过表达长非编码RNACCTT在人工异倍体构建中的应用

过表达长非编码rna cctt在人工异倍体构建中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及过表达长非编码rna(lncrna)cctt在人工异倍体的构建中的应用。


背景技术：

2.异倍体(aneuploidy)是指含有异常染色体数目(增加或缺失)的细胞，在肿瘤组织中广泛存在，被认为在肿瘤发生发展中发挥促癌功能。然而，研究表明异倍体细胞增殖受到抑制，由此产生领域内长期存在的“异倍体悖论(aneuploidy paradox)”，即肿瘤细胞为何能够耐受大量异倍体，并克服其产生的增殖抑制效应，维持旺盛的增殖能力。
3.人工异倍体是研究基因组稳定性及其调控机制的良好材料。此前的研究通过在细胞中增加一条染色体建立工程化的人工异倍体。例如，通过罗伯逊异位(robertsonian translocations)建立多出1，13，16或19号染色体的小鼠胚胎成纤维细胞等。然而，在人工异倍体构建中面临的最大难题是异倍体细胞由于基因组不稳定、氧化应激、dna损伤等多种压力因素抑制增殖，并可能导致细胞死亡，导致异倍体细胞难以长期稳定培养。解决“异倍体悖论”，揭示异倍体克服增殖抑制效应的新机制可能为人工异倍体建立提供新的手段和策略，具有良好的应用前景。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种过表达lncrna cctt在人工异倍体的构建中的应用。
5.第一方面，本发明要求保护一种能够促进lncrna cctt表达的物质在如下p1和/或p2中的应用：
6.p1、构建人工异倍体细胞，或制备用于构建人工异倍体细胞的产品；
7.p2、促进细胞增殖和/或生长，或制备用于促进细胞增殖和/或生长的产品。
8.第二方面，本发明要求保护一种构建人工异倍体细胞的方法。
9.本发明要求保护的构建人工异倍体细胞的方法，可包括如下步骤：向受体细胞中导入能够促进lncrna cctt表达的物质，得到所述lncrna cctt表达量提高的异倍体细胞(与导入前相比，异倍体细胞比例提高)。
10.在本发明的具体实施方式中，在得到所述lncrna cctt表达量提高的异倍体细胞后还包括采用秋水仙碱对所述异倍体细胞进行周期同步化处理时，秋水仙碱的浓度为0.02μg/ml。采用秋水仙碱对所述异倍体细胞进行处理时，处理时间为18h。
11.在上述两方面中，所述能够促进lncrna cctt表达的物质可为能够转录为lncrna cctt的dna分子或者含有所述dna分子的表达载体。
12.在上述两方面中，所述lncrna cctt为seq id no.1所示的rna。
13.进一步地，能够转录为所述lncrna cctt的dna分子如seq id no.2的第11-749位所示。
14.在本发明的具体实施方式中，含有所述dna分子的表达载体为将seq id no.2的第
11-749位所示dna片段克隆到pcdna3.1(+)载体的多克隆位点后得到的重组质粒。
15.在本发明中，所述产品具体可为试剂盒。
16.在上述两方面中，所述细胞可为肿瘤细胞，也可为非肿瘤细胞。
17.进一步地，所述肿瘤细胞可为结肠癌细胞或肺癌细胞等。
18.进一步地，所述非肿瘤细胞可为内皮细胞或上皮细胞等。
19.更进一步地，所述结肠癌细胞可为ht116细胞；所述肺癌细胞可为a549细胞。
20.更进一步地，所述内皮细胞可为脐静脉内皮细胞；所述上皮细胞可为支气管上皮细胞。在本发明的具体实施方式中，所述脐静脉内皮细胞为人脐静脉内皮细胞huvec；所述上皮细胞为支气管上皮细胞beas-2b。
21.第三方面，本发明要求保护利用前文第二方面所述方法构建得到的人工异倍体细胞。
22.实验证明，lncrna cctt过表达能够显著诱导产生异倍体，更为重要的是其同时不影响或促进细胞增殖。本发明在一定程度上解释了“异倍体悖论”，从而保证异倍体能够长期扩增、稳定培养，在构建人工异倍体中具有重要意义。
附图说明
23.图1为过表达lncrna cctt。qrt-pcr检测pcmv-cctt转染hct116(a)或a549(b)细胞48h后或稳定过表达lncrna cctt的a549细胞(c)lncrna cctt表达水平。非配对t检验，**p《0.01。图中，ctrl为空载体转染对照细胞；oe-cctt为pcmv-cctt载体转染/稳定过表达lncrna cctt细胞。
