蝎毒素及其突变体在抗癫痫中的应用

1.本发明涉及多肽药物领域，具体地，涉及抗癫痫的毒素肽蝎毒素(charybdotoxin)及其突变体q18f(chtx-q18f)在抗癫痫中的应用。


背景技术：

2.癫痫(epilepsy)是一种导致短暂的大脑功能障碍的慢性疾病，以大脑神经元突发性异常放电引起反复发作为特征。据估计每年新增加癫痫患者约40万，在中国癫痫已成为神经科仅次于头痛的第二大常见病。
3.癫痫的发病机制非常复杂，然而一般认为，中枢神经系统兴奋与抑制之间的不平衡将导致癫痫发作。
4.基于异常放电的起始部位和传递方式的不同，癫痫的发病因素分为离子通道功能异常、神经递质异常、神经胶质细胞异常等各种不同的因素。离子通道是体内组织兴奋性调节的基础之一。研究表明，钠离子通道、钾离子通道、钙离子通道等通道与癫痫有一定的相关性。
5.针对癫痫多样的发病机制，研究人员发展了各类不同作用机制和不同靶标的抗癫痫药物。苯妥英钠、卡马西平等小分子药物可选择性作用于电压依赖性钠离子通道，阻断钠离子依赖性动作电位的快速发放，达到抗惊厥作用。三甲双酮药物为选择性t型钙离子通道阻断剂，抑制神经元的过度兴奋。吡仑帕奈是一种ampa型谷氨酸受体(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体，介导中枢神经系统快速兴奋性突触传递)拮抗剂，通过抑制突触后ampa受体谷氨酸活性，减少神经元过度兴奋，达到预防和治疗癫痫疾病。
6.然而，目前的癫痫治疗药物的效果还难以令人满意。例如，大多数小分子药物长期服用副作用很大。此外，引起癫痫的病因多种多样，因此目前的小分子药物难以对症下药。
7.因此，本领域迫切需要开发新的特异性高和/或副作用小的、用于预防和/或治疗癫痫的药物。


技术实现要素：

8.本发明的目的就是提供了特异性高和/或副作用小的、用于预防和/或治疗癫痫的药物及其应用。
9.本发明的第一方面，提供了一种蝎毒素(charybdotoxin)及其活性片段、或其药学上可接受的盐的用途，用于制备一制剂或药物组合物，所述制剂或药物组合物用于治疗和/或预防癫痫，
10.其中，所述蝎毒素包括具有如seq id no:1所示的氨基酸序列的野生型蝎毒素或其突变体，所述突变体包括野生型蝎毒素的第18位谷氨酸点突变所形成的突变体。
11.在另一优选例中，所述突变体选自下组：chtx-q18f、chtx-q18y、chtx-q18h、chtx-q18v或chtx-q18l。
12.在另一优选例中，所述突变体包括将野生型蝎毒素的第18位谷氨酸突变为苯丙氨
酸所形成的突变体chtx-q18f。
13.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括重组的或人工合成的chtx-q18f多肽。
14.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括如seq id no:2所示的氨基酸序列。
15.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括在保持蛋白活性范围内，在序列seq id no:2的基础上进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。
16.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括在保持蛋白活性范围内，在序列seq id no:1的n端或c端进行一个或多个氨基酸的插入，所述插入的氨基酸残基个数包括1个至10个，较佳地1个至5个，更佳地1个至3个。
17.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括在序列seq id no:2的基础上保留活性位点氨基酸phe18而进一步改变所得到的氨基酸序列。
18.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括在保持蛋白活性范围内，在序列seq id no:2的n端或c端带有一个或多个蛋白标签的重组蛋白。
19.在另一优选例中，所述蛋白标签选自下组：mbp标签、his标签、gst标签、sumo标签、trx标签、ha标签、flag标签、nusa标签、或其组合。
20.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括如seq id no:2所示的氨基酸序列。
21.在另一优选例中，所述chtx-q18f多肽包括在保持蛋白活性范围内，在序列seq id no:2的n端或c端进行一个或多个氨基酸的插入，所述插入的氨基酸残基个数包括1个至10个，较佳地1个至5个，更佳地1个至3个。
22.在另一优选例中，所述的chtx-q18f是重组的。
23.在另一优选例中，所述的chtx-q18f是大肠杆菌中重组表达的。
24.在另一优选例中，所述的重组chtx-q18f的氨基酸序列如seq id no:3所示。
25.在另一优选例中，所述的制剂或药物组合物包含：组分(a)蝎毒素(charybdotoxin)及其活性片段、或其药学上可接受的盐，以及组分(b)药学上可接受的载体，
26.其中，所述蝎毒素包括具有如seq id no:1所示的氨基酸序列的野生型蝎毒素或其突变体，所述突变体包括野生型蝎毒素的第18位谷氨酸点突变所形成的突变体。
27.在另一优选例中，所述突变体选自下组：chtx-q18f、chtx-q18y、chtx-q18h、chtx-q18v或chtx-q18l。
28.在另一优选例中，所述的制剂或药物组合物包含：chtx-q18f，以及药学上可接受的载体。
29.在另一优选例中，所述组分(a)占所述制剂或药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。
30.在另一优选例中，所述药学上可接受的载体选自下组：输液剂载体和/或注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。
31.在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。
32.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂、或外用药物剂型。
33.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括注射剂或冻干制剂。
34.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
35.在另一优选例中，所述药物组合物通过静脉内、皮下、肌内或颅内途径给药。
36.在另一优选例中，所述药物组合物通过微量输液泵(microinfusion pumps)进行施用。
