技术特征：
1.一种基于镧系纳米粒子的新型冠状病毒多组分核酸检测方法，其特征是按照以下操作步骤进行：a.制备羧基功能化的镧系纳米粒子：a1为了合成 nalnf4 (ln=tb, ho, eu) 纳米粒子，首先将 1 mmol naf 溶解在 16 ml（tb，eu）/8 ml（ho）h2o 中；同时，将1mmol lncl3·
6h2o溶解在24 ml（tb，eu）/32 ml（ho）乙二醇中，在反应釜中形成镧系元素储备溶液；a2向该均质储备溶液中加入 1.8 g 聚丙烯酸paa（mw=2000）并搅拌溶解；然后滴加naf溶液，透明溶液变白而混浊；继续反应 60 分钟后，将液体转移到 100 ml 的高压釜中，填充度约为 40%，将反应釜放入烘箱中，200℃反应4小时；a3反应结束后，取出反应釜，自然冷却至室温；然后将溶液转移到离心管中，弃掉上层液体，将沉淀用乙醇和水各洗3次，沉淀重新溶解于10ml水中均匀分散，便于后续实验操作；b．制备镧系纳米粒子-dna的核酸信号报告探针b1 将 60l nalnf4
ꢀ‑
paa 与 0.02g edc 和 0.02g nhs 在 500μl mes 缓冲液中缓慢震荡 1 小时以活化羧酸（-cooh）基团；离心并重新溶解在 500μl hepes 缓冲溶液中，然后将活化后的纳米粒子与1个od的氨基（-nh2）修饰的探针 dna 在室温下孵育12小时过夜反应，然后离心和洗涤以获得 dna 功能化的 nalnf
4 nps；c.生物素化的捕获dna探针和链霉亲和素修饰的磁性微球（sa-mb）的复合c1 对链霉亲和素修饰的磁性微球进行 rna酶（rnase）灭活处理：对于 100 μl 的 10 mg ml-1 sa-mb，用溶液 a 洗涤两次（溶液a: 100 mmol l-1 naoh ，50 mmol l-1 nacl），用溶液 b （溶液b: 100 mmol l-1 nacl）洗涤一次，然后用 b&w 缓冲液（b&w 缓冲液：10 mmol l-1 tris-hcl and 1 mmol l-1 edta，2 mol l-1 nacl ）冲洗，然后再分散在 100 μl 的 b&w 缓冲液中；c2 将 100 μl sa-mb 与 330 μl的2 μmol l-1 生物素修饰的捕获dna capture o、capture r 和 capture e 同时混合；将混合物在 37
°
c 下轻轻摇动孵育 1 小时，通过链霉亲和素和生物素之间的特异性结合将 dna 固定在 sa-mb的表面，获得 mb-capture dna 探针;c3 在磁力架上将反应后的溶液磁性分离，析出上清液，mb-dna 探针用 b&w 缓冲液洗涤，并用 tris-hcl 缓冲液洗涤 3 次，以去除多余的未反应 dna；d．dna杂交反应d1 三组分同时进行的rna夹心杂交体系每样品使用7.5 μl capture dna-mbs， 由于capture o/r/e-mb、目标o/r/e和probe dna-nalnf
4 nps（o/r/e-tb/ho/eu nps）之间的特异性识别，以 mb 作为固相反应基质和分离平台三条核酸链形成了夹心状结构；d2 反应达到完全程度后，使用 200μl 增强剂溶液从形成的结构中释放离子，用于 icpms 定量；使用增强液（b-nta，topo）从纳米粒子中释放 tb
3+
/ho
3+
/eu
3+ 形成b-nta-tb
3+
/ho
3+
/eu
3+-topo 复合物；e．icpms测定e1取50μl消解后的溶液稀释至8ml，并转移至ep管,e2 在icpms中进行 153
eu/
159
tb/
165
ho 元素的定量检测，使用仪器标准std模式,
e3 153
eu/
159
tb/
165
ho的信号强度为标准，对所测得强度代入线性方程计算浓度。2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述方法步骤a所指定的离心洗涤条件为10000rpm，25min，并在离心去除上清液加入洗涤液后辅助以超声使得纳米粒子均匀分散。3.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述方法步骤b对纳米粒子探针制备的条件是：室温过夜反应，现制现用，超声辅助分散的功率和时间保持较小，以免表面的dna产生断裂现象。
技术总结
本发明目的是提供一种基于镧系纳米粒子（LnNPs）的多组分核酸检测方法，对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的三个特征基因位点进行协同检测以改善单一位点检测造成假阴性结果。本发明中的镧系纳米粒子制备方法简单，快速，具有普适性，本发明的原理是：在磁性纳米微球上构建一种基于镧系纳米粒子标记策略用于SARS-CoV-2的多组分核酸检测平台，通过靶向ORF1ab、RdRp和E基因，三种镧系（Tb，Ho，Eu）探针可以通过元素质谱检测同时识别一个样品中的三个位点。该方法利用简单的三明治杂交，通过纳米粒子元素自放大效应，可实现高灵敏的检测。可实现高灵敏的检测。
技术研发人员：吕弋 李紫嫣 刘睿
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2021.08.23
技术公布日：2023/2/23