一种提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法及应用

1.本发明属于植物生物工程技术领域，尤其涉及一种提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法及应用。


背景技术：

2.目前，由农杆菌介导的、以烟草为媒介的瞬时表达技术是近年来使用最为广范、高效的分析蛋白表达的方法。瞬时表达体系载体携带的基因不需要整合入染色体就可以独立在烟草叶片中表达蛋白，所以不受基因的位置效应和基因沉默的影响，且植物基因组外的游离外源基因也可以表达。同时瞬时表达仅需两至三天就可完成表达。另外，瞬时表达不会产生可遗传的子代，生物安全性高。因此，瞬时转染与稳定转化系统相比，有效率高、周期短、更安全等优势。此外，瞬时表达还有其他用途，如用于基础科学研究的蛋白质亚细胞定位、蛋白质间的互作、转录因子与顺式作用元件的互作、启动子功能等分析以及用于农业和工业生产的生物反应器表达高价值的外源蛋白。
3.具有易表达和高表达等优点的本氏烟草常被用来作为瞬时表达的理想材料。然而，本氏烟草生物量也小且生长缓慢，限制了本氏烟草作为生物反正器的可能。栽培烟草云87生物量大，但外源蛋白难以表达。如果解决了该问题，那么云87烟草就可以在瞬时表达中替代本氏烟草，且弥补了本氏烟草的缺点。
4.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有本氏烟草生物量也小且生长缓慢，用本氏烟表达蛋白时需要种植多株本氏烟，且等待本氏烟生长时间较长，导致实验效率相对低下，限制了本氏烟草作为生物反正器的可能；而栽培烟草云87生物量大，但难以注射菌液，导致植株内的表达载体少，且不易表达外源蛋白，导致云87烟草难以通过瞬时表达的方法来表达外源蛋白。
5.解决以上问题及缺陷的难度为：本氏烟生长速度和生物量很难通过非生物手段改善。因为云87烟草难以注射菌液，所以当使用传统方法注射云87烟草时，需要多次注射，且所需时间较长。
6.解决以上问题及缺陷的意义为：提高了瞬时转染的效率，提高实验效率，并且为云87烟草成为生物反应器提高可能性。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法，尤其涉及一种栽培烟草云87作为生物反应器瞬时表达外源蛋白的方法。
8.本发明是这样实现的，一种提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法，所述提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法包括以下步骤：
9.步骤一，构建带有目的基因的表达载体，转入农杆菌gv3101，得到转基因农杆菌；
10.步骤二，将所述农杆菌利用诱导培养基处理，使农杆菌具有浸染能力，备用；
11.步骤三，选用种植两个月的云87烟草，注射前放置黑暗环境中1h，可提高菌液注射
效率和菌液中的表达载体在云87烟草中的表达效率；
12.步骤四，取出黑暗处理后的烟草，立即注射处理后的步骤一所述农杆菌；
13.步骤五，注射2～5天后即可检测yfp荧光信号或提取蛋白进行western blot检测目的蛋白表达量。
14.进一步，步骤三中，所述云87烟草的种植，包括：
15.(1)选择干燥的云87烟草和本氏烟草种子数颗；
16.(2)将云87烟草和本氏烟草播种在准备好的土壤中，25℃培养2～4周。
17.进一步，步骤(2)中，所述播种所用土壤的配比为：营养土：蛭石：珍珠岩＝1：1：1。
18.进一步，步骤五中，所述目的蛋白表达量的检测方法为通过双分子荧光互补实验验证黑暗处理可促进云87烟草瞬时表达的效率，包括：
19.(1)通过聚合酶链式反应扩增得到pmtr1(at3g05010)和gpa(at2g26300)基因片段后，分别连接进入1300-yfpc、1300-yfpn和1300空白载体获得1300-pmtr1-yfpc、1300-gpa-yfpn和1300-pmtr1载体，将载体转化进入农杆菌gv3101菌株，得到携带质粒的农杆菌；
