一种乙酰羟酸合酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种乙酰羟酸合酶突变体及其应用。

背景技术：

1、现有技术中，支链氨基酸(例如：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)在各种工业应用中用于生产各种产品，例如人类营养增强剂，动物饲料添加剂，医疗产品成分和化妆品等。支链氨基酸的生物合成具有共同的前体物(丙酮酸)和相同的酶(乙酰羟酸合酶)，因此难以通过微生物发酵生物合成单一种类的支链氨基酸。

2、乙酰羟酸合酶是支链氨基酸生物合成的第一个酶，也是支链氨基酸生物合成的关键酶，催化两分子丙酮酸生成乙酰乳酸(乙酰乳酸是缬氨酸和亮氨酸的前体物)，同时也催化a-酮基丁酸和丙酮酸生成a-乙酰羟基丁酸(a-乙酰羟基丁酸是异亮氨酸的前体物)。因此，乙酰羟酸合酶是支链氨基酸生物合成非常重要的酶。

3、乙酰羟酸合酶由两个亚基组成，分别是大亚基ilvb蛋白和小亚基ilvn蛋白。大亚基ilvb蛋白由ilvb基因编码，具有催化活性；小亚基ilvn蛋白由ilvn基因编码，起到反馈抑制的调控作用，受缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的反馈抑制。

4、支链氨基酸的生产方法有三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现工业化生产。微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产支链氨基酸最主要的方法。但因菌种的发酵性能仍较差，副产物较高，导致其转化率仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种乙酰羟酸合酶突变体及其应用。

2、第一方面，本发明提供一种乙酰羟酸合酶突变体，所述乙酰羟酸合酶突变体为乙酰羟酸合酶的氨基酸序列中第17位由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸得到。

3、ilvn基因编码的乙酰羟酸合酶是支链氨基酸生物合成的第一个酶，也是支链氨基酸生物合成的关键酶，催化两分子丙酮酸生成乙酰乳酸(乙酰乳酸是缬氨酸和亮氨酸的前体物)，同时也催化a-酮基丁酸和丙酮酸生成a-乙酰羟基丁酸(a-乙酰羟基丁酸是异亮氨酸的前体物)。本发明通过对ilvn基因修饰，将乙酰羟酸合酶的第17位氨基酸由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸，实现了对乙酰羟酸合酶的突变，使得所述微生物产副产物缬氨酸和亮氨酸的能力下降，产异亮氨酸的能力与未修饰的菌株相比增强，最终提高了异亮氨酸的产量。

4、进一步地，所述乙酰羟酸合酶的氨基酸序列包括如seq id no.1所示的序列(突变后的氨基酸序列如seq id no.3-5所示)。

5、本发明进一步提供用于编码所述乙酰羟酸合酶突变体的核酸。

6、第二方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶中第17位由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。

7、进一步地，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶包括如se id no.3-5任一所示的氨基酸序列。

8、进一步地，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶由如seq id no.6-8任一所示的核苷酸序列编码得到。

9、进一步地，所述重组微生物以棒杆菌为出发菌株；优选以谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种为出发菌株。

10、进一步地，所述重组微生物中还包括表达水平提高的ppc基因和/或gnd基因。例如通过在位点cg1507处整合以ptac为启动子的ppc基因可以强化ppc基因的表达，将gnd基因的原有启动子替换为强启动子ptac，以强化gnd基因的表达。

11、其中，ppc基因编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸、hco3-和h2o生成草酰乙酸，从而增加异亮氨酸生物合成的前体草酰乙酸的供应，达到提高异亮氨酸产量的目的。

12、gnd基因编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，催化6-磷酸-d-葡萄糖酸和nadp+生成5-磷酸-d-核酮糖和nadph，从而增强还原力nadph的供应，达到提高异亮氨酸产量的目的。

13、本发明进一步提供所述乙酰羟酸合酶突变体或所述核酸在提高菌株氨基酸产量中的应用。

14、进一步地，所述菌株为谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种；所述氨基酸为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的一种或多种。