37.在另一优选例中，所述药物组合物通过颅内给药进行施用，较佳地通过侧脑室注射(intracerebroventricular(icv)delivery)入受试者体内。
38.在另一优选例中，所述受试者包括：哺乳动物。
39.在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
40.在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)。
41.在另一优选例中，所述制剂或药物组合物可单独施用，或联合施用。
42.在另一优选例中，所述的联合施用包括：与治疗和/或预防癫痫的其它治疗药物联合施用。
43.在另一优选例中，所述与治疗和/或预防癫痫的其它治疗药物选自下组：卡马西平、氟吡啶、加巴喷丁、拉莫三嗪、奥卡西平、苯妥英、苯妥英钠、瑞替加滨、托吡酯、颠扑净、乙琥胺、丙戊酸钠、或其组合。
44.在另一优选例中，所述的癫痫包括大脑皮层兴奋性增强所导致的癫痫(或神经元异常兴奋型癫痫)。
45.在另一优选例中，所述癫痫具有以下特征：大电导钙离子和电压激活的钾离子通道的活性增强，从而导致大脑皮层的兴奋性增强。
46.在另一优选例中，所述的癫痫包括人和非人哺乳动物(如啮齿动物)的癫痫。
47.在另一优选例中，所述的癫痫包括ptz诱导型癫痫，尤其是大鼠的ptz诱导型癫痫。
48.在另一优选例中，所述的癫痫包括难治性癫痫。
49.本发明的第二方面，提供了一种蝎毒素突变体多肽，所述突变体包括将具有如seq id no:1所示的氨基酸序列的野生型蝎毒素的第18位谷氨酸点突变所形成的突变体。
50.在另一优选例中，所述突变体选择下组：chtx-q18f、chtx-q18y、chtx-q18h、chtx-q18v或chtx-q18l。
51.在另一优选例中，所述突变体包括将野生型蝎毒素的第18位谷氨酸突变为苯丙氨酸所形成的突变体chtx-q18f。
52.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括如seq id no:2所示的氨基酸序列。
53.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括在保持蛋白活性范围内，在序列seqid no:2的基础上进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。
54.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括在保持蛋白活性范围内，在序列seqid no:1的n端或c端进行一个或多个氨基酸的插入，所述插入的氨基酸残基个数包括1个至10个，较佳地1个至5个，更佳地1个至3个。
55.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括在序列seq id no:2的基础上保留活性位点氨基酸phe18而进一步改变所得到的氨基酸序列。
56.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括在保持蛋白活性范围内，在序列seq id no:2的n端或c端带有一个或多个蛋白标签的重组蛋白。
57.在另一优选例中，所述蛋白标签选自下组：mbp标签、his标签、gst标签、sumo标签、trx标签、ha标签、flag标签、nusa标签、或其组合。
58.在另一优选例中，所述的chtx-q18f包括如seq id no:2所示的氨基酸序列。
59.在另一优选例中，所述chtx-q18f多肽包括在保持蛋白活性范围内，在序列seq id no:2的n端或c端进行一个或多个氨基酸的插入，所述插入的氨基酸残基个数包括1个至10个，较佳地1个至5个，更佳地1个至3个。
60.在另一优选例中，所述的chtx-q18f是重组的。
61.在另一优选例中，所述的chtx-q18f是大肠杆菌中重组表达的。
62.在另一优选例中，所述的重组chtx-q18f的氨基酸序列如seq id no:3所示。
63.本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第二方面所述的蝎毒素突变体多肽。
64.在另一优选例中，所述多核苷酸的序列如seq id no:4所示。
65.本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明第三方面所述的多核苷酸。
66.在另一优选例中，所述表达载体包括真核表达载体、原核表达载体或病毒载体。
67.本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第四方面所述的表达载体，或基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。
68.在另一优选例中，所述宿主细胞包括真核细胞或原核细胞。
69.本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
70.(i)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有第一活性成分(z1)本发明第二方面所述的蝎毒素突变体多肽或其活性片段，和药学上可接受的载体；
71.(ii)第二药物组合物，所述的第二药物组合物含有第二活性成分(z2)其他的或额外的治疗和/或预防癫痫的药物活性成分，和药学上可接受的载体。
72.在另一优选例中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物是同一组合物或不同的组合物。
73.在另一优选例中，所述的药物组合物包含：
74.(a)第一活性成分，所述第一活性成分为chtx-q18f或其活性片段；
75.(b)第二活性成分，所述第二活性成分为其他的或额外的治疗和/或癫痫的药物活性成分；以及
76.(c)药学上可接受的载体。
77.在另一优选例中，所述其他的或额外的治疗和/或预防癫痫的药物活性成分包括：卡马西平、氟吡啶、加巴喷丁、拉莫三嗪、奥卡西平、苯妥英、苯妥英钠、瑞替加滨、托吡酯、颠扑净、乙琥胺、丙戊酸钠、或其组合。
78.本发明的第七方面，提供了一种药盒，所述药盒包括：
79.(c1)第一容器，以及位于所述第一容器中第一药物组合物，所述第一药物组合物含有第一活性成分(z1)本发明第二方面所述的蝎毒素突变体多肽或其活性片段，和药学上可接受的载体；和
80.(c2)第二容器，以及位于所述第二容器中第二药物组合物，所述的第二药物组合物含有第二活性成分(z2)其他的或额外的治疗和/或预防癫痫的药物活性成分，和药学上
可接受的载体。
81.在另一优选例中，所述的药盒还包括(iii)说明书。
82.在另一优选例中，所述第一活性成分(z1)为chtx-q18f或其活性片段，和药学上可接受的载体。
