一种检测牛结节性皮肤病的Cycleave荧光PCR方法与流程

一种检测牛结节性皮肤病的cycleave荧光pcr方法
技术领域
1.本发明属牛病病原微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测牛结节性皮 肤病的cycleave荧光pcr引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法。


背景技术：

2.牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)是一种由痘病毒科(poxviridae)、 羊痘病毒属(capripoxvirus，capv)的牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin diseasevirus，lsdv)引起的急性、亚急性传染病，主要特征是发热，皮肤、粘膜上结 节样病变和淋巴结肿大等。
3.牛是该病毒的特异性宿主，发病可导致奶牛产奶量下降、公牛短暂或永久不 育、怀孕牛流产、皮革损坏以及继发细菌感染导致死亡。该病曾于非洲、中东、 东欧等地区多个国家流行并造成巨大经济损失。
4.检测时，通过发热、皮肤结节样变化、淋巴结肿大等临床症状可初步诊断该 病，但其确诊需依赖实验室检测，特别是疾病处于潜伏期或前驱期时。而且患病 牛产生皮肤损伤的症状易与皮肤癣病、昆虫叮咬等易混淆；发病期，患病牛结节 处可呈现黏膜坏死、破溃等症状，需与口蹄疫、蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛传染 性鼻气管炎等进行鉴别。此外，还存在无临床症状的隐性感染的情况，均需进行 实验室检测确诊。因此，开发快速、准确、简便的lsd特异性检测方法是防控该 病的关键。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种cycleave荧光pcr引物对、探针及应用该引物对 和探针的检测方法，从而实现对牛结节性皮肤病病毒特异、敏感、快速的检测。
6.本发明首先提供一种检测牛结节性皮肤病病毒的引物对和探针，引物对和探 针序列信息如下：
7.牛结节性皮肤病病毒检测正向引物lsd forward：
[0008]5′‑
cgatacactctccratatc
‑3′
(seq id no:1)
[0009]
牛结节性皮肤病病毒检测反向引物lsd reverse：
[0010]5′‑
aacgagaagtatgaattagc
‑3′
(seq id no:2)
[0011]
牛结节性皮肤病病毒检测探针lsd probe：
[0012][0013]
其中，检测探针lsd probe的5
′
端进行羧基荧光素fam标记，3
′
端进行淬灭 基团eclipse标记，下划线位置为标记的rna位点。
[0014]
上述引物和探针用于制备检测牛结节性皮肤病病毒的cycleave荧光pcr检 测体系。
[0015]
进一步，本发明还提供检测牛结节性皮肤病病毒核酸的cycleave荧光pcr 方法，包括如下的步骤：
[0016]
1)cycleave荧光pcr反应体系配制
[0017]
反应液每管25μl，含有2
×
cycleave pcr反应液12.5μl，5pmol/μl的lsdforward和lsd reverse各0.6μl，5pmol/μl的lsd probe 0.8μl，双蒸水8.5μl， 待检测样品dna模板2μl。其中，cycleave pcr检测试剂盒(目录号：cy505a) 购自宝生物工程(大连)有限公司产品。
[0018]
2)cycleave荧光pcr反应体系扩增
[0019]
检测反应条件设置为：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s， 72℃延伸20s(收集fam信号)，共40个循环。
[0020]
3)结果判定
[0021]
阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪 器噪音情况进行调整。待检样品无ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检 样品ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。
[0022]
本发明所提供的cycleave荧光pcr检测牛结节性皮肤病病毒的引物、探针及 方法，具有如下的技术优点：
[0023]
1)灵敏度高：扩增模板的最低检出限可达1.13
×