15、进一步地，所述应用为提高菌株主要氨基酸产物的产量，降低其副产物的产量，例如提高异亮氨酸的产量，降低亮氨酸和缬氨酸的产量。

16、本发明进一步提供所述重组微生物在生产氨基酸中的应用；优选地，所述氨基酸为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的一种或多种。

17、本发明具备如下有益效果：

18、本发明提供了一种乙酰羟酸合酶突变体，针对乙酰羟酸合酶第17位氨基酸发生多种类型的突变，将该突变体应用于菌株中时，发现乙酰羟酸合酶第17位氨基酸由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸时，其生产支链氨基酸的效率显著提高，具体表现为主要氨基酸产物的产量大幅度提高，副产物大幅下降。

19、具体地，乙酰羟酸合酶突变菌株2-ilvnd17l、2-ilvnd17v、2-ilvnd17a的异亮氨酸产量和转化率较出发菌株显著提高，且副产物缬氨酸和亮氨酸产量大幅下降，菌株的生长正常，仍能够保持较好的生长性能。其中，乙酰羟酸合酶突变菌株2-ilvnd17a表现最为突出，异亮氨酸产量为5.6g/l，比出发菌株产量提高3.0g/l，提高了115％；副产物缬氨酸产量为3.1g/l，较出发菌株亮氨酸产量下降46.5％；副产物亮氨酸产量为1.5g/l，较出发菌株亮氨酸产量下降50％。因此可以看出，当乙酰羟酸合酶第17位氨基酸由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸后，异亮氨酸产量均有提升，缬氨酸、亮氨酸产量均有下降，尤其以天冬氨酸突变为亮氨酸后效果最好。

20、本发明进一步发现，在乙酰羟酸合酶突变体的基础上，叠加ppc基因增强的突变菌株，以及叠加ppc基因和gnd基因共同增加的突变菌株，异亮氨酸的产量进一步得到增加，尤其以突变菌株2-ilvnd17a/ppc/gnd(乙酰羟酸合酶突变体2-ilvnd17a叠加ppc基因和gnd基因)效果最佳，异亮氨酸产量为10.3g/l，比出发菌株产量提高7.7g/l，提高了近3倍；副产物缬氨酸产量为0.6g/l，较出发菌株亮氨酸产量下降89.6％；副产物亮氨酸产量为1.9g/l，较出发菌株亮氨酸产量下降36.7％。

技术特征：

1.一种乙酰羟酸合酶突变体，其特征在于，所述乙酰羟酸合酶突变体为乙酰羟酸合酶的氨基酸序列中第17位由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸得到。

2.根据权利要求1所述的乙酰羟酸合酶突变体，其特征在于，所述乙酰羟酸合酶的氨基酸序列包括如seq id no.1所示的序列。

3.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码权利要求1或2所述的乙酰羟酸合酶突变体。

4.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶中第17位由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。

5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶包括如se id no.3-5任一所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中的乙酰羟酸合酶由如seq id no.6-8任一所示的核苷酸序列编码得到。

7.根据权利要求4-6任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物以棒杆菌为出发菌株；优选以谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌或黄色短杆菌中的一种或多种为出发菌株。

8.根据权利要求4-7任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中还包括强化表达的ppc基因和/或gnd基因。

9.权利要求1或2所述的乙酰羟酸合酶突变体、或权利要求3所述核酸在提高菌株氨基酸产量中的应用；

10.权利要求4-7任一项所述的重组微生物在生产氨基酸中的应用；优选地，所述氨基酸为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的一种或多种。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种乙酰羟酸合酶突变体及其应用。所述乙酰羟酸合酶突变体为乙酰羟酸合酶的氨基酸序列中第17位由天冬氨酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸得到。本发明提供了乙酰羟酸合酶第17位氨基酸的多种突变方式，并进一步发现菌株中乙酰羟酸合酶的这些第17位氨基酸突变为亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸后，其在生产支链氨基酸的效率显著提高，具体表现为主要氨基酸产物的产量大幅度提高，副产物大幅下降，这在提高菌株生产支链氨基酸的领域具有重要意义。

技术研发人员：吴涛,张晓云,栾明月,薛婷莉,李鑫磊,胡丹,赵津津,李岩
受保护的技术使用者：冯波
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15