83.在另一优选例中，所述第二活性成分(z2)包括：卡马西平、氟吡啶、加巴喷丁、拉莫三嗪、奥卡西平、苯妥英、苯妥英钠、瑞替加滨、托吡酯、颠扑净、乙琥胺、丙戊酸钠、或其组合。
84.在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同或不同的容器。
85.在另一优选例中，所述的第一容器中的第一药物组合物是含chtx-q18f或其活性片段的单方制剂。
86.在另一优选例中，所述的第二容器中的药物组合物是含其他的或额外的治疗和/或预防癫痫的药物活性成分的单方制剂。
87.在另一优选例中，所述说明书中记载了给予第一活性成分(z1)和任选的第二活性成分(z2)从而治疗和/或预防癫痫的说明。
88.在另一优选例中，所述说明书中记载了所述第一药物组合物和任选地第二药物组合物的剂型为注射剂。
89.在另一优选例中，所述注射剂通过(icv)侧脑室注射入受试者体内。
90.本发明的第八方面，提供了一种治疗和/或预防癫痫的方法，包括给需要的受试者施用本发明第二方面所述的蝎毒素突变体多肽或本发明第六方面所述的药物组合物。
91.在另一优选例中，所述受试者为人类或非人类哺乳动物。
92.在另一优选例中，所述受试者患有或疑似患有癫痫。
93.在另一优选例中，所述的癫痫包括大脑皮层兴奋性增强所导致的癫痫(或神经元异常兴奋型癫痫)。
94.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
95.图1显示了大鼠脑图谱。
96.图2显示了毒素肽chtx、chtx-q18f及chtx-t23f对ptz诱导的注射同侧(a)和异侧(b)海马的c-fos表达抑制效果。(a-d)分别代表注射同侧海马的生理盐水对照组和chtx,chtx-q18f及chtx-t23f实验组。(a1-d1)代表ca1区，(a2-d2)代表ca3区，(a3-d3)代表dg区。(c)表示注射毒素肽(n＝3)同侧海马的c-fos柱状统计图。(f-i)分别代表注射异侧海马的生理盐水对照组和chtx,chtx-q18f及chtx-t23f实验组。(f1-i1)代表ca1区，(f2-i2)代表ca3区，(f3-i3)代表dg区。(d)表示注射毒素肽(n＝3)异侧海马的c-fos柱状统计图。与生理盐水组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001(one-way anova)。与chtx组相比，
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p《0.001(one-way anova)。
97.图3显示了海马同侧(a)和异侧(b)注射毒素肽chtx、chtx-q18f及chtx-t23f后，显微尼氏体染色结果显示ptz诱导的癫痫大鼠海马组织的完整性。(a-d)分别代表注射同侧海
马的生理盐水对照组和chtx,chtx-q18f及chtx-t23f实验组。(a1-d1)代表ca1区，(a2-d2)代表ca3区，(a3-d3)代表dg区。(c)表示注射异侧海马的c-fos柱状统计图。(f-i)分别代表注射异侧海马的生理盐水对照组和chtx,chtx-q18f及chtx-t23f实验组。(f1-i1)代表ca1区，(f2-i2)代表ca3区，(f3-i3)代表dg区。(d)表示注射毒素肽(n＝3)异侧海马的c-fos柱状统计图。与生理盐水组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001(one-way anova)。与chtx组相比，
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p《0.05，
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p《0.001(one-way anova)。
98.图4显示了毒素肽chtx、chtx-q18f及chtx-t23f对海马锥体神经元放电特性的影响。(a)使用电流钳诱导ptz预处理的神经元产生动作电位，生理盐水组(黑色)，chtx组(红色),chtx-q18f组(蓝色)，chtx-t23f组(洋红色)。(b)不同电流注入下的动作电位数量。(c)300pa电流注入下的动作电位宽度。(d)300pa电流注入下从后超极化之后尖峰前电压到峰值的快速后超极化(fahp)振幅。(e)300pa电流注入下的后超极化失活时间常数。(f)300pa电流注入下第6-7个尖峰间隔。与生理盐水组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001；与chtx组相比，
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p《0.001(one-way anova)。
99.图5显示了毒素肽chtx、chtx-q18f及chtx-t23f对ptz诱导的致全身性强直阵挛发作lfp谱特征和psd的调控。(a)分别代表注射生理盐水对照组、chtx、chtx-q18f及chtx-t23f毒素及vpa实验组的lfp信号和光谱热图的代表性癫痫发作鼠治疗效果。(b)分别代表注射生理盐水对照组、chtx,chtx-q18f及chtx-t23f毒素及vpa实验组的ptz诱导的癫痫发作鼠的光谱图和累积分布曲线。(c)分别代表注射生理盐水对照组、chtx,chtx-q18f及chtx-t23f毒素及vpa后ptz诱发癫痫组波谱分析及各药物组δ、θ、α、β、γ波的psd值(n＝4)。
具体实施方式
100.本发明人经过广泛而深入的研究，通过对大量不同化合物的筛选(包括针对钠离子通道等化合物的大量筛选)，首次意外地发现一种多肽物质蝎毒素，尤其是其突变体(即chtx-q18f)可用于极其有效地治疗和/或预防癫痫。实验表明，在大鼠ptz(pentetrazol)惊厥模型中，本发明人通过测定多肽chtx-q18f对复发惊厥行为的影响、对大鼠惊厥发作后海马c-fos表达的影响以及对海马神经元损伤情况的考察，首次发现蝎毒素及其突变体chtx-q18f可有效缓解癫痫症状。在此基础上完成了本发明。
101.蝎毒素(charybdotoxin)及其突变体
102.如本文所用，术语“charybdotoxin q18f蛋白”、“charybdotoxin多肽突变体q18f”、“chtx毒素突变体q18f”和“chtx多肽突变体q18f”“重组chtx毒素q18f”、“蝎子毒素突变体q18f”、“chtx-q18f蛋白”、“多肽chtx-q18f”、“毒素肽chtx-q18f”等可互换使用，均指charybdotoxin蛋白突变体q18f。charybdotoxin蛋白突变体q18f由37个氨基酸构成，具有三对二硫键，是一种短链多肽毒素。在本发明中，所述术语不仅包括化学合成的charybdotoxin蛋白突变体q18f(chtx-q18f)，也包括重组的chtx-q18f，例如重组表达的带有或不带有起始met的charybdotoxin q18f蛋白，以及重组表达的带有或不带有表达标签或酶切残留的1-3个氨基酸的charybdotoxin蛋白突变体q18f。
