一种抗体或Fc融合蛋白的纯化方法与流程

一种抗体或fc融合蛋白的纯化方法
技术领域
1.本公开属于生物工程领域，具体涉及一种使用蛋白a亲和层析纯化抗体或fc融合蛋白的方法。
技术背景
2.抗体类药物是目前最有前景的生物技术药物，具有靶向性好、特异性强、毒副作用小等优点，主要用于恶性肿瘤和自身免疫性等疾病治疗。全球单抗的市场规模持续增大，已成为各国生物制药的竞争焦点。
3.近年来，国内制药企业也纷纷加速布局抗体类药物。抗体类药物作为生物大分子，研发的技术难度大，研发周期长。但抗体类药物市场需求和激烈竞争迫使各企业必须加快抗体药物的研发速度和缩短研发周期。加快细胞株筛选和细胞培养工艺的优化，成为其中非常重要的环节。细胞株筛选和细胞培养工艺的优化，需要纯化出足量的高纯度样品用于产品质量的分析检测，从而评估细胞株和细胞培养工艺是否能满足要求。
4.现有技术中，对于细胞株筛选和细胞培养工艺的样品纯化，通常采用mabselect sure、mabselect sure lx、amsphere或是prosep ultra plus(pup)等填料的层析柱进行样品制备。采用上述填料进行样品制备存在以下问题：1)动态载量对保留时间敏感，不太适合高流速操作；2)洗脱ph通常较低，容易造成产品性质改变，造成检测结果不能反应样品的真实质量。中国专利cn201811332123.x所报道的一种蛋白a亲和层析法纯化抗体的方法所采用的填料为mabselect sure lx、amsphere a3或praesto jetted 50，采用的洗脱液ph较低，为3.0-3.5。中国专利cn201910457014.9报道的采用protein a亲和层析纯化纳米抗体药物的方法采用jsr amsphere亲和层析填料纯化纳米抗体，采用的洗脱缓冲液为ph 3.5的0.05-0.2m甘氨酸溶液，洗脱ph也较低。cn201910182809.3报道的亲和层析采用millipore pup填料进行抗pd-1抗体纯化，其洗脱液的目标ph低至3.0。何凌冰等(中国生物工程杂志，2015，35(12)：72-77)报道过低的洗脱ph容易造成产品聚体的升高。同时，上述亲和填料对动态载量对保留时间比较敏感，通常推荐的保留时间为3～6分钟，因此导致亲和层析操作流速相对较低，工艺时间较长。按照上述保留时间，一个完整的样品制备大约需要75～150分钟。此外，像mabselect sure lx和praesto jetted 50以琼脂糖为基质的填料，基质的机械强度较低，最大耐压3bar，不适合进行高流速操作。一般亲和洗脱的样品，需要加碱中和ph，繁琐且容易增加样品电导，干扰iec-hplc分析检测。
5.因此，本领域亟需一种方便快捷且洗脱条件温和的抗体样品纯化方法。


技术实现要素：

6.本公开提供一种使用蛋白a亲和层析纯化抗体或fc融合蛋白的方法，其特征在于，所使用的洗脱缓冲液的ph为4.0至5.0。
7.一些实施方案中，洗脱缓冲液的ph为约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0。
8.一些实施方案中，洗脱缓冲液的ph大于4.0，小于等于5.0。
9.一些实施方案中，洗脱缓冲液的ph大于4.0，至5.0之间。
10.一些实施方案中，蛋白a亲和层析所使用的填料选自unimab 50、unimab hc、unimab pro。一些具体实施方案中，蛋白a亲和层析所使用的填料为unimab 50。
11.一些实施方案中，所述洗脱缓冲液选自枸橼酸缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸缓冲液。
12.一些具体实施方案中，所述枸橼酸缓冲液的浓度选自10mm至30mm，例如约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm，醋酸缓冲液的浓度选自30mm至70mm，例如约30mm、约40mm、约50mm、约60mm、约70mm。
13.一些实施方案中，所述枸橼酸缓冲液的浓度为约20mm，醋酸缓冲液的浓度为约50mm。
14.一些实施方案中，所述使用蛋白a亲和层析纯化抗体或fc融合蛋白的方法包含如下的一项或多项步骤：