20.(2)将携带质粒的农杆菌使用带有卡那霉素和庆大霉素的诱导培养基过夜培养；
21.(3)5000g，15min集菌，去除诱导培养基，使用渗透培养基洗3～4次，使用渗透培养基轻轻重悬菌体，最终od600为0.4；
22.(4)室温放置1h后注射烟草，同时把云87烟草提前黑暗处理1h；
23.(5)将1300-pmtr1-yfpc、1300-gpa-yfpn两种菌液等量混合，将混合菌液和1300-pmtr1菌液分别装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶皮下表皮注射到烟草叶片内；
24.(6)注射2～3天后，通过激光共聚焦显微镜检测注射混合菌液烟草叶片的yfp信号，另外取注射过1300-pmtr1菌液的本氏烟草、云87烟草、黑暗处理1h的云87烟草各0.5g叶片提取蛋白，检测蛋白含量。
25.进一步，步骤(2)中，所述卡那霉素为载体携带抗性，所述庆大霉素为农杆菌gv3101携带抗性。
26.进一步，步骤(2)中，所述诱导培养基配方，包括：
27.①
将10.5g/l的k2hpo4，4.5g/l的kh2po4，1.0g/l的(nh4)2so4，0.5g/l的nacitrate：2h2o，以及0.5％的glycerol用水混合后高压灭菌，得体积为96.85ml的混合试剂1；
28.②
将20％的glucose过滤除菌，得1ml终浓度为0.2％的试剂2；
29.③
将1m的mgso4过滤除菌，得100μl终浓度为1mm的试剂3；
30.④
将100mm的acetosyringone过滤除菌，得50μl终浓度为50μl的试剂4；
31.⑤
将0.5m的ph 5.6mes过滤除菌，得2ml终浓度为10mm的试剂5。
32.进一步，步骤(3)中，所述渗透培养基由4.4mg/l ms powder，10mm mes，150μm acetosyringone组成。
33.进一步，步骤(5)中，本氏烟草，云87烟草，黑暗处理1h的云87烟草均需注射液体，注射后烟草叶片会出现润湿现象。
34.本发明的另一目的在于提供一种所述提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法在基础科学研究的蛋白质亚细胞定位、蛋白质间的互作、转录因子与顺式作用元件的互作、启动子功能分析中的应用。该方法具体为：
35.1)通过聚合酶链式反应扩增得到pmtr1和gpa基因片段，然后分别连接进入1300-yfpc、1300-yfpn和1300空白载体获得1300-pmtr1-yfpc、1300-gpa-yfpn和1300-pmtr1载体，将载体转化进入农杆菌gv3101菌株，得到携带质粒的农杆菌；
36.2)将携带质粒的农杆菌使用带有卡那霉素(载体携带抗性)和庆大霉素(农杆菌gv3101携带抗性)的诱导培养基过夜培养；c、5000g，15min集菌，去除诱导培养基，使用渗透培养基(4.4mg/l ms powder，10mm mes，150μmacetosyringone)洗3～4次，使用渗透培养基轻轻重悬菌体，最终od600为0.4。
37.3)室温放置1h后注射烟草，同时把云87烟草提前黑暗处理1h；
38.4)把1300-pmtr1-yfpc、1300-gpa-yfpn两种菌液等量混合，将混合菌液和1300-pmtr1菌液分别装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶皮下表皮注射到烟草叶片内。注意：本氏烟草，云87烟草，黑暗处理1h的云87烟草都需要注射，注射后烟草叶片会出现润湿现象。
39.5)注射2～3天后，通过激光共聚焦显微镜检测注射混合菌液烟草叶片的yfp信号，另外取注射过1300-pmtr1菌液的本氏烟草、云87烟草、黑暗处理1h的云87烟草各0.5g叶片提取蛋白，检测蛋白含量。