103.天然野生型charybdotoxin可从北非蝎(leiurus quinquestratus)毒液中分离纯化得到，是bk通道第一个阻断剂，不具有靶向bk(α+β4)通道的抗癫痫活性。本发明的毒素肽chtx-q18f难以通过天然分离得到，但可以通过化学合成(包括固相合作)或重组技术得到。
104.对于重组而言，可通过常规的重组技术，在大肠杆菌等宿主细胞中进行表达，并经分离纯化而获得。
105.野生型charybdotoxin的氨基酸序列如seq id no:1所示：
106.eftnvscttskecwsvcqrl hntsrgkcmnkkcrcys(seq id no:1)。
107.毒素肽chtx-q18f的氨基酸序列如seq id no:2所示：
108.eftnvscttskecwsvcfrl hntsrgkcmnkkcrcys(seq id no:2)。
109.一种重组的chtx-q18f氨基酸序列如seq id no:3所示：
110.gseftnvscttskecwsvcfrlhntsrgkcmnkkcrcys(seq id no:3)。
111.编码chtx-q18f蛋白氨基酸序列seq id no:1的核酸序列如seq id no:4所示。
112.gagttcaccaacgttagctgcaccacgagtaaagaatgctggagcgtgtgctttcgtttgcataatacttctcgcggtaagtgcatgaacaagaagtgccgctgctatagc(seq id no:4)。
113.本发明通过实验首次证实，在大鼠ptz惊厥模型中，蝎毒素突变体chtx-q18f可极其显著地预防性地和治疗性地缓解神经元的异常兴奋和癫痫症状，因此作为治疗癫痫症状的新型多肽药物。
114.应理解，尽管本发明的实例中提供的多肽chtx-q18f的野生型来源于北非蝎，但是来源于其它类似的物种(尤其是与北非蝎属于同一科或属的蝎类)的、与本发明的序列(优选地，序列如seq id no:2所示)具有一定同源性(保守性)的chtx-q18f多肽突变体也可用于本发明。
115.应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于北非蝎，但是来源于其它类似的物种(尤其是与北非蝎属于同一科或属的蝎类)的、与本发明的序列(优选地，序列如seq id no:2所示)具有一定同源性(保守性)的chtx-q18f的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本技术后根据本技术提供的信息可以方便地从其它物种(尤其是蝎类)中分离得到该序列。
116.本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括：dna、基因组dna或人工合成的dna，dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区核甘酸序列可以与seq id no:4所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。
117.编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
118.术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
119.本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2
×
ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酞胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以
上，更好是95％以上时才发生杂交。
120.应理解，虽然本发明的chtx-q18f基因的野生型优选来自北非蝎再经过单点突变而来，但是来自其它物种(尤其是蝎类)的与北非蝎chtx基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如blast。
121.本发明的chtx-q18f核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的dna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
122.此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
123.本发明涉及一种用于治疗癫痫的多肽chtx-q18f，在本发明的一个优选例中，所述多肽的氨基酸序列如seq id no:2所示。本发明的多肽能够有效治疗和/或预防癫痫。
124.本发明还包括与本发明的seq id no:2所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。
125.所述“相同或相似功能”主要是指：“缓解癫痫的症状”。
126.本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
127.本发明还包括具有chtx-q18f多肽活性的chtx-q18f多肽片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的chtx-q18f多肽相同的生物学功能或活性的多肽。
128.本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
129.本发明中，所述的多肽变体是如seq id no:2所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-10个，较佳地1-8个，更佳地1-4个，最佳地1-2个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸
所得的衍生序列，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内，更佳地为3个以内)氨基酸(例如seq id no:3所示的氨基酸序列)。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在c末端和/或n末端添加一个或数个(如1-3个)氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。
130.表1