100copies/μl，约合2copies/ 反应；2)特异性好：采用cycling标记的荧光探针，特异性针对lsdv基因组产 生荧光扩增信号，经验证对同属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒，及常见的口蹄疫病 毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、蓝舌病病毒等相关牛病病毒，均无交叉反应；3) 快速高通量：检测速度快，加入样品后40分钟内即可完成整个扩增检测过程， 且根据荧光定量pcr仪的检测孔数量，可以一次性实现96～384个样品的同步 检测；4)操作简便：配置好的cycleave pcr反应体系，置于荧光定量pcr仪中 即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。
附图说明
[0024]
图1：本发明扩增lsdv orf024基因部分序列的引物和探针设计示意图， 其中引物探针设计区域由方框圈出。
[0025]
图2：阳性质粒制备电泳结果图，其中泳道1：2000bp marker；泳道2： lsdv/china/xj/2019
‑
1。
[0026]
图3：cycleave pcr灵敏度试验结果图，其中1：工作标准品1；2：工作标 准品2；3：工作标准品3；4：工作标准品4；5：工作标准品5；6：工作标准品 6；7：工作标准品7；8：工作标准品8；9：工作标准品9；10：阴性对照。
[0027]
图4：cycleave pcr标准曲线结果图，其中1：工作标准品1；2：工作标准 品2；3：工作标准品3；4：工作标准品4；5：工作标准品5；6：工作标准品6； 7：工作标准品7；8：工作标准品8。
[0028]
图5：cycleave pcr特异性试验结果图，其中1：工作标准品4；2：绵羊痘 病毒；3：山羊痘病毒；4：o型/a型口蹄疫病毒；5：牛病毒性腹泻
‑
黏膜病病毒 与传染性鼻气管炎病病毒；6：蓝舌病病毒；7：阴性对照。
具体实施方式
[0029]
本发明采用的cycleave荧光pcr是采用一对引物和一个嵌合有rna位点的 dna探
针扩增模板，当探针与互补的目标dna杂交时，在rna位点连接处切割 探针，产生标记荧光，通过实时监测荧光信号实现检测目的。
[0030]
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更清楚的理解，现对照附图详细说 明本发明的具体实施方式。
[0031]
实施例1：引物及探针的筛选与设计
[0032]
牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,lsdv)属于羊痘病毒属，同 属还有山羊痘病毒(goatpox virus,gtpv)和绵羊痘病毒(sheeppox virus,sppv)， 已有研究显示三种病毒间具有较高基因组同源性。
[0033]
为了避免检测lsdv时出现假阳性，首先，从ncbi数据库中查找并下载已有 的全部27株lsdv基因组全序列(genbank登录号：mn636843.1、mn636842.1、mn636841.1、mn636840.1、mn636839.1、mn636838.1、mk4418381、 mh646674.1、kx764645.1、kx764644.1、kx764643.1、mt992618.1、mt130502.1、 af409137.1、mn995838.1、mn642592.1、mn072619.1、kx894508.1、mh893760.2、 ky829023.3、ky829023.3、ky702007.1、kx683219.1、mt130502.2、mt643825.1、 af325528.1、af409138.1)，已有全部12株gtpv基因组全序列(genbank登录 号：kx576657.1、ay077836.1、ay077835.1、mn072621.1、mn072620.1、 mh381810.1、kc951854.1、mw020570.1、mn072622.1、mn072625.1、 mn072624.1、mn072623.1)和全部13株sppv基因组全序列(genbank登录号： mn072631.1、mn072630.1、mn072629.1、mn072628.1、mn072627.1、 mn072626.1、mw020571.1、mg000156.1、ay077834.1、ay077833.1、ay077832.1、 kt438551.1、kt438550.1)。
[0034]
再利用生物信息学软件blast和lasergene megalign，逐段将上述lsdv、 gtpv、sppv基因组全序列进行比较，分析筛选了4个lsdv种特异性单核苷 酸多态性位点(single nucleotide polymorphism,snp)，即orf024基因y51g与 a287g，orf101基因a1671t与t1743c。针对上述的snp位点，综合考虑snp 位点两翼序列的保守性、碱基组成、gc含量、二级结构的形成、tm值等因素， 设计了4组检测lsdv的cycleave荧光pcr引物探针方案(表1)。
