一种H5N8亚型流感病毒RT-PCR检测引物及其应用的制作方法

一种h5n8亚型流感病毒rt
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pcr检测引物及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因检测领域，具体是指一种h5n8亚型流感病毒rt
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pcr检测引物及其应用。


背景技术：

2.禽流感是由正粘病毒科a型流感病毒属禽流感病毒(avian influenza virus,aiv)引起的一种高度传染性疫病。该病在全球范围内广泛传播，不仅对禽类健康造成巨大的危害，也严重威胁人类公共安全。尤其是高致病性h5亚型流感病毒，不仅感染禽类，造成禽类高发病率和高死亡率，导致巨大经济损失，还能突破种间障碍感染人类，具有严重的公共卫生危害。
3.a型流感病毒基因组由8个节段的单股负链rna构成，根据各片段编码蛋白的不同，分别命名为pb2、pb1、pa、ha、np、na、m和ns。随着对a型流感病毒编码蛋深入研究，目前已发现10种必需蛋白(pb2、pb1、pa、ha、np、na、m1、m2、ns1和nep/ns2) 和7种非必需的附件蛋白(pb1
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f2、n40、pa
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x、pa
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n155、pa
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n182m42和ns3)。这些蛋白在病毒复制、致病、逃逸宿主免疫反应等过程相互协调，共同发挥作用。在众多编码蛋白中，血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)是a型流感病毒的2种主要的糖蛋白，也是主要的病毒表面抗原。根据ha和na基因的差异，a型流感病毒可分为18不同的ha亚型和11 种na亚型。
4.1996年，我国首次在鹅体内分离鉴定出h5n1亚型高致病性流感病毒，随后也发现人感染h5n1流感病毒致死病例。近年，h5n1流感病毒与多个不同亚型的na基因重配，形成多种新亚型h5nx病毒(包括h5n1、h5n2、h5n3、h5n5、h5n6、h5n7、h5n8和h5n9等)，其中h5n8亚型流感病毒地理分布最为广泛。
5.2020年，h5n8亚型流感疫情在多国暴发，包括挪威、韩国、英国、匈牙利、瑞典和以色列、日本、伊朗、中国等国家。在时间上，h5n8流感疫情的暴发与候鸟、野禽的迁徙越冬时间相一致，这也表明候鸟、野禽在h5n8流感疫情传播中发挥重要作用。野生水禽(尤其是雁形目和鸻形目)是流感病毒自然贮存宿主，自然条件下，几乎可以从野生水禽体内分离到所有亚型流感病毒，其自身不表现临床症状，但可持续排毒，不断污染周围环境。同时，野生水禽也为不同亚型流感病毒的重组提供了“容器”。目前，全世界共8条候鸟迁徙路线，候鸟、野生水禽每年均会沿固定路线进行大规模的迁徙，通过直接接触传播或者通过污染的水源和食物传播给家禽，甚至人类。2021年初，俄罗斯首次发现人感染h5n8禽流感病毒病例，引起了全世界的关注，也再次提醒h5亚型禽流感病毒对人类公共卫生安全的危害性。这也突出了建立起野鸟监测体系的必要性以及动态、高效的监测禽流感病毒传播动态、变异的必要性。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题就是克服以上的技术缺陷，提供一种结构简单，实用性强，使用效果好的一种h5n8亚型流感病毒rt
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pcr检测引物及其应用。
7.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种h5n8亚型流感病毒rt
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pcr检测引物，包括以下8组引物：针对h5n8亚型流感病毒pb1、pb2、pa、m、np、ha、na、ns 基因相对保守区域分别设计8组引物，即共计有正向引物8条，反向引物8条；
8.所述8组h5n8亚型流感病毒特异性引物包括seq id no.1～16，其中seq id no.1～2特异性扩增pb1基因，seq id no.3～4特异性扩增pb2基因，seq id no.5～6特异性扩增pa基因， seq id no.7～8特异性扩增m基因，eq id no.9～10特异性扩增np基因，seq id no.11～12特异性扩增ha基因，seq id no.13～14特异性扩增na基因，seq id no.15～16特异性扩增ns 基因。
9.rt
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pcr检测引物在扩增h5n8亚型流感病毒基因中的应用，包括以下步骤：
10.s1：利用rna提取试剂从待测样本中提取rna；
11.s2：利用m
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mlv反转录酶合成cdna；
12.s3：利用权利要求1中所述的引物对h5n8流感病毒8个基因进行pcr扩增；
13.s4：利用琼脂糖凝胶电泳检测，判断待检测样本中h5n8流感病毒是否阳性。
14.进一步的，还包括rt
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pcr检测引物在测定h5n8基因组序列及其演化分析中的应用，包括以下步骤：
15.s1：利用dna胶回收试剂盒将扩增得到的h5n8流感病毒8个基因目的片段胶回收；
16.s2：将h5n8流感病毒8个基因目的片段连接至pmd18
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t载体中并筛选阳性克隆；
17.s3：将包含h5n8流感病毒8个基因片段的阳性克隆进行测序；
18.s4：利用mega6.0软件对h5n8流感病毒8个基因进行遗传演化分析。
19.进一步的，所述流感病毒包括h5n8亚型流感病毒。
20.本发明与现有技术相比的优点在于：本发明所述的h5n8亚型流感病毒rt
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pcr检测引物及其应用，包括针对h5n8亚型流感病毒pb1、pb2、pa、m、np、ha、na、ns基因的引物，可通过rt