131.最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu
132.本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与seq id no:2差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述列举的代表性的蛋白。
133.修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。
134.药物组合物及其施用方法
135.本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：毒素肽chtx-q18f或其活性片段和其治疗和/或预防癫痫的药物活性成分。
136.如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
137.如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
138.本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
139.本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
140.本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
141.本发明所提供的第一活性活性成分(a)chtx-q18f或其活性片段，可与第二活性成分(b)其他治疗和/或预防癫痫的药物联用。其中所述的第二活性成分(b)为现有技术中已经可用的抗癫痫药物，其包括但不限于：卡马西平、氟吡啶、加巴喷丁、拉莫三嗪、奥卡西平、苯妥英、苯妥英钠、瑞替加滨、托吡酯、颠扑净、乙琥胺、丙戊酸钠、或其组合。
142.c-fos基因
143.c-fos基因是即刻早期基因[trends neurosci.1995,18,66-67](iegs，能被第二信使所诱导的原癌基因)的一种，它与癫痫发病后的多种病理生理过程息息相关。在生理情况下，c-fos基因在中枢神经系统低水平表达；而当神经元受到物理或化学等刺激后，神经元兴奋激活了c-fos等iegs，iegs转录生成的mrna翻译生成c-fos蛋白[annu.rev.neurosci.1991,14,421-451]等。该蛋白可调节多种迟反应基因(lrgs)的表达，同时通过多种机制导致癫痫发作，最终导致癫痫病灶的形成[neuron1990,4,477-485]。c-fos蛋白在癫痫发作时迅速大量表达，若使用药物或其他治疗手段控制癫痫发作，则可明显抑制该蛋白的表达，因此c-fos的表达测定可作为抗癫痫药物的作用机制以及疗效评价的有效指标。
[0144]
尼氏体
[0145]
尼氏体是在神经元树突的细胞质中发现的一种特殊的易染物质。通常尼氏体具有固定形状，神经元细胞体较大，胞浆颜色呈苍白色且染色均匀，细胞核大而圆，所有细胞染色呈深染。在海马齿状回(dg)区域神经锥体细胞排列紧密，细胞为4层或5层。但当脑部受到
损伤时它们的形态会发生变化，细胞边缘发生模糊降低了细胞的完整性，同时细胞体染色变浅，神经元分布变紊乱，细胞数目或细胞层数变少。因此神经元的存在、分布以及病理变化可以通过尼氏体的形态和数目进行识别。
[0146]
ptz(pentylenetetrazole，即戊四唑)
[0147]
戊四唑(ptz)，别名戊四氮(pentetrazol)、五甲烯四氮唑、卡地阿唑，是一种白色结晶粉末的化学品。化学名称为1,5-五亚甲基-1h-四唑，分子式为c6h
10
n4，分子量为138.1704。戊四氮为中枢兴奋药，临床上主要用于解救严重的巴比土酸盐类及麻醉药中毒所引起的中枢性呼吸衰竭；也可用于急性传染病、麻醉药及巴比妥类药物中毒时引起的呼吸抑制、急性循环衰竭。
[0148]
戊四氮能兴奋呼吸中枢和心血管运动中枢，其作用迅速而强烈，使呼吸加深加快，血压微升；剂量稍大，兴奋可扩展到大脑皮质和脊髓，引起惊厥。
[0149]
ptz主要作用于gabaa受体(γ-氨基丁酸a型受体)的氯离子通道，抑制gaba神经元活动，从而使神经系统兴奋性过度增强，诱发动物和人的阵挛性或全身强直性癫痫发作。ptz诱导的啮齿类动物惊厥发作模型已被广泛应用于癫痫发生机制和新型抗癫痫药物的研究。
[0150]
在本发明中，通过对动物进行腹腔注射ptz来诱导其发生惊厥/癫痫，以进行后续的本发明chtx-q18f毒素肽对癫痫的效应的实验研究。
[0151]
本发明的主要优点包括：
[0152]
(1)chtx-q18f具有作用强、用量小(在大鼠ptz模型中用量可低至0.32μg/kg)的特点，不仅显著延长惊厥发作的潜伏期，还可显著缓解癫痫的症状(尤其是可显著降低3级、4级和5级癫痫的发病率)，因此可作为癫痫治疗的新型多肽药物。
[0153]
(2)本发明的重组chtx-q18f可经原核表达、重组制备，有望为癫痫患者提供一种安全、有效、且价廉的抗癫痫药物。
[0154]
(3)chtx-q18f是一种分子量很小(仅约4kda)的神经毒素，可有效透过血脑屏障作用于脑部。
[0155]
(4)chtx-q18f是一种高特异性的神经毒素，对α+β4亚型的bk钾离子通道大电导钙离子和电压激活的钾离子通道具有选择性，而对心血管、内分泌以及生殖系统等无影响，因此副作用小。
[0156]
(5)chtx-q18f是首次经实验证实具有缓解癫痫功效的多肽类物质之一。
[0157]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0158]
如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。
[0159]
实验材料与方法
[0160]
实验动物和药品
[0161]
实验动物：成年雄性sd大鼠(中国科学院上海实验动物中心提供)，体重250-300g，每笼5只，实验室常规条件下饲养，室温维持在22
±
1℃，自然昼夜节律。
[0162]
相关药品：重组的北非蝎毒素chtx-q18f的表达纯化参见制备实施例1。
[0163]
戊四氮(ptz，cas：54-95-5)，购于美国sigma公司。
[0164]
动物手术
[0165]
经10％的水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后，大鼠固定于立体定位仪上(ns-2，narishige,japan)，剃去头顶毛发并消毒头皮，剪开皮肤并用10％双氧水烧灼皮下组织，暴露颅骨bregma点，根据大鼠脑定位图谱在颅骨上确定给药基座植入点(ap-4.3mm、l 2.2mm)。位置确定后，用牙科钻钻一小孔(1mm)，剥净内板，针尖挑开硬脑膜，将给药基座套管植入至颅骨下2.5mm的海马ca1区。基座通过牙科水泥固定于大鼠颅骨表面。