[0035]
表1：lsdv种特异性snp位点及引物探针组设计表
[0036]
[0037][0038]
简并碱基y＝t/c，r＝a/g；探针中加粗标记为lsdv特异性snp位点，下划线为rna碱基位点，u表示 尿嘧啶。
[0039]
经过灵敏性、特异性验证后，本发明最终采用方案2所示的引物探针组合。 以lsdv ni
‑
2490株(genbank登录号：af325528.1)作为参考株，设计引物用 于扩增lsdv orf024基因第238～388位序列，设计探针含lsdv特异性snp位点。 引物和探针设计区域见图1。其具体序列信息如下：
[0040]
牛结节性皮肤病病毒检测正向引物lsd forward：
[0041]5′‑
cgatacactctccratatc
‑3′
(seq id no:1)
[0042]
牛结节性皮肤病病毒检测反向引物lsd reverse：
[0043]5′‑
aacgagaagtatgaattagc
‑3′
(seq id no:2)
[0044]
牛结节性皮肤病病毒检测探针lsd probe：
[0045][0046]
其中，牛结节性皮肤病病毒检测探针lsd probe针的5
′
端进行羧基荧光素 fam标记，3
′
端进行淬灭基团eclipse标记，下划线位置为标记的rna位点。引 物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。
[0047]
实施例2：筛选的引物对、探针的灵敏度实验
[0048]
1、阳性质粒标准品的制备
[0049]
1)阳性质粒的制备
[0050]
中国流行株lsdv/china/xj/2019
‑
1病毒由中国动物卫生与流行病学中 心分离、鉴定、保存及提供。采用商品化病毒基因组提取试剂盒按说明方 法提取病毒dna模板，进行常规pcr扩增，具体步骤如下：
[0051]
反应液每管25μl，含有2
×
platinum super green pcr mix反应液12.5 μl，10pmol/μl的lsd forward和lsd reverse各1μl，双蒸水8.5μl，提取的 dna模板2μl。其中，platinum super green pcr mix检测试剂盒(目录号： 00766789)购自invitrogen公司。二是反应条件设置：95℃预变性5min，95℃ 变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，72℃最后延伸5min； 4℃保存。
[0052]
pcr产物经3％琼脂糖凝胶电泳(见图2)，回收目的片段并连接pmd19
‑
t 载体，转化
dh5α大肠杆菌，经pcr鉴定阳性菌株送青岛睿博兴科公司测序。 测序结果符合预期作为阳性菌种，提取其质粒作为阳性质粒。阳性质粒含orf024 基因第238～388位序列，及lsdv特异性snp位点a287g。序列如下：
[0053][0054]
(注：下划线区域表示引物匹配位置；下划线斜体区域为探针匹配位置；阴 影为snp位点位置；加粗为rna碱基位置)
[0055]
2)阳性质粒标准品的制备
[0056]
采用超微量紫外分光光度计测定阳性质粒od260/od280比值及浓度 (单位ng/μl)，根据公式：质粒拷贝数(copies/μl)＝(质粒浓度
×
10
‑9×
稀释倍数
×
6.02
×
10
23
)/(660道尔顿/碱基
×
碱基数)，计算其拷贝数。
[0057]
经测定阳性质粒od260/od280比值为1.98，初始浓度为250.9ng/μl，拷 贝数为1.13
×
10
11
copies/μl，进行10倍梯度稀释，制备标准品分别为：工作标 准品1，含有1.13
×
107copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品2， 含有1.13
×
106copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品3，含有 1.13
×
105copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品4，含有1.13
×
10
4 copies/μl阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品5，含有1.13
×
103copies/μl 阳性质粒非传染性dna片段；工作标准品6，含有1.13
×
102copies/μl阳性质粒 非传染性dna片段；工作标准品7，含有1.13
×
101copies/μl阳性质粒非传染性 dna片段；工作标准品8，含有1.13
×