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pcr法检测h5n8亚型流感病毒以及测定其基因组，应用简单。
具体实施方式
21.下面进一步说明本发明的具体实施方式。
22.本发明的h5n8亚型流感病毒rt
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pcr检测引物，其具体的实施方案是，包括以下多条引物：
23.针对h5n8亚型流感病毒pb1、pb2、pa、m、np、ha、na、ns基因相对保守序列区设计8组基因扩增引物，包括正向引物8条，反向引物8条。
24.所述引物是包含18bp
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25bp的寡核苷酸片段；
25.所述8组h5n8亚型流感病毒特异性引物包括8组共16条引物，分别为seq id no.1～16。
26.本发明应用上述h5n8亚型流感病毒rt
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pcr检测引物扩增其8个基因序列，其最佳的实施方式是，包括以下步骤：
27.首先，利用rna提取试剂从待测样本中提取rna；
28.其次，利用m
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mlv反转录酶合成cdna；
29.第三，利用权利要求1中所述的引物对h5n8流感病毒8个基因进行pcr扩增；
30.第四，利用琼脂糖凝胶电泳检测，判断待检测样本中h5n8流感病毒是否阳性。
31.本发明应用上述方法测定h5n8亚型流感病毒基因组序列及分析其遗传演化关系，其最佳的实施方式，包括以下步骤：
32.首先，利用dna胶回收试剂盒将扩增得到的h5n8流感病毒8个基因目的片段胶回收；
33.其次，将h5n8流感病毒8个基因目的片段连接至pmd18
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t载体中并筛选阳性克隆；
34.第三，将包含h5n8流感病毒8个基因片段的阳性克隆进行测序；
35.第四，利用mega6.0软件对h5n8流感病毒8个基因进行遗传演化分析
36.实施方案：
37.包括寡核苷酸引物的设计、待检样品的处理、基因扩增及基因序列的遗传演化分析，参照以下实施例进行说明：
38.实施例一：h5n8亚型流感病毒基因检测引物的设计与合成
39.由genbank数据库筛选并下载h5n8亚型流感病毒pb1、pb2、pa、m、np、ha、na、 ns基因的全基因参考序列，利用mega 6.0软件比对分析8个基因的一致性，筛选保守序列区域，随后利用primer premier 5.0软件在h5n8亚型流感病毒8个基因两端的保守序列区域设计pcr扩增引物。筛选pcr扩增引物具备以下特征：1)引物长度18bp～25bp；2)各条引物的gc含量在25％～50％间；3)引物tm值在48℃～55℃之间，每组引物对上下游引物间 tm差在5℃以内；4)每条引物的错配数≤2个，近3’端至少6个碱基无错配；5)每条引物的poly n数量≤4bp；6)各条引物避免有发卡结构。
40.实施例二：本发明在检测h5n8亚型流感病毒基因中的应用举例
41.1、样品处理
42.组织样品处理：取0.5～1.0g组织样品，置1.5ml离心管中，加入2粒钢珠以及500μl pbs 缓冲液，利用组织研磨仪进行研磨。研磨的样品，8000g离心5min，取200μl上清液置于新的1.5ml离心管中。
43.棉拭子样品处理：棉拭子样品采集后，保存于pbs缓冲液中。8000g离心5min后，取200 μl上清液置于新的1.5ml离心管中。
44.2、rna提取
45.200μl上清液中，加入200μl裂解液，参照病毒rna/dna提取试剂盒说明书提取病毒rna50μl。
46.3、cdna合成
47.提取的病毒rna利用m
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mlv反转录酶进行反转录。pcr管中配置10μl体系的rna/ 引物混合液，包括rna 7μl、六碱基随机引物1μl，dntp mix 2μl。65℃保温5min后在冰上急冷3min。随后加入10μl反转录反应液进行cdna合成，反应条件为30℃10min，42℃ 1h，70℃15min，冰上冷却。反转录反应液如下：
[0048][0049]
4、pcr扩增
[0050]
1)体系配制：使用hs(premix)pcr反应预混合，反应体系如下
[0051][0052]
2)pcr扩增：将加好上述反应液的pcr管置pcr仪中进行pcr扩增，反应条件为 95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃2min30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
[0053]
5、琼脂糖凝胶电泳检测
[0054]
配制1％琼脂糖凝胶，将所获pcr产物分别加入样品孔，150v电泳30min。
[0055]
6、结果判断
[0056]
凝胶成像仪中观察目的条带，目的条带大小符合h5n8亚型流感病毒8个基因片段预期大小时，pcr结果判定为阳性。
[0057]
实施例三：本发明在测定h5n8亚型流感病毒基因组序列及病毒遗传演化分析中的应用举例
[0058]
1、胶回收
[0059]
按照gel extraction kits说明书，将琼脂糖凝胶电泳检测到的目的条带进行回收。
[0060]
2、基因测序
[0061]
将回收的h5n8亚型流感病毒各基因片段按照试剂盒说明书连接pmd18
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t载体，筛选阳性克隆并测序。测序结果利用seqman软件进行拼接。
[0062]
3、遗传演化分析
[0063]
由genbank数据库中筛选h5n8亚型流感病毒的参考序列，并与测序获得的基因序列一起使用mega6.0软件进行比对分析，筛选最佳核苷酸替代模型，并以最大似然法构建个基因的系统发育树，对病毒基因的遗传演化关系进行分析。
[0064]
本发明将rt
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pcr技术应用于h5n8亚型流感病毒的检测、诊断体系、基因组测序以及病毒遗传演化分析中，为其实验室诊断提供了有效的技术手段，为病毒溯源分析以及疫情防控提供依据。
[0065]
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，具体实施方式中所示的也只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
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