15.1)用平衡缓冲液平衡亲和层析柱；
16.2)将含有抗体或fc融合蛋白的细胞澄清液上样到亲和层析柱；
17.3)用平衡缓冲液冲洗亲和层析柱；
18.4)用洗涤缓冲液冲洗亲和层析柱；
19.5)用平衡缓冲液冲洗亲和层析柱；
20.6)用洗脱缓冲液洗脱抗体或fc融合蛋白并收集洗脱组分；
21.7)用再生缓冲液冲洗亲和层析柱进行亲和柱再生。
22.一些实施方案中，所述步骤1)、3)、5)中的平衡缓冲液选自磷酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、tris-hac缓冲液，或添加有氯化钠的磷酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、tris-hac缓冲液。
23.一些具体实施方案中，所述平衡缓冲液的ph为6.5至8.5，例如约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5。所述平衡缓冲液为5至30mm(例如，约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm)的磷酸缓冲液、20至80mm(例如，约20mm、约30mm、约40mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80nm)的tris-hcl缓冲液、20至80mm(例如，约20mm、约30mm、约40mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80nm)的tris-hac缓冲液，或添加有50至250mm(例如，约50mm、约100mm、约150mm、约200mm、约250mm)的氯化钠的上述缓冲液。
24.一些具体实施方案中，所述平衡缓冲液选自ph为7.0至8.0的约20mm的磷酸缓冲液、约50mm的tris-hcl缓冲液、约50mm的tris-hac缓冲液，或添加有约150mm的氯化钠的上述缓冲液。
25.一些实施方案中，所述步骤4)中的洗涤缓冲液选自磷酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、tris-hac缓冲液，或添加有氯化钠的磷酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、tris-hac缓冲液；
26.一些具体实施方案中，所述洗涤缓冲液的ph为5.0至10.0，例如约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0。所述洗涤缓冲液为5至30mm(例如，约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm)的磷酸缓冲液、20至80mm(例如，约20mm、约30mm、约40mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80nm)的tris-hcl缓冲液、20至80mm(例
如，约20mm、约30mm、约40mm、约50mm、约60mm、约70mm、约80nm)的tris-hac缓冲液，或添加有0.5至2m(例如，约0.5m、约1m、约1.5m、约2m)的氯化钠的上述缓冲液。
27.一些具体实施方案中，所述洗涤缓冲液选自ph为6.0至9.0的约20mm的磷酸缓冲液、约50mm的tris-hcl缓冲液、约50mm的tris-hac缓冲液，或添加有约1m的氯化钠的上述缓冲液。
28.一些实施方案中，所述步骤7)中的再生缓冲液选自枸橼酸或醋酸缓冲液。
29.一些具体实施方案中，所述再生缓冲液选自0.01至0.5m(例如约0.01m、约0.05m、约0.1m、约0.15m、约0.2m、约0.3m、约0.4m、约0.5m)枸橼酸或0.1至2m醋酸(例如约0.1m、约0.5m、约1m、约1.5m、约2m)。
30.一些具体实施方案中,所述再生缓冲液选自约0.1m枸橼酸或约1m醋酸。