24.图2为lncrna cctt过表达导致异倍体。hct116细胞过表达lncrna cctt，72h后通过核型分析统计异倍体比例。非配对t检验，**p《0.01。图中，ctrl为pcmv空载体转染对照细胞；oe-cctt为pcmv-cctt载体转染细胞。
25.图3为lncrna cctt过表达促进a549细胞增殖。a为lncrna cctt过表达a549细胞生长曲线。b为lncrna cctt过表达a549细胞克隆形成。非配对t检验，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。c为lncrna cctt过表达a549细胞裸鼠成瘤。接种细胞22d取材，测量肿瘤体积(中)、质量(右)，n＝10。配对t检验，**p《0.01。
26.图4为lncrna cctt过表达抵抗多种细胞增殖抑制。a为lncrna cctt过表达人内皮huvec细胞72h计数；b为lncrna cctt过表达人肺支气管上皮beas-2b细胞72h计数；c为lncrna cctt过表达人结肠癌hct116细胞生长曲线。非配对t检验，ns，p》0.05，无显著性差异；*p《0.05。
具体实施方式
27.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
28.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.下述实施例中所涉及的lncrna cctt的核苷酸序列如seq id no.1所示。
30.实施例1、lncrna cctt过表达诱导产生异倍体
31.一、lncrna cctt过表达载体构建
32.以人肺癌a549细胞系基因组dna为模板，通过pcr扩增获得lncrna cctt全长片段，测序确认无突变(seq id no.2，前十位和后十位为酶切位点序列及保护碱基)。将扩增片段克隆到pcdna3.1(+)表达质粒的酶切位点ecori和bamhi之间，得到的重组质粒经测序验证正确后命名为pcmv-cctt。
33.pcr反应程序：
34.94℃预变性5min；
35.94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；
36.72℃延伸10min；
37.4℃保存。
38.pcr引物序列：
39.f：5
’‑
cgggatcccgctttttgaggcagctaccagaag-3’；
40.r：5
’‑
cggaattccgctcagtttcttttttaaatttt-3’。
41.重组质粒pcmv-cctt的结构描述：在pcdna3.1(+)表达质粒的酶切位点ecori和bamhi之间插入seq id no.2的第11-749位所示dna片段后得到的重组质粒。
42.二、过表达lncrna cctt的hct116异倍体细胞的制备
43.将步骤一构建的pcmv-cctt转染人结肠癌细胞ht116，转染后48h采用qrt-pcr检测lncrna cctt表达水平。
44.用于检测lncrna cctt的引物如下：
45.f：5
’‑
ctaaggattcggtgttgg-3’；
46.r：5
’‑
cctgccaggttagaggg-3’。
47.以gapdh为内参，引物如下：
48.f：5
’‑
acccagaagactgtggatgg-3’；
49.r：5
’‑
cagtgagcttcccgttcag-3’。
50.结果显示：成功获得了lncrna cctt过表达的hct116细胞(图1)。
51.三、细胞核型分析
52.1、接种步骤二获得的lncrna cctt过表达hct116细胞和转染空载体的对照细胞到6孔板，贴壁培养至细胞融合度约70％，加入秋水仙碱(0.02μg/ml)孵育18h进行细胞周期同步化，72h进行核型分析。
53.2、消化细胞，离心，逐滴加入0.4％kcl重悬细胞，37℃低渗处理10min。
54.3、加入等体积卡诺氏固定液(乙醇：冰醋酸＝3：1，体积比)，室温固定10min。
55.4、离心，弃去上清，再次加入卡诺氏固定液重悬细胞，室温固定10min。
56.5、重复步骤4一次。
57.6、取细胞悬液摔片到预冷的载玻片上，滴加10％吉姆萨染液，室温染色20-30min。
58.7、用蒸馏水洗去浮色，100x油镜观察、拍照，统计每个细胞染色体数目。
59.结果如图2所示，可见lncrna cctt过表达导致异倍体产生。
60.本实施例结果显示：在人结肠癌细胞ht116中过表达lncrna cctt(图1)，发现其诱
导异倍体细胞(图2)。
