的免
疫保护效果。
14.本发明在现有的猪圆环病毒4型全基因组的基础上插入了上游和下游两段调控序列，实现了人工制备了猪圆环病毒4型。
15.本发明构建的pcv4感染性克隆psk
‑
pcv4是在pbluescript sk(+)质粒的基础上，插入人工合成的pcv4全基因组和调控序列dna而成，其特征在于：调控序列dna 5
’‑
ggtacc
‑3’
和5
’‑
gagctc
‑3’
分别位于人工合成的pcv4全基因组dna的上游和下游。
16.本发明公开的pcv4感染性克隆psk
‑
pcv4可以在pk
‑
15细胞内复制、表达，其中pcv4感染性克隆psk
‑
pcv4上的人工合成的pcv4全基因组在复制过程中可以利用其两端的调控序列dna及自身的保守序列专一性的连接成长度为1770nt的单链环形dna，并与表达形成的pcv4病毒蛋白组装成pcv4病毒。
17.本发明公开的制备方法适用于人工制备pcv4病毒，得到的pcv4病毒可用于pcv4疫苗研发、pcv4病毒感染检测方法的建立、pcv4病毒感染及致病机制的研究，相关研究可为pcv4感染引起的疫病提供理论依据，为预防控制该疫病提供有效工具，在临床、实验室研究上均具有广阔的应用前景。
附图说明
18.图1、psk
‑
pcv4的质粒图谱；
19.图2、psk
‑
pcv4的酶切鉴定；
20.1.dna marker 15000；2.psk
‑
pcv4经sac i和kpn i双酶切；3.psk
‑
pcv4经sac i单酶切；4.psk
‑
pcv4经kpn i单酶切；5.psk
‑
pcv4；
21.图3、负染电镜结果；
22.图4、pcv4的拷贝数在盲传1
‑
4代中的变化。
具体实施方式
23.在本发明中若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
24.实施例1 pcv4感染性克隆的构建；
25.1)以ncbi上公开的pcv4序列(genbank：mt311854.1)为基础，人工合成包含如seq id no.4所示pcv4全基因组和如seq id no.2所示的上游调控序列和如seq id no.3所示的下游调控序列的如seq id no.1所示人工合成pcv4基因序列；
26.2)将如seq id no.1所示人工合成pcv4基因序列连接到pbluescript sk(+)质粒相应位点上，替换pbluescript sk(+)质粒上kpn i和saci位点之间序列，构建成pcv4重组质粒psk
‑
pcv4，即pcv4感染性克隆psk
‑
pcv4，如图1所示。
27.实施例2 pcv4感染性克隆的鉴定；
28.提取psk
‑
pcv4重组质粒，利用sac i和kpn i核酸内切酶对psk
‑
pcv4进行37℃水浴15min的酶切反应的酶切鉴定。反应体系中各成分添加如下：
29.序号试剂含量1fastdigest enzyme1μl
210
×
fasrdigest buffer1μl3dna2μl4ddh2o6μl总计 10μl
30.酶切反应结束后对产物进行dna水平凝胶电泳(0.8％agarose、120v、30min)。如图2所示，在双酶切的泳道1中可以观察到2.8kb的pbluescrpt sk载体条带和1.7kb的pcv4序列条带；在单酶切的2、3泳道中可以观察到线性化的psk
‑
pcv4重组质粒，而泳道4是未经过酶切反应的自然状态下超螺旋结构的psk
‑
pcv4重组质粒。核酸测序表明，pcv4病毒基因组全长为1770bp，与合成序列的模板pcv4进行比对碱基完全一致。酶切及测序鉴定证明，成功构建了pcv4重组质粒psk
‑
pcv4。
31.所以本发明成功构建了可用于制备pcv4病毒的pcv4重组质粒psk
‑
pcv4，该重组质粒即为pcv4感染性克隆。
32.实施例3 pcv4病毒的拯救及电镜鉴定
33.1质粒：pcv4感染性克隆psk
‑
pcv4。
34.2细胞：猪肾上皮细胞(pk
‑
15)。
35.3实验过程如下：
36.1)细胞转染
37.参照lipofectamine 3000说明书，将psk