31.一些实施方案中，步骤1)-7)中的流速为1至20ml/min，例如1ml/min、2ml/min、3ml/min、4ml/min、5ml/min、6ml/min、7ml/min、8ml/min、9ml/min、10ml/min、11ml/min、12ml/min、13ml/min、14ml/min、15ml/min、20ml/min。
32.一些具体实施方案中，步骤1)-7)中的流速为5至10ml/min。
33.一些实施方案中，步骤1)、3)-7)中平衡或冲洗亲和层析柱的缓冲液为1至20倍(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20倍)柱体积，一些具体实施方案中，为3至10倍柱体积。
34.一些实施方案中，提供使用蛋白a亲和层析法纯化抗体或fc融合蛋白的方法，所使用的蛋白a填料为unimab 50，包括如下步骤：
35.1)用平衡缓冲液平衡亲和层析柱；
36.2)将含有抗体或fc融合蛋白的细胞澄清液上样到亲和层析柱；
37.3)用平衡缓冲液冲洗亲和层析柱；
38.4)用洗涤缓冲液冲洗亲和层析柱；
39.5)用平衡缓冲液冲洗亲和层析柱；
40.6)用洗脱缓冲液洗脱抗体或fc融合蛋白并收集洗脱组分。
41.可选地，可进一步包含步骤7)用再生缓冲液冲洗亲和层析柱进行亲和柱再生。
42.具体实施方案一中，其中
43.步骤1)的平衡缓冲液为ph约为7.0的约20mm磷酸缓冲液；
44.步骤3)的平衡缓冲液为ph约为7.0的约20mm磷酸缓冲液；
45.步骤4)的洗涤缓冲液为ph约为6.0的约20mm磷酸缓冲液，其中添加约1m的nacl；
46.步骤5)的平衡缓冲液为ph约为7.0的约20mm磷酸缓冲液；
47.步骤6)的洗脱缓冲液为ph约为4.0的约20mm枸橼酸缓冲液；
48.可选地，可进一步包含步骤7)，其中再生缓冲液为0.1m枸橼酸；
49.可选地，步骤1)-6)中流速为5ml/min，和/或步骤7)中流速为5ml/min；
50.可选地，步骤1)中平衡亲和层析柱的缓冲液为10倍柱体积，步骤3)-5)中平衡或冲洗亲和层析柱的缓冲液为3倍柱体积，和/或步骤7)中冲洗亲和层析柱的缓冲液为3倍柱体积；
51.可选地，所述方案中所纯化的抗体或fc融合蛋白为抗pd-1抗体，所述抗pd-1抗体包含如seq id no:19所示的轻链和seq id no:18所示的重链。
52.具体实施方案二中，其中
53.步骤1)的平衡缓冲液为ph约为7.9的约50mm tris-hac；
54.步骤3)的平衡缓冲液为ph约为7.6的约50mm tris-hcl，其中添加约150mm的nacl；
55.步骤4)的洗涤缓冲液为ph约为7.6的约50mm tris-hac，其中添加约1m的nacl；
56.步骤5)的平衡缓冲液为ph约为7.9的约50mm tris-hac；
57.步骤6)的洗脱缓冲液为ph约为4.3的约50mm醋酸缓冲液；
58.可选地，可进一步包含步骤7)，其中再生缓冲液为约1m醋酸；
59.可选地，步骤1)-6)中流速为7ml/min，和/或步骤7)中流速为7ml/min；
60.可选地，步骤1)和3)-5)中平衡或冲洗亲和层析柱的缓冲液为6倍柱体积，和/或步骤7)中冲洗亲和层析柱的缓冲液为6倍柱体积；
61.可选地，所述方案中所纯化的抗体或fc融合蛋白为抗pd-1抗体，所述抗pd-1抗体包含如seq id no:19所示的轻链和seq id no:18所示的重链。
62.具体实施方案三中，其中
63.步骤1)的平衡缓冲液为ph约为7.6的约50mm tris-hcl，其中添加约150mm的nacl；
64.步骤3)的平衡缓冲液为ph约为7.6的约50mm tris-hcl，其中添加约150mm的nacl；
65.步骤4)的洗涤缓冲液为ph约为7.0的约50mm tris-hcl，其中添加约1m的nacl；
66.步骤5)的平衡缓冲液为ph约为7.6的约50mm tris-hcl，其中添加约150mm的nacl；
67.步骤6)的洗脱缓冲液为ph约为4.2的约50mm醋酸缓冲液；
68.可选地，可进一步包含步骤7)，其中再生缓冲液为0.1m枸橼酸；
69.可选地，步骤1)-6)中流速为8ml/min，和/或步骤7)中流速为8ml/min；
