高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法与流程

1.本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法。


背景技术：

2.小肠在营养吸收、病原屏障、药物转运与代谢等方面发挥重要作用。在口服药研发的临床前研究阶段，需使用人小肠组织或细胞对吸收、转运、代谢等药代动力学指标进行精准预测。然而，供体的不足致使这些原代资源难以获取；而目前被广泛使用的人结肠癌细胞caco
‑
2存在药物转运蛋白与正常组织表达差异过大、药物代谢酶表达量低等问题。
3.随着近年再生医学与组织工程学的迅猛发展，由人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hpsc）于体外诱导分化为3d小肠类器官的技术为解决这一难题带来了希望：一方面，相比于单层的caco
‑
2细胞，3d类器官包含更生理相关的结构与谱系，更贴近体内；另一方面，由于hpsc的自我更新能力，可源源不断地进行类器官分化用以供给。
4.目前，自hpsc向小肠类器官诱导分化的方法，均沿用或改良于jason r. spence等人最初创立的分化系统（directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro[j]. nature, 2011, 470(7332): 105
‑
109.）。然而，此系统分化效率低、成本高、难以实现大范围的应用（a refined culture system for human induced pluripotent stem cell
‑
derived intestinal epithelial organoids[j]. stem cell reports, 2018, 10(1): 314
‑
328..）。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明旨在提出一种高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法，相比于目前广泛流行几种方法generation of small intestinal organoids for experimental intestinal physiology."methods in cell biology 159 (2020): 143
‑
174.; differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells. developmental cell, 54(4), 516
‑
528; generation of intestinal organoids derived from human pluripotent stem cells for drug testing. scientific reports, 2020, 10(1): 1
‑
11.），可大幅提高小肠类器官产生效率，节约成本。
[0006]
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法，该方法包括如下步骤：s1、诱导人多能干细胞分化形成内胚层样细胞；首先在含有gdf 8、chir99021和b27的第一诱导培养基中培养，再用含有gdf 8和b27的第二诱导培养基培养，然后再更换为含有激活素a和dfbs的第三诱导培养基继续培养
得到；s2、诱导内胚层样细胞分化为中
‑
后肠球；s3、诱导中
‑
后肠球分化为小肠类器官。
[0007]
进一步地，所述第一诱导培养基中gdf 8的浓度为gdf 8的浓度为50
‑
300ng/ml，chir99021的浓度为1
‑
5μm，b27的浓度为0.5
‑
2%；所述第二诱导培养基中gdf 8的浓度为50
‑
300ng/ml，b27的浓度为0.5
‑
2%；所述第三诱导培养基中激活素a的浓度为50
‑
500ng/ml，dfbs的浓度为0.5
‑
2%。
[0008]
进一步地，在第一诱导培养基中的培养时间为24h，在第二诱导培养基中的培养时间为24h，在第三诱导培养基中的培养时间为24h
‑
48h。
[0009]
优选地，在第三诱导培养基中的培养时间为24h。
[0010]
进一步地，所述第一诱导培养基含有rpmi
‑
1640培养基作为基础培养基，并添加50
‑
300ng/ml rhgdf8、1
‑
5μm chir99021、0.5
‑
2% b27（
‑ꢀ
insulin）、0.2
‑
1% glutamax和0.5
‑
2% neaa。
[0011]
优选地，第一培养基中，rhgdf8（重组人生长分化因子8）的浓度为100 ng/ml。
[0012]
优选地，第一培养基中，chir99021（gsk
‑
3抑制剂）的浓度为2μm。
[0013]
优选地，第一培养基中，b27（
‑
insulin）（b27无血清营养补充剂（不含胰岛素型））的质量浓度为2%。
[0014]
优选地，第一培养基中，glutamax（l
‑