‑
pcv4转染进pk
‑
15细胞中。
38.操作如下：在6孔板中接种细胞至70
‑
90％时转染。将5μl的lipofectaminetm 3000试剂加入125μl的opti
‑
memtm培养基中混匀备用。将含有5μg dna(0.5
‑
5μg/μl)的psk
‑
pcv4质粒溶液和10μl的p3000
tm
试剂(2μl/μg dna)加入125μl的opti
‑
mem
tm
培养基。将上述两管混合均匀，室温孵育10
‑
15分钟。将混合液用移液器轻轻吸起，缓慢均匀地滴加在上述培养的pk
‑
15细胞中，可轻轻摇晃使混合液充分接触细胞，平稳地将细胞转移至37℃，5％co2的温箱中培养。
39.2)病毒盲传
40.病毒的盲传是指在不确定是否存在病毒的情况下，按照病毒存在的情况传代接种新的细胞进行培养。
41.本发明中转染的细胞记为第0代，转染后的细胞培养72h，通过反复冻融法裂解细胞收集重组病毒，冻融后的病毒直接接种新的细胞记为盲传的第1代，之后每72h进行一次盲传记为一代，以此类推。每代次反复冻融获得的裂解液即为pcv4病毒原液。
42.3)电镜鉴定
43.在细胞盲传后，通过反复冻融法裂解细胞，离心后收集病毒样品，进行电镜负染观察病毒粒子形状。收集盲传至第四代的病毒，负染后进行电镜观察。结果如图3所示，在检测样品中可以清晰观察到典型的猪圆环病毒粒子，球形病毒粒子直径大约为20nm，证明成功拯救出了pcv4病毒。
44.实施例4 pcv4拯救病毒sybr两步法荧光定量pcr鉴定
45.在盲传的过程中收集每一代的病毒，并提取病毒基因组dna，用于对拯救的pcv4病毒拷贝数的检测。
46.本发明采取sybr两步法荧光定量pcr，针对pcv4序列上100bp左右的片段进行扩
增，从而确定该病毒的拷贝数。
47.将2
×
qpcr mix 5μl、上下游引物各0.3μl、病毒基因组dna模板1μl、ddh2o 3.4μl混合。经过预变性，35个循环的变性延伸、采集sybr荧光信号，测定溶解曲线，计算相对定量结果。上述sybr两步法荧光定量pcr检测中用到的特异引物序列为：
48.pcv4
‑
qpcr
‑
f：5
’‑
gcaagtggtgggatggatataa
‑3’
，
49.pcv4
‑
qpcr
‑
r：5
’‑
tgtccatgagtctcaacaagtc
‑3’
。
50.在对病毒进行细胞盲传培养至第四代后通过检测pcv4的拷贝数确定拯救病毒的增殖情况。利用sybr荧光定量pcr检测盲传1
‑
4代中的病毒基因组dna拷贝数，如图4所示，可以观察到，在盲传的第一代中因为转染后重组质粒的残留，拷贝数较高。在随后几代的盲传过程中，pcv4的拷贝数一直保持稳定，表明在重组质粒转染pk
‑
15细胞后，细胞中存在病毒基因，也就是用pcv4感染性克隆可以拯救出pcv4病毒，同时也表明该病毒在pk
‑
15细胞中具有良好的复制增殖能力。
51.上述结果证明，本发明拯救的pcv4病毒具有感染pk
‑
15细胞和在该细胞中增殖、传代的能力。
52.用本发明实施例1制备的pcv4感染性克隆可以成功拯救出pcv4病毒，其可作为活性成分用于制备疫苗。
53.本发明的疫苗是以所述人工制备的猪圆环病毒4型作为种毒，参照猪圆环病毒灭活疫苗的生产工艺进行生产，本发明的灭活疫苗内可以加入免疫佐剂与疫苗赋形剂等，本领域技术人员可以容易的进行生产。经过验证，本发明提供的人工制备的猪圆环病毒4型为活性成分的灭活疫苗能达到较好的免疫保护效果。
54.本发明对比实施例为将如seq id no.4所示的pcv4全基因组序列替换pbluescript sk(+)质粒上kpn i和saci位点之间序列，其余步骤相同，不能成功拯救出pcv4病毒。
55.本发明对比实施例为将如seq id no.2和3所示的调控序列替换为其他调控序列再得到的新的序列用于替换pbluescript sk(+)质粒上kpn i和saci位点之间序列，其余步骤相同，不能成功拯救出pcv4病毒。
56.最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。