70.可选地，步骤1)和3)-5)中平衡或冲洗亲和层析柱的缓冲液为4倍柱体积，和/或步骤7)中冲洗亲和层析柱的缓冲液为4倍柱体积；
71.可选地，所述方案中所纯化的抗体或fc融合蛋白为抗pd-l1抗体，所述抗pd-l1抗体包含如seq id no:10所示的轻链和seq id no:9所示的重链。
72.具体实施方案四中，其中
73.步骤1)的平衡缓冲液为ph约为7.1的约50mm tris-hac，其中添加约150mm的nacl；
74.步骤3)的平衡缓冲液为ph约为7.1的约50mm tris-hac，其中添加约150mm的nacl；
75.步骤4)的洗涤缓冲液为ph约为7.9的约50mm tris-hac，其中添加约1m的nacl；
76.步骤5)的平衡缓冲液为ph约为7.1的约50mm tris-hac，其中添加约150mm的nacl；
77.步骤6)的洗脱缓冲液为ph约为4.5的约50mm醋酸缓冲液；
78.可选地，可进一步包含步骤7)，其中再生缓冲液为约1m醋酸；
79.可选地，步骤1)-6)中流速为5ml/min，和/或步骤7)中流速为5ml/min；
80.可选地，步骤1)中平衡亲和层析柱的缓冲液为5倍柱体积，步骤3)中冲洗亲和层析柱的缓冲液为3倍柱体积，步骤4)-5)中平衡或冲洗亲和层析柱的缓冲液为4倍柱体积，和/或步骤7)中冲洗亲和层析柱的缓冲液为4倍柱体积；
81.可选地，所述方案中所纯化的抗体或fc融合蛋白为抗pd-l1抗体，所述抗pd-l1抗体包含如seq id no:10所示的轻链和seq id no:9所示的重链。
82.具体实施方案五中，其中
83.步骤1)的平衡缓冲液为ph约为8.0的约20mm磷酸缓冲液，其中添加约150mm的
nacl；
84.步骤3)的平衡缓冲液为ph约为8.0的约20mm磷酸缓冲液，其中添加约150mm的nacl；
85.步骤4)的洗涤缓冲液为ph约为9.0的约50mm tris-hcl，其中添加约1m的nacl；
86.步骤5)的平衡缓冲液为ph约为8.0的约20mm磷酸缓冲液，其中添加约150mm的nacl；
87.步骤6)的洗脱缓冲液为ph约为5.0的约50mm醋酸缓冲液；
88.可选地，可进一步包含步骤7)，其中再生缓冲液为约1m醋酸；
89.可选地，步骤1)-6)中流速为10ml/min，和/或步骤7)中流速为10ml/min；
90.可选地，步骤1)和3)-5)中平衡冲洗亲和层析柱的缓冲液为3倍柱体积，和/或步骤7)中冲洗亲和层析柱的缓冲液为3倍柱体积；
91.可选地，所述方案中所纯化的抗体或fc融合蛋白为抗pd-l1抗体与tgfβrii胞外区的融合蛋白，其包含如seq id no:10所示的轻链和seq id no:11所示的重链。
92.具体实施方案六中，其中
93.步骤1)的平衡缓冲液为ph约为7.4的约50mm tris-hcl；
94.步骤3)的平衡缓冲液为ph约为7.4的约50mm tris-hcl；
95.步骤4)的洗涤缓冲液为ph约为8.0的约50mm tris-hac，其中添加约1m的nacl；
96.步骤5)的平衡缓冲液为ph约为7.4的约50mm tris-hcl；
97.步骤6)的洗脱缓冲液为ph约为4.5的约50mm醋酸缓冲液；
98.可选地，可进一步包含步骤7)，其中再生缓冲液为约1m醋酸；
99.可选地，步骤1)-6)中流速为7ml/min，和/或步骤7)中流速为7ml/min；
100.可选地，步骤1)和3)-5)中平衡或冲洗亲和层析柱的缓冲液为5倍柱体积，和/或步骤7)中冲洗亲和层析柱的缓冲液为5倍柱体积；
101.可选地，所述方案中所纯化的抗体或fc融合蛋白为抗pd-l1抗体与tgfβrii胞外区的融合蛋白，其包含如seq id no:10所示的轻链和seq id no:11所示的重链。
102.具体实施方案七中，其中
103.步骤1)的平衡缓冲液为ph约为8.0的约20mm磷酸缓冲液；
104.步骤3)的平衡缓冲液为ph约为8.0的约20mm磷酸缓冲液；
105.步骤4)的洗涤缓冲液为ph约为6.5的约20mm磷酸缓冲液，其中添加约1m的nacl；
106.步骤5)的平衡缓冲液为ph约为8.0的约20mm磷酸缓冲液；
107.步骤6)的洗脱缓冲液为ph约为4.0的约50mm醋酸缓冲液；