谷氨酰胺的替代品）的质量浓度为1%。
[0015]
优选地，第一培养基中，neaa（非必须氨基酸）的质量浓度为1%。
[0016]
进一步地，所述第二诱导培养基含有rpmi
‑
1640培养基作为基础培养基，并添加50
‑
300ng/ml rhgdf8、0.5
‑
2% b27（
‑ꢀ
insulin）、0.2
‑
1% glutamax和0.5
‑
2% neaa。
[0017]
优选地，第二培养基中，rhgdf8的浓度为100 ng/ml。
[0018]
优选地，第二培养基中，b27（
‑
insulin）的质量浓度为2%。
[0019]
优选地，第二培养基中，glutamax的质量浓度为1%。
[0020]
优选地，第二培养基中，neaa的质量浓度为1%。
[0021]
进一步地，所述第三诱导培养基含有rpmi
‑
1640培养基作为基础培养基，并添加50
‑
300ng/ml rhacta、0.5
‑
2% dfbs、0.2
‑
1% glutamax和0.5
‑
2% neaa 。
[0022]
优选地，第三培养基中，rhacta（重组人激活素a）的浓度为100 ng/ml。
[0023]
优选地，第三培养基中，dfbs（特级胎牛血清）的质量浓度为2%。
[0024]
优选地，第三培养基中，glutamax的质量浓度为1%。
[0025]
优选地，第三培养基中，neaa的质量浓度为1%。
[0026]
进一步地，所述s2包括如下步骤：将s1步骤中得到的内胚层样细胞在第四诱导培养基中培养4
‑
8天，其中，第四诱导培养基含有rpmi
‑
1640培养基作为基础培养基，并添加1
‑
5μm chir99021、100
‑
1000ng/ml fgf4、0.5
‑
3% dfbs、0.2
‑
1% glutamax和0.5
‑
2% neaa。
[0027]
优选地，培养时间为6天。
[0028]
优选地，第四培养基中，chir99021的浓度为2μm。
[0029]
优选地，第四培养基中，fgf4的浓度为500ng/ml。
[0030]
优选地，第四培养基中，dfbs的质量浓度为2%。
[0031]
优选地，第四培养基中，glutamax的质量浓度为1%。
[0032]
优选地，第四培养基中，neaa的质量浓度为1%。
[0033]
进一步地，所述s2培养条件为37℃、5% co2，每24h更换新培养基。
[0034]
进一步地，所述s3包括如下步骤：收集中
‑
后肠球，加入肠分化培养基中，并继续培养20
‑
30天，其中，肠分化培养基含有advanced dmem/f12培养基（改良型dmem/f12基础培养基）作为基础培养基，并添加50
‑
300ng/ml rhegf、50
‑
200ng/ml rhnog、300
‑
1000ng/ml rhrspo、0.5
‑
1% b27、0.5
‑
1% n2、3
‑
15mm hepes、0.2
‑
1% glutamax和0.5
‑
2% neaa。
[0035]
优选地，培养时间为29天。
[0036]
优选地，肠分化培养基中，rhegf（重组人上皮生长因子）的浓度为100ng/ml。
[0037]
优选地，肠分化培养基中，rhnog（重组人头蛋白）的浓度为100ng/ml。
[0038]
优选地，肠分化培养基中，rhrspo1（重组小鼠r
‑
spondin
‑
1）的浓度为500ng/ml。
[0039]
优选地，肠分化培养基中，b27的质量浓度为1%。
[0040]
优选地，肠分化培养基中，n2（无血清细胞营养补充剂）的质量浓度为1%。
[0041]
优选地，肠分化培养基中，hepes（n
‑
2羟乙基哌嗪
‑
n
‑2‑
乙烷磺酸）的浓度为15 mm。
[0042]
优选地，肠分化培养基中，glutamax的质量浓度为1%。
[0043]
优选地，肠分化培养基中，neaa的质量浓度为1%。
[0044]
进一步地，所述s3培养条件为37℃、5% co2，每72h更换新培养基。
[0045]
相对于现有技术，本发明所述的高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法具有以下优势：本发明所述的高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法由hpsc分化为内胚层样细胞不同于任何现有的内胚层诱导方法，采用不同的生长因子和血清混搭培养，依托本方法所产生的内胚层细胞，与当下流行的方法相比（generation of small intestinal organoids for experimental intestinal physiology."methods in cell biology 159 (2020): 143
‑
174.），可提升中
‑
后肠球的分化效率约829%
±
166%；基于1个中后肠球对应产生1个小肠类器官的基本事实（generation of intestinal organoids derived from human pluripotent stem cells for drug testing. scientific reports, 2020, 10(1): 1