40.本发明的另一目的在于提供一种所述提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法在农业和工业生产的生物反应器表达高价值的外源蛋白中的应用，该方法与现有方法相比，降低了实验成本，提高了实验效率，成功率较高，在农业生产和工业生产中具有重要意义。
41.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法，公开了一种烟草瞬时表达的新思路，通过前期处理来解决云87烟草难以注射菌液、蛋白表达量低的缺点，在瞬时表达中，替代本氏烟草的作用，并弥补本氏烟草生物量小的缺点，大大提高瞬时表达的工作效率，为云87作为多种生物反应器提供理论和技术支持。
42.本发明采用黑暗前处理云87植物材料，其外源蛋白瞬时表达效率与模式植物本氏烟草类似。由于云87烟草易存活，生长速度快且生物量大，该方法能很大程度上提高外源蛋白的表达量。本发明种植得到的云87烟草，在外观上来说，同龄的云87烟草叶片比本氏烟草叶片大很多，若云87烟草可替代本氏烟草作为瞬时表达的载体，则可大大提高实验效率。
43.本发明通过双分子荧光互补实验验证黑暗处理可促进云87烟草瞬时表达的效率，如图3-图5所示，黑暗处理对云87烟草的表达效果影响明显，且表现在两方面，一方面黑暗处理后的云87烟草比未黑暗处理的云87烟草更好注射菌液且与本氏烟草相当，另一方面黑暗处理后的云87烟草的表达效率比未黑暗处理的云87烟草高且与本氏烟草相当；黑暗处理对云87烟草作为瞬时转染植物的表达效果有很大的促进作用。
附图说明
44.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
45.图1是本发明实施例提供的提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法流程图。
46.图2是本发明实施例提供的本氏烟草和云87烟草的表型对比图；
47.图中：
①
是本氏烟草，
②
是云87烟草。
48.图3是本发明实施例提供的本氏烟草，云87烟草和黑暗处理后的云87烟草注射农杆菌后的表型图；
49.图中：a图为叶片正面，b图为叶片背面，
①
为本氏烟草，
②
为云87烟草，
③
为黑暗处理一个小时后的云87烟草。
50.图4是本发明实施例提供的本氏烟草，云87烟草和黑暗处理后的云87烟草注射农杆菌后的荧光表达强度图；
51.图中：
①
为本氏烟草，
②
为云87烟草，
③
为黑暗处理一个小时后的云87烟草，a列为明场，b列为荧光图，c列为合并图。
52.图5是本发明实施例提供的本氏烟草，云87烟草和黑暗处理后的云87烟草注射农杆菌后的蛋白表达检测图；
53.图中：a为云87烟草，b为本氏烟草，c为黑暗处理一个小时后的云87烟草。
具体实施方式
54.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
55.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
56.如图1所示，本发明实施例提供的提高栽培烟草云87外源蛋白瞬时表达的方法包括以下步骤：
57.s101，构建带有目的基因的表达载体，转入农杆菌gv3101；
58.s102，将所述农杆菌利用诱导培养基处理后备用；
59.s103，选用种植两个月的云87烟草，注射前放置黑暗环境中1h；
60.s104，取出黑暗处理后的烟草，立即注射处理后的农杆菌；
61.s105，注射2～5天后即可检测yfp荧光信号或提取蛋白进行western blot检测目的蛋白表达量。
62.本发明实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规市购试剂或按常规方法配制的试剂。农杆菌gv3101(购于上海昂羽生物技术有限公司)。
63.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
64.实施例1
65.本发明实施例提供的种植云87烟草，包括如下步骤：
66.a、实验材料为云87烟草和本氏烟草，选择干燥的云87烟草和本氏烟草种子数颗，直接播种；