61.实施例2、lncrna cctt过表达抵抗多种细胞增殖抑制
62.一、lncrna cctt过表达细胞的制备
63.1、瞬时过表达
64.参照实施例1步骤一和二构建过表达lncrna cctt的人肺癌细胞a549、人脐静脉内皮细胞huvec、人肺支气管上皮beas-2b细胞。以各过表达lncrna cctt细胞和对应的对照细胞(转染pcmv空载体的细胞)进行下面步骤二的检测。lncrna cctt过表达的a549细胞如图1所示。
65.2、稳定过表达(稳转细胞系构建)
66.(1)利用逆转录病毒表达载体pqcxip(biovector，货号：3558629)包装过表达lncrna cctt的逆转录病毒pqcxip-cctt。
67.(2)接种2
×
105a549细胞至6孔板，贴壁生长至70％融合度。
68.(3)利用pqcxip-cctt逆转录病毒感染细胞，以空病毒作为对照(1ml病毒液+1ml dmem培养基孵育12h后换成dmem完全培养基)。
69.(4)48h后加入嘌呤霉素(puromycin，3μg/ml)筛选，3d后扩增存活细胞建系。
70.(5)通过细胞rna qrt-pcr检测lncrna cctt过表达效率。
71.结果显示：lncrna cctt过表达效率高，稳定过表达a549细胞系构建成功(图1)。
72.二、细胞生长/增殖检测
73.1、细胞计数
74.转染72h后，对转染pcmv-cctt细胞进行计数，以转染pcmv空载体同种细胞作为对照。
75.2、细胞生长曲线
76.(1)根据不同细胞类型选择合适的密度接种细胞于24孔板中，37℃，5％co2浓度培养，记录初始细胞数(0d)。
77.(2)分别于合适时间点(如3d、5d、7d等)用细胞计数仪分析对照组(转染pcmv空载体的细胞)和实验组(转染pcmv-cctt的细胞)细胞数。
78.(3)根据各时间点细胞数绘制细胞生长曲线，通过三次独立重复实验进行统计学分析。
79.3、细胞克隆形成实验
80.(1)取对数生长期的各组细胞，包括lncrna cctt稳转过表达a549细胞和空病毒感染的对照a549细胞，胰酶消化并吹打成单个细胞，离心，用含血清培养基重悬。
81.(2)细胞计数，分别以每皿50、100、200个细胞的密度梯度接种至10cm培养皿中，使细胞分散均匀，置于37℃，5％co2浓度培养2-3周。
82.(3)定期观察换液，当出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃上清，用pbs小心洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞，室温15min。
83.(4)弃去固定液，加适量结晶紫染液室温染色20min后，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
84.(5)计各组克隆数，并计算克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)
×
100％。
85.三、细胞成瘤性检测(裸鼠成瘤实验)
86.(1)准备6-8周龄balb/c雄性裸鼠(维通利华公司)，饲养于spf级动物房中。
87.(2)于15cm培养皿中培养各细胞系，包括lncrna cctt稳转过表达a549细胞和空病毒感染的对照a549细胞，生长至合适密度。
88.(3)消化细胞，用1
×
pbs重悬细胞制成1
×
107/ml密度悬液。
89.(4)用预冷的枪头吸取100μl细胞悬液，同时加入100μl matrigel稀释，混匀。
90.(5)将裸鼠麻醉，正置于操作台上，用微量注射器将对照组和实验组细胞悬液注射到裸鼠背侧左右腋下对称位置皮下，见鼓包隆起，防止液体流出。
91.(6)观察裸鼠状态：接种1周内，鼓包被吸收，2-3周开始成瘤，定期测量肿瘤直径。
92.(7)在合适时间点(裸鼠状态差或肿瘤直径达1cm)处死裸鼠，解剖观察原位瘤，并检测肿瘤大小和重量。
93.结果显示：过表达lncrna cctt在多种肿瘤细胞中发挥促癌功能，包括：促进a549细胞增殖、克隆形成和裸鼠体内成瘤(图3)。同时，lncrna cctt过表达对人内皮细胞huvec、支气管上皮细胞beas-2b无明显增殖抑制效应(图4)，对人结肠癌细胞hct116生长、增殖有促进作用(图4)，提示其功能具有一定的细胞普适性。
94.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。