[0166]
制备实施例1
[0167]
采用人工合成方法，分别合成、表达his-mbp-thrombin位点chtx、chtx-q18f及chtx-t23f融合蛋白的dna序列，经nco i和not i酶切后，与相同酶切的petduet-1质粒进行连接，从而获得重组质粒petduet-1-chtx、petduet-1-q18f、petduet-1-t23f将其转化入e.coli origami b(de3)表达菌株中进行原核表达。
[0168]
经重组表达，获得融合蛋白，用以下方法制备毒素肽chtx及其突变体chtx-q18f及chtx-t23f多肽。
[0169]
具体纯化方法步骤如下：
[0170]
(1)处于buffer a环境中的融合蛋白先与镍柱结合，然后用buffer b咪唑盐溶液进行梯度洗脱除去大部分杂蛋白，完成第一根亲和柱纯化并进行sds-page电泳检测。
[0171]
(2)收集目的融合蛋白于18℃、2l buffer c中进行透析酶切，按照6u/ml加入thrombin酶，于3.5kda透析袋中搅拌酶切过夜。
[0172]
(3)随后用恒流泵将酶切混合物加载至amylose resin层析柱上，收集穿流成分(fl)和buffer d洗脱成分。his-mbp-tag经buffer e洗脱除去，完成第二根亲和柱纯化并进行sds-page电泳检测。
[0173]
(4)然后将fl成分和buffer d洗涤液(通常含有少量重组chtx、chtx-q18f或chtx-t23f毒素)浓缩至2ml进行下一步凝胶色谱柱纯化。
[0174]
(5)凝胶色谱柱superdex 75提前用buffer f平衡，然后将样品加载到柱子上，用buffer f进行洗脱。收集保留体积为110ml左右的洗脱峰即为重组chtx、chtx-q18f或chtx-t23f样品，之前的吸收峰为mbp-tag或未切开的融合蛋白。即得到高纯度的chtx、chtx-q18f或chtx-t23f。
[0175]
纯化过程中的相关缓冲液组分如表2所示。
[0176]
表2重组chtx-q18f毒素纯化过程中的相关缓冲液
[0177]
[0178]
实施例1：chtx-q18f对大鼠ptz复发惊厥行为的影响
[0179]
1.1实验步骤
[0180]
将成年雄性sd大鼠放置于一个40
×
30
×
50cm的透明玻璃盒内，观察给药后的惊厥反应。药物注射前，大鼠提前1h放置于盒中，自由活动以适应环境，然后于腹腔注射ptz(60mg/kg)诱发大鼠惊厥发作。实验分为毒素注射组和生理盐水空白对照组。
[0181]
chtx毒素及其突变体chtx-q18f、chtx-t23f注射组：腹腔注射一次ptz诱导发作后，第二天在大脑海马内注射chtx-q18f毒素(溶于2μl生理盐水中)，然后再进行ptz注射。毒素剂量为0.08μg，n＝7-8(n为实验大鼠数目)；
[0182]
生理盐水空白对照组：腹腔注射一次ptz诱导癫痫发作后，1天后于大脑海马内注射等量生理盐水，然后再进行ptz注射，n＝6。
[0183]
实验过程中采用“双盲法”加药和行为学观察，以减少人为误差。以大鼠在ptz注射后2h内惊厥发作的潜伏期、死亡率、不同惊厥发作严重程度下的持续时间和发作次数为统计指标进行测定。大鼠的惊厥发作严重程度根据以下标准[neurophysiol.1972,32,281-294；brain res.1997,758,92-98]进行评级：
[0184]
0级：无反应；
[0185]
1级：嘴部和面部节律性抽动；
[0186]
2级：躯体波动样游走性痉挛；
[0187]
3级：全身肌阵挛、臀部上翘；
[0188]
4级：躯体向一侧翻转；
[0189]
5级：仰翻位，全身强直痉挛发作。
[0190]
一次完整的惊厥发作定义为从惊厥开始发作至惊厥后恢复正常，惊厥发作间隔时间达到5s以上时，定义为另一次独立的惊厥发作。潜伏期定义为注射ptz后至首次2级惊厥发作开始的时间。
[0191]
1.2实验结果
[0192]
与生理盐水空白对照组相比，考察了毒素chtx、chtx-q18f及chtx-t23f对大鼠ptz复发惊厥行为的调控作用，实验结果如表2所示。
[0193]
表2 chtx-q18f在2h内对ptz复发惊厥行为的抑制效果
[0194][0195]
通过单因子变异数分析(one-way anova)，相比于生理盐水对照组，chtx-q18f组在潜伏期、发作持续时间和次数上有显著性差异，*p《0.05，**p《0.01,***p《0.001。
[0196]
由表2可知：
[0197]
(1)chtx-q18f组与空白对照组相比，能够显著延长惊厥复发的潜伏期(chtx-q18f组的潜伏期为340.73
±
49.77s，n＝11，***p《0.001；生理盐水组为103.56
±
7.90s，n＝9)，延长了229％(329％-1＝229％)。
[0198]
(2)chtx-q18f也显著降低了癫痫持续时间(持续时间为223.27
±
35.99s，n＝11，**p《0.01；生理盐水组为429.80
±
65.19s，n＝9)，下降达48％(1-52％＝48％)。
[0199]
(3)在癫痫发作次数方面，chtx-q18f可显著降低各种级别的惊厥发作程度，尤其是3级、4级和5级的惊厥。0.08μg的q18f毒素显著降低了惊厥大发作(4级&5级)的次数(chtx-q18f组为1.18
±
0.26次，n＝11，*p《0.05；生理盐水组为2.17
±
0.40次，n＝9)，下降幅度达46％(100％-54％＝46％)。在3级发作次数方面，与生理盐水组相比chtx-q18f组的次数也同样显著降低(*p《0.05)，下降幅度达46％(100％-54％＝46％)。
[0200]
因此，本发明的chtx-q18f在惊厥发作的潜伏期、持续时间和不同惊厥发作严重程度下的发作次数都体现出显著的抑制效果，说明chtx-q18f有效缓解神经元的异常兴奋和癫痫症状。
[0201]
实施例2：chtx-q18f对大鼠惊厥发作后海马c-fos表达的影响
[0202]
2.1实验步骤
[0203]
在ptz诱发的癫痫持续状态行为实验结束后，动物通过腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg)进行麻醉。以200ml生理盐水经左心室升主动脉灌注冲洗净血管，然后用400ml固定液(含40％多聚甲醛的0.1m pbs，ph7.4，4℃)灌注1-2h，取出脑组织于同一固定液中过夜后，移至20％蔗糖溶液中浸泡直至沉于容器底部，再浸入30％的蔗糖溶液中直至沉于容器底部。
[0204]
将大鼠的脑组织用恒冷箱切片机(leica 1900，germany)对海马区进行切片，片厚
20μm，贴于经明胶-硫酸铬钾处理的载玻片上，置于-20℃冻存备用。c-fos免疫组化按步骤如下：
[0205]