100copies/μl阳性质粒非传染性dna片 段；工作标准品9，含有1.13
×
10
‑1copies/μl阳性质粒非传染性dna片段。
[0058]
2、灵敏度检测的实施
[0059]
采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对系列工作标准品和阴性 对照(成分为无核酸酶水)进行检测并绘制标准曲线，具体步骤如下：
[0060]
(1)反应体系配制：反应液每管25μl，含有2
×
cycleave pcr反应液12.5 μl，5pmol/μl的lsd forward和lsd reverse各0.6μl，5pmol/μl的lsd probe 0.8μl，双蒸水8.5μl，待检测样品dna模板2μl。其中，cycleave pcr检测试 剂盒(目录号：cy505a)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(2)反应条 件设置：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s(收 集fam信号)，共40个循环。(3)结果的判定：阈值设定原则以阈值线刚好 超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品 无ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品ct值≤40.0，且出现典型的 扩增曲线，结果判为阳性。
[0061]
结果如图3所示，工作标准品1～8均出现典型扩增曲线，检测结果为阳性； 工作标准品9和阴性对照无扩增曲线，检测结果为阴性。结果显示，本方法最低 检出限为工作标准品8，灵敏度为2.26copies/反应。选取梯度稀释的工作标准品 1～8绘制标准曲线，如图4所示，标准曲线的线性方程为：y＝
‑
2.723x+38.388， r2＝0.999，扩增效率e＝132.9％。结果说明本发明所使用的引物对和探针具有极 高的扩增效率，且在检测范围内模板浓度与检测ct值间具有良好线性关系。
[0062]
实施例3重复性实验
[0063]
采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对实施例2中制备的工作 标准品2～6进行三次cycleave荧光pcr重复检测，计算批间变异系数；在同次 cycleave荧光pcr中重复检测三次，计算批内变异系数，具体步骤如下：
[0064]
(1)反应体系配制：反应液每管25μl，含有2
×
cycleave pcr反应液12.5 μl，5pmol/μl的lsd forward和lsd reverse各0.6μl，5pmol/μl的lsd probe0.8μl，双蒸水8.5μl，待检测样品dna模板2μl。其中，cycleave pcr检测试 剂盒(目录号：cy505a)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(2)反应条 件设置：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s(收 集fam信号)，共40个循环。(3)结果判定：阈值设定原则以阈值线刚好超 过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。重复检测工 作标准品2～6，分别统计3次批间和3次批内重复检测的ct值，按变异系数 cv％＝(标准偏差sd/平均值mean)
×
100％，计算批间和批内重复ct值 变异系数。
[0065]
结果如表2所示，工作标准品2～6批内重复性检测和批间重复性检测 ct值变异系数均小于2％，表明本方法具有良好的可重复性。
[0066]
表2：批内和批间重复性检测结果表
[0067][0068]
实施例4特异性实验
[0069]
采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对牛病毒性腹泻/黏膜病病 毒等相关病毒样品，健康牛来源全血、唾液、皮肤样品，以及阳性对照(成分为 实施例2中制备的工作标准品4)和阴性对照(成分为无核酸酶水)进行检测， 具体步骤如下：
[0070]
(1)特异性样品制备：健康牛来源全血、唾液、皮肤样品，由国家外来动 物疫病研究中心采集与提供；山羊痘病毒av41株、口蹄疫病毒o型和a型 (fmdv/re
‑
o/mya98/jscz2013+fmdv/re
ꢀ‑
a/wh/09株)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒和牛传染性鼻气管炎病毒(nmg株 +ly株)来源市售商品化疫苗；绵羊痘病毒gl株dna模板由中国农业科学院 兰州兽医研究所惠赠；蓝舌病病毒dna模板由军事医学科学院军事兽医研究所 惠赠。全血、唾液、病毒样品直接采用商品化dna提取试剂盒于全自动核酸提 取仪上取核酸；皮肤样品先进行匀浆，再采用商品化dna提取试剂盒于全自动 核酸提取仪上取核酸，获得的核酸样本于