‑
11.），应用本方法可提高小肠类器官产生效率约829%
±
166%，使人多能干细胞来源的肝类器官获得体外大规模扩增的能力。
附图说明
[0046]
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1为hpsc的多能性免疫荧光检测结果图；图2为本发明方法要求分化的起始密度图；图3为meghan capeling等人的方法要求分化的起始密度图；图4 为本发明方法要求分化的内胚层图；图5为meghan capeling等人的方法产生的内胚层图；图6 为本发明和meghan capeling等人的方法所产生的内胚层标志物sox17与
foxa2荧光定量pcr结果图（纵坐标：相对于d0天的hpsc细胞，被分析样本的基因表达量；横坐标：样本名称；*：p＜0.05；**：p＜0.01；黑点：生物学样本重复（n=4））；图7为day6天后本发明所形成的细胞图样；图8为day6天后meghan capeling等人的方法所形成的细胞图样；图9为day9天后本发明所形成的细胞图样；图10为day9天后meghan capeling等人的方法所形成的细胞图样；图11为本发明和meghan capeling等人的方法产生的中
‑
后肠球的数量百分比图（黑点：生物学样本重复（n=4））；图12为本发明所形成的中
‑
后肠球分化为小肠类器官图，其中，a与b具备绒毛、褶皱等肠特征性结构；c包含chga+ 肠内分泌细胞、d为lyz+ 潘氏细胞、e为muc2+ 杯状细胞、f为epcam+ 肠柱状上皮细胞、g为occ+ 紧密连接；h显示不表达大肠上皮标志物satb2。
具体实施方式
[0047]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0048]
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0049]
实施例中用到的相关试剂示于表1，引物序列示于表2，使用的相关抗体示于表3。
[0050]
本发明所述的高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法，大致包括如下3个阶段：阶段1：诱导人多能干细胞分化形成内胚层样细胞（day 1
‑
3）；具体方案为：1）分化前，须对hpsc的多能性进行检测。如图1免疫荧光结果表明，多能性标志物oct4与ssea4在表达模式正确的前提下，双阳性率＞97%，表明hpsc具备良好的分化潜能。
[0051]
本方法要求分化的起始密度为25
‑
40%，如图2所示。
[0052]
2）day 1：将人多能干细胞hpsc在第一诱导培养基中培养24h，其中第一诱导培养基含有rpmi
‑
1640培养基作为基础培养基，并添加100 ng/ml rhgdf8、2μm chir99021、质量浓度2% b27（
‑ꢀ
insulin）、质量浓度1% glutamax和质量浓度1% neaa；day2：将上述得到的细胞在第二诱导培养基中培养24h，其中第二诱导培养基含有rpmi
‑
1640培养基作为基础培养基，并添加100ng/ml rhgdf8、质量浓度2% b27（
‑ꢀ
insulin）、质量浓度1% glutamax和质量浓度1% neaa；day3：将上述得到的细胞在第三诱导培养基中培养24h，其中第三诱导培养基含有rpmi
‑
1640培养基作为基础培养基，并添加100ng/ml rhacta、质量浓度2% dfbs、质量浓度1% glutamax和质量浓度1% neaa。
[0053]
阶段2：诱导内胚层样细胞分化为中
‑
后肠球（day 4
‑
9）；将阶段1得到的内胚层样细胞在第四诱导培养基中培养6天，其中，第四诱导培养基含有rpmi
‑
1640培养基作为基础培养基，并添加2μm chir99021、500ng/ml fgf4、质量浓度2% dfbs、质量浓度1% glutamax和质量浓度1% neaa。
[0054]
本阶段培养条件为37℃、5% co2，每24h更换新培养基。
[0055]
阶段3：诱导中
‑
后肠球分化为小肠类器官（day 10
‑
38）
intestinal organoids for experimental intestinal physiology."methods in cell biology 159 (2020): 143
‑
174.），可提升中
‑
后肠球的分化效率约829%
±
166%；基于1个中后肠球对应产生1个小肠类器官的基本事实（generation of intestinal organoids derived from human pluripotent stem cells for drug testing. scientific reports, 2020, 10(1): 1
‑
11.），应用本方法可提高小肠类器官产生效率约829%
±
166%，明显提高了系统分化效率、且成本低。
[0065]
表1 试剂列表表2 引物列表
表3 抗体列表以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。