(1)从-20℃冰箱中取出切片，回温30min，在切片四周用组化笔画框，晾干；
[0206]
(2)在1％triton-x溶液中加入1％的h2o2，将切片浸泡破膜30min；
[0207]
(3)在0.01m pbs(ph7.4)缓冲液中冲洗3次，每次5min；
[0208]
(4)用5％goat serum 37℃封闭1h；
[0209]
(5)用滤纸将血清吸干，加兔抗c-fos抗体(1：400，sc-52，santa cruz，usa)，抗体用0.01m pbs稀释，每张切片约100μl，置于湿盒中4℃下孵育48h；
[0210]
(6)0.01m pbs(ph7.4)冲洗10min，重复3遍；
[0211]
(7)加用0.01m pbs稀释的生物素标记羊抗兔igg(1：200)，常温2h；
[0212]
(8)0.01m pbs冲洗10min，重复3遍。加入abc复合物(配置比例为a：b：pbs＝1:1:100)，常温2h；
[0213]
(9)0.01m pbs(ph 7.4)冲洗10min，重复3遍；
[0214]
(10)dab-硫酸镍胺-葡萄糖氧化酶法(dab,生工生物)避光染色10min；
[0215]
(11)脱水，用70％、80％、95％、100％(
×
2)酒精脱水，每次5min，再用二甲苯浸泡2次，每次5min；
[0216]
(12)用中性树胶封片保存，并在显微镜下观察c-fos的表达。
[0217]
统计海马不同分区(ca1、ca3)及齿状回(dg)上c-fos免疫反应阳性(c-fos-like immunoreactive,fli)神经元的数目，对行为考察的两个动物分组(每组均为6只动物)随机取6～8张切片进行不同分区的fli计数(注射毒素或生理盐水的同侧和异侧分别统计)，最后取其平均值。c-fos表达的抑制率按以下公式进行计算。
[0218]
抑制率(innibitory ratio)＝(a-b)/a
×
100％
[0219]
式中a表示生理盐水对照组的fli神经元数目；b表示海马对应区域的chtx-q18f毒素注射组的fli神经元数。
[0220]
2.2实验结果
[0221]
大鼠的海马根据细胞形态的不同可分为海马回和齿状回(dentate gyrus,dg)两部分。海马回主要包括ca1(cornu ammonis)、ca2、ca3区和门区，主要由一些锥体神经元组成，其中ca1区与下托相连接，门区与齿状回相邻。齿状回是海马裂和海马伞之间形如齿状的皮质层，呈c形。其结构分为三层：分子层、颗粒细胞层和多形层，基本由颗粒细胞构成。具体位置参见图1。
[0222]
按照上述实验步骤和数据处理的方法进行了大鼠癫痫发作后海马内c-fos表达的测定，实验结果参见附图2。
[0223]
分析结果如下：
[0224]
(1)在ptz诱发癫痫持续状态行为实验后，所有动物包括生理盐水对照组和毒素注射组均在注射点的同侧和异侧海马显示c-fos蛋白表达，参见图2；
[0225]
(2)在生理盐水对照组，c-fos阳性神经元主要集中于海马dg区的颗粒细胞层，其ca1和ca3区的阳性神经元较少；
[0226]
(3)chtx-q18f对ptz诱发的海马c-fos的表达具有明显抑制效果。与生理盐水对照组相比，chtx-q18f对注射同侧海马的ca1、ca3和dg区的抑制率分别为82.68％、69.41％、
53.49％，参见图2；且对同侧海马c-fos表达抑制效应比异侧海马更强(与生理盐水对照组相比，chtx-q18f对异侧海马的ca1、ca3和dg区的抑制率分别为78.76％、74.27％、39.80％)，参见图2。
[0227]
因此，chtx-q18f对ptz诱发癫痫后大鼠海马的c-fos蛋白表达具有显著的抑制效果，且注射同侧效果强于异侧海马，说明本发明的chtx-q18f毒素可能具备抗癫痫药效。
[0228]
实施例3：大鼠惊厥发作后对海马神经元损伤情况的考察
[0229]
3.1实验步骤
[0230]
(1)从-20℃冰箱中取出切片，回温20min，在切片四周用组化笔画框，晾干；
[0231]
(2)将切片经蒸馏水浸泡2min；
[0232]
(3)将尼式染色液(碧云天购买)滴在脑片上，于37℃水浴锅中染色10min；
[0233]
(4)用蒸馏水洗涤两次，每次10s；
[0234]
(5)切片经70％、80％、95％、100％的酒精脱水，每次2min，再用二甲苯浸泡透明2次，每次5min；
[0235]
(6)用中性树胶封片保存，并在显微镜下观察尼式体染色。
[0236]
对行为考察的以上两个动物分组(每组均为6只动物)随机取6～8张切片进行不同海马分区(ca1、ca3和dg区)的神经元细胞计数，最后取其平均值，并计算神经元数目的上升率。
[0237]
3.2实验结果
[0238]
通过尼氏染色实验对大鼠ptz诱发癫痫后海马神经元的损伤或死亡情况进行了测定，实验结果参见附图3。
[0239]
分析结果如下：
[0240]
(1)chtx-q18f组保留了较为完整的海马结构，海马区神经元尤其是dg区细胞密度最高且排列紧密，尼式体染色最深。与之对比的生理盐水组神经元排列变得疏松，细胞密度减小，染色最浅，说明ptz诱发癫痫后对生理盐水对照组神经元的损伤最大，而本发明的chtx-q18f毒素保护了癫痫后的海马神经元，损伤最小；
[0241]
(2)chtx-q18f组与生理盐水组在注射同侧海马的ca1、ca3和dg区神经元的上升率分别为：213.90％、220.22％、273.16％，参见附图3；对异侧海马ca1、ca3和dg区神经元的上升率分别为：114.29％、113.66％、136.41％，参见图3，说明chtx-q18f对注射同侧海马神经元的保护作用强于异侧海马。
[0242]
综上所述，ptz诱发癫痫持续状态后将导致大鼠海马神经元的损伤或死亡。经测定发现注射chtx-q18f实验组神经元的损伤程度大大降低，尼式染色的神经元数目最多，排列最紧密。
[0243]
以上实验共同表明本发明的chtx-q18f在行为上可抑制大鼠惊厥发作，同时抑制了海马内c-fos的表达，降低了海马神经元的损伤程度，说明本发明的chtx-q18f具有抗癫痫药效。
[0244]
实施例4：对大鼠海马神经元动作电位的考察
[0245]
4.1实验步骤
[0246]
(1)在24孔板中放好载玻片，用多聚赖氨酸(0.01mg/ml，pdl)包被，第二天吸去pdl并用无菌pbs清洗两次后置于超净工作台中晾干。
[0247]
(2)将孕鼠麻醉取出胎鼠，用眼科弯头镊子在眼睛位置固定头部，另取一弯头镊子撕去皮肤，暴露头骨。以弹簧剪沿头骨中线剪开，用弯头摄再撕去头骨暴露大脑。用镊子将脑整个挑出至预冷的dmem培养基中，小心分离海马组织。
[0248]