‑
20℃保存备用。(2)反应体系配制： 反应液每管25μl，含有2
×
cycleave pcr反应液12.5μl，5pmol/μl的lsdforward和lsd reverse各0.6μl，5pmol/μl的lsd probe 0.8μl，双蒸水8.5μl， 待检测样品dna模板2μl。其中，cycleave pcr检测试剂盒(目录号：cy505a) 购自宝生物工程(大连)有限公司产品。(3)反应条件设置：95℃预变性10s； 95℃变性5s，55℃退火
10s，72℃延伸20s(收集fam信号)，共40个循 环。(4)结果的判定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的 最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品无ct值并且无扩增曲线， 结果判为阴性；待检样品ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。
[0071]
结果如图5，阳性对照出现典型扩增曲线，阴性对照未出现扩增信号，实验 成立。本实验中检测的相关山羊痘病毒、绵羊痘病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹 泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒样本核酸均未出现扩增信号， 表明本方法检测上述病毒均无交叉反应，具有良好的特异性。
[0072]
实施例5实际临床样本的检测
[0073]
采用实施例1中设计的引物、探针制备反应体系，对采集自临床疑似感染动 物的血液等类型临床样品，以及阳性对照(成分为实施例2中制备的工作标准品 4)和阴性对照(成分为无核酸酶水)进行检测；同时参照国家标准《牛结节性 皮肤病诊断技术》(gb/t 39602
‑
2020)方法对临床样品进行平行检测。具体步 骤如下：
[0074]
(1)临床样品的制备：临床疑似感染牛结节性皮肤病牛的全血、唾液、皮 肤结节样品共计89份，由内蒙古自治区动物疫病预防与控制中心采集与提供。 全血、唾液样品直接采用商品化dna提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取核酸； 结节样品先进行匀浆，再采用商品化dna提取试剂盒于全自动核酸提取仪上取 核酸，获得的核酸样本于
‑
20℃保存备用。
[0075]
(2)cycleave荧光pcr方法：一是反应体系配制：反应液每管25μl，含 有2
×
cycleave pcr反应液12.5μl，5pmol/μl的lsd forward和lsd reverse各 0.6μl，5pmol/μl的lsd probe 0.8μl，双蒸水8.5μl，待检测样品dna模板2μl。 其中，cycleave pcr检测试剂盒(目录号：cy505a)购自宝生物工程(大连) 有限公司产品。二是反应条件设置为：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火 10s，72℃延伸20s(收集fam信号)，共40个循环。三是结果的判定：阈值 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情 况进行调整。待检样品无ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品ct值 ≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。
[0076]
(3)国标方法：参照国家标准《牛结节性皮肤病诊断技术》(gb/t39602
‑
2020)中通用牛结节性皮肤病病毒核酸检测方法进行。
[0077]
检测结果见表3，cycleave荧光pcr方法检出牛结节性皮肤病病毒核酸阳 性53份、阴性36份；国标方法检出牛结节性皮肤病病毒核酸阳性49份、阴性 40份。与国标方法相比，cycleave荧光pcr方法敏感性为100％，特异性为90％， 总符合率为95.5％。将与国际方法检测结果不一致的4份样品，回收扩增片段并 测序鉴定，证实均为牛结节性皮肤病病毒核酸阳性。结果显示，cycleave荧光pcr 方法与国标荧光定量pcr方法检测结果间符合率良好，同时具有更高的阳性检 出率。
[0078]
表3：cycleave荧光pcr与国标方法平行检测临床样品结果表
[0079][0080]
综上，本发明的引物对、探针及使用该引物对、探针的cycleave荧光pcr 方法特异敏感且简便快速，适用于我国牛结节性皮肤病的检测。