67.b、播种所用土壤配比为：营养土：蛭石：珍珠岩＝1：1：1；
68.c、将云87烟草和本氏烟草直接播种在准备好的土壤中，25℃培养2～4周。
69.如图2所示，在外观上来说，同龄的云87烟草叶片比本氏烟草叶片大很多，若云87烟草可替代本氏烟草作为瞬时表达的载体，则可大大提高实验效率。
70.实施例2
71.本发明实施例提供的通过双分子荧光互补实验验证黑暗处理可促进云87烟草瞬时表达的效率，包括如下步骤：
72.a、通过聚合酶链式反应扩增得到pmtr1和gpa基因片段，然后分别连接进入1300-yfpc、1300-yfpn和1300空白载体获得1300-pmtr1-yfpc、1300-gpa-yfpn和1300-pmtr1载体，将载体转化进入农杆菌gv3101菌株，得到携带质粒的农杆菌；
73.b、将携带质粒的农杆菌使用带有卡那霉素(载体携带抗性)和庆大霉素(农杆菌gv3101携带抗性)的诱导培养基过夜培养，诱导培养基配方如表1所示。
74.表1诱导培养基配方
[0075][0076][0077]
c、5000g，15min集菌，去除诱导培养基，使用渗透培养基(4.4mg/l ms powder，10mm mes，150μm acetosyringone)洗3～4次，使用渗透培养基轻轻重悬菌体，最终od600为0.4。
[0078]
d、室温放置1h后注射烟草，同时把云87烟草提前黑暗处理1h；
[0079]
e、把1300-pmtr1-yfpc、1300-gpa-yfpn两种菌液等量混合，将混合菌液和1300-pmtr1菌液分别装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶皮下表皮注射到烟草叶片内。注意：本氏烟草，云87烟草，黑暗处理1h的云87烟草都需要注射，注射后烟草叶片会出现润湿现象。
[0080]
f、注射2～3天后，通过激光共聚焦显微镜检测注射混合菌液烟草叶片的yfp信号，另外取注射过1300-pmtr1菌液的本氏烟草、云87烟草、黑暗处理1h的云87烟草各0.5g叶片提取蛋白，检测蛋白含量。
[0081]
如图3-图5所示，黑暗处理对云87烟草的表达效果影响明显，且表现在两方面，一方面黑暗处理后的云87烟草比未黑暗处理的云87烟草更好注射菌液且与本氏烟草相当，另一方面黑暗处理后的云87烟草的表达效率比未黑暗处理的云87烟草高且与本氏烟草相当。黑暗处理对云87烟草作为瞬时转染植物的表达效果有很大的促进作用。
[0082]
如图2所示，
①
是本氏烟草，
②
是云87烟草，在外观上来说，同龄的云87烟草叶片比本氏烟草叶片大很多，若云87烟草可替代本氏烟草作为瞬时表达的载体，则可大大提高实验效率。
①
是本氏烟草，
②
是云87烟草。
[0083]
a图为叶片正面，b图为叶片背面，
①
为本氏烟草，
②
为云87烟草，
③
为黑暗处理一个小时后的云87烟草。
[0084]
①
为本氏烟草，
②
为云87烟草，
③
为黑暗处理一个小时后的云87烟草，a列为明场，b列为荧光图，c列为合并图。
[0085]
a为云87烟草，b为本氏烟草，c为黑暗处理一个小时后的云87烟草。
[0086]
如图3-图5所示，图3中a图为叶片正面，b图为叶片背面，
①
为本氏烟草，
②
为云87烟草，
③
为黑暗处理一个小时后的云87烟草；图4中
①
为本氏烟草，
②
为云87烟草，
③
为黑暗处理一个小时后的云87烟草，a列为明场，b列为荧光图，c列为合并图。图5中a为云87烟草，b为本氏烟草，c为黑暗处理一个小时后的云87烟草。黑暗处理对云87烟草的表达效果影响明显，且表现在两方面，一方面黑暗处理后的云87烟草比未黑暗处理的云87烟草更好注射菌液且与本氏烟草相当，另一方面黑暗处理后的云87烟草的表达效率比未黑暗处理的云87烟草高且与本氏烟草相当。黑暗处理对云87烟草作为瞬时转染植物的表达效果有很大的促进作用。
[0087]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。