(3)收集组织用眼科剪将其剪成约1mm的组织块，小心吸去dmem，加入0.25％胰酶置于37℃培养箱中消化10min，每3min上下混匀一次。消化结束以后，取出离心管，加入预冷的含10％fbs的dmem培养基终止消化。用巴斯德管缓慢轻柔吹打20次，冰上放置2min，将单细胞悬液以1000rpm离心5min。离心后，去除上清中的细胞碎片，用2ml预冷的dmem培养基重悬，培养基中含10％f12营养混合物(f12，invitrogen，美国)，10％fbs(invitrogen，美国)，1％青链霉素(invitrogen，美国)。以5
×
104的密度接种孔板中，并放入37℃培养箱培养。
[0249]
(4)6h后用不含血清的neurobasal培养基(含2mm glutamax-i和2％b27supplement)进行半换液，后每三天进行一次半换液。同时每孔加2μm阿糖胞苷以抑制胶质细胞生长，持续培养两周后进行膜片钳电流钳记录。
[0250]
(5)神经元选用-70mv静息电位，350mω或者更大输出电阻的，进行电流钳的记录。记录过程中是细胞保持-80mv的固定电压，通过注入固定增加的正电流持续1000ms，注入的设定电流在ptz处理组(ptz处理24h后记录)和ptz处理后施加chtx或其突变体chtx-q18f、chtx-t23f的癫痫细胞组(加入药物10min后记录)之间调节尖峰放电的不同频率。尖峰的宽度在尖峰阈值的一半处进行测量，测量出来fahp的大小作为动作电位峰值后的最小电压和尖峰阈值之间的差值，通过指数函数从fahp的最高点到随后的5-10ms之间来测量ahp的衰减，峰值之间的时间间隔是动作电位峰值之间的时间。
[0251]
4.2实验结果
[0252]
结果参见图4，经ptz预处理的锥体神经元(生理盐水组)显示出较低的动作电位频率适应能力，导致电流峰之间间隔较短。与ptz预处理组细胞相比，chtx-q18f处理后的癫痫细胞两个动作电位的间隔明显延长(p《0.001，n＝11)，甚至用chtx-q18f处理后处理后的细胞在高电流注入时也不能持续产生动作电位同时伴随着更多动作电位的缺失，这与ptz预处理组的结果完全不同。与ptz预处理相比chtx-q18f治疗组表现出更长的动作电位间隔，更宽的动作电位以及动作电位发放频率降低(200和300pa时p《0.001，100p时p《0.05pa曲线，n＝4)。在300pa电流下，与生理盐水组相比，chtx-q18f组的动作电位更宽后超极化(ahp)衰减速度更慢(p《0.001，n＝11)。同时，chtx-q18f处理后，明显增加了ahp的大小(在300pa曲线处p《0.001，n＝11)，并且显著延长了ahp的衰减时间，并抑制ahp产生神经元放电阈值。此外，用chtx-q18f处理的癫痫细胞，与chtx和chtx-t23f组细胞相比，动作电位个数更少、动作电位间隔更长。这些结果提示，用chtx-q18f处理的癫痫发作细胞达到神经元放电阈值的时间明显延长。
[0253]
实施例5：大鼠ptz癫痫模型海马局部场电位的考察
[0254]
5.1实验步骤
[0255]
通过多电极脑电技术对大鼠ptz癫痫模型的海马局部场电位进行了测定，实验结果参见图5。
[0256]
局部场电位数据通过omniplex在体多通道记录系统(plexon，hong kong)采集，前置放大器放大1000倍，波幅范围-2-+2v，1.6-100hz的滤波范围，局部场电位记录频率为1khz，设置50hz高通滤波和300hz低通滤波，单次记录时间不少于30min。
[0257]
实验开始前首先在清醒状态下采集30min作为基础脑电水平，随后腹腔注射ptz诱发癫痫复发作后持续记录1h。癫痫发作过程中大鼠活动剧烈应时刻观察，若电极松动或脱落应及时终止记录以免造成较大误差或数据缺失。
[0258]
局部场电位以.pl2格式导出，使用offline sorter v4软件进行可视化预览，脑电数据经matlab r2015b软件导出。将注射ptz后至第一次出现癫痫样放电的时间定义为潜伏期，小波分解得到δ、θ、α、β、γ、四种不同频率的生理节律(δ：～0-4hz，θ：～4-8hz，α：～8-13hz，β：～13-30hz，γ：～30-100hz)；运用pwelch命令进行功率谱密度(psd)分析，按照δ、θ、α、β、γ的频率范围，将局部场电位分解成不同频率的波。采用welch法、hamming window)和快速傅里叶变换法计算功率谱分析局部场电位的频域信息。
[0259]
局部场电位功率谱密度(psd)计算公式如下：
[0260][0261][0262]
5.2实验结果
[0263]
为了确定chtx、及其chtx-q18f、chtx-t23f突变体是否能够缓解癫痫发作的程度，以及对ptz诱导惊厥之后的功率谱密度(psd)的影响，因此分别比较了chtx和chtx-q18f、chtx-t23f以及丙戊酸钠(vpa)组在ptz(60mg/kg)诱发惊厥之后的场电位(fp)信号，ptz诱导之后的场电位变化用omniplex软件(plexon,usa)生成的功率谱密度热图来显示。
[0264]
结果分析如下：
[0265]
与生理盐水组相比，施加chtx-q18f可快速抑制ptz诱导的癫痫大鼠的场电位(fp)活跃性(图5a)，而从功率谱密度图可以看出chtx对ptz诱导的癫痫大鼠的场电位活跃性无明显影响(图5b)，生理盐水组和chtx组在低频率(δ)波段显示出尖峰，chtx-t23f在中低频率(θ)波段显示出尖峰，而chth-q18f组在相同波段并未显示出类似的尖峰，这表明chtx-q18f的施加从根本上改变了负责产生低频波的神经元的神经连接网络。
[0266]
经过统计，chtx-q18f的δ波(p《0.001,n＝3),θ波(p《0.001,n＝3)和α波(p《0.01,n＝3)的psd明显低于生理盐水组(图5c)。而chtx-t23f组α，β，γ波(图5c、p《0.05,n＝3)与生理盐水组没有显著差异。chtx-q18f的δ波(p《0.01,n＝3)的psd要显著低于野生型chtx组。chtx-t23f施用后的低频波(δ波:p《0.05n＝3；θ波:p《0.05,n＝3)是显著低于生理盐水组的。
[0267]
以上实验共同表明本发明的chtx-q18f毒素可抑制大鼠惊厥发作，说明本发明的chtx-q18f毒素肽具有抗癫痫药效。
[0268]
结论
[0269]
本发明专利利用分子克隆等技术制备了毒素肽chtx及其突变体chtx-q18f及chtx-t23f。作为对照样品生理盐水、chtx和chtx-t23f，通过考察它们对大鼠ptz复发惊厥行为的影响、对大鼠惊厥发作后海马c-fos表达的影响、是否造成大鼠惊厥发作后对海马神经元损伤、对大鼠海马神经元动作电位的改变、大鼠ptz癫痫模型海马局部场电位改变等，证明chtx-q18f毒素对海马神经元损伤小，可抑制大鼠惊厥发作，具有抗癫痫药效。
[0270]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独
引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。