108.可选地，可进一步包含步骤7)，其中再生缓冲液为约1m醋酸；
109.可选地，步骤2)和步骤6)中流速为5ml/min，步骤1)和步骤3)-5)中流速为10ml/min，和/或步骤7)中流速为10ml/min；
110.可选地，步骤1)和步骤5)中平衡或冲洗亲和层析柱的缓冲液为4倍柱体积，步骤3)-4)中平衡或冲洗亲和层析柱的缓冲液为3倍柱体积，和/或步骤7)中冲洗亲和层析柱的缓冲液为5倍柱体积；
111.可选地，所述方案中所纯化的抗体或fc融合蛋白为抗pd-l1抗体与tgfβrii胞外区的融合蛋白，其包含如seq id no:10所示的轻链和seq id no:11所示的重链。
112.具体实施方案八中，将具体实施方案七中步骤7)的再生缓冲液由1m醋酸替换成0.1m枸橼酸。
113.一些具体实施方案中，前述具体实施方案一中，步骤6)中洗脱缓冲液可由约20mm枸橼酸缓冲液替换为约50mm醋酸缓冲液；可选地，步骤6)中洗脱缓冲液ph为4.0至5.0。
114.一些具体实施方案中，前述具体实施方案二至八中，步骤6)中洗脱缓冲液可由约50mm醋酸缓冲液替换为约20mm枸橼酸缓冲液；可选地，步骤6)中洗脱缓冲液ph为4.0至5.0。
115.一些具体实施方案中，前述具体实施方案一和三中，步骤7)中再生缓冲液可由约0.1m枸橼酸替换成约1m醋酸。
116.一些具体实施方案中，前述具体实施方案二、四至六中，步骤7)中再生缓冲液可由约1m醋酸替换成约0.1m枸橼酸。
117.一些具体实施方案中，其中
118.步骤1)、3)和5)的平衡缓冲液为5mm至30mm磷酸缓冲液，ph为7.0至8.0；
119.步骤4)的洗涤缓冲液为5mm至30mm磷酸缓冲液，ph为6.0至9.0，其中添加约1m的nacl；
120.步骤6)的洗脱缓冲液为约20mm枸橼酸缓冲液或约50mm醋酸缓冲液，ph为4.0至5.0；
121.可选地，可进一步包含步骤7)，其中再生缓冲液为约0.1m枸橼酸或约1m的醋酸；
122.可选地，步骤1)、3)和5)可进一步添加约150mm的nacl；
123.可选地，步骤1)-7)中的流速为5ml/min至10ml/min；
124.可选地，步骤1)-7)中平衡或冲洗亲和层析柱的缓冲液为3至10倍柱体积；
125.可选地，所述方案中所纯化的抗体选自：包含如seq id no:19所示的轻链和seq id no:18所示的重链的抗pd-1抗体，或包含如seq id no:10所示的轻链和seq id no:9所示的重链的抗pd-l1抗体；所述方案中所纯化的fc融合蛋白为抗pd-l1抗体与tgfβrii胞外区的融合蛋白，其包含如seq id no:10所示的轻链和seq id no:11所示的重链。
126.一些具体实施方案中，其中
127.步骤1)、3)和5)的平衡缓冲液为约20mm磷酸缓冲液，ph为7.0至8.0；
128.步骤4)的洗涤缓冲液为约20mm磷酸缓冲液，ph为6.0至9.0，其中添加约1m的nacl；
129.步骤6)的洗脱缓冲液为10mm至30mm枸橼酸缓冲液或30mm至70mm醋酸缓冲液，ph为4.0至5.0；
130.可选地，可进一步包含步骤7)，其中再生缓冲液为约0.1m枸橼酸或约1m的醋酸；
131.可选地，步骤1)、3)和5)可进一步添加约150mm的nacl；
132.可选地，步骤1)-7)中的流速为5ml/min至10ml/min；
133.可选地，步骤1)-7)中平衡或冲洗亲和层析柱的缓冲液为3至10倍柱体积；
134.可选地，所述方案中所纯化的抗体选自：包含如seq id no:19所示的轻链和seq id no:18所示的重链的抗pd-1抗体，或包含如seq id no:10所示的轻链和seq id no:9所示的重链的抗pd-l1抗体；所述方案中所纯化的fc融合蛋白为抗pd-l1抗体与tgfβrii胞外区的融合蛋白，其包含如seq id no:10所示的轻链和seq id no:11所示的重链。
135.一些具体实施方案中，其中
136.步骤1)、3)和5)的平衡缓冲液为约20mm磷酸缓冲液，ph为7.0至8.0；
137.步骤4)的洗涤缓冲液为约20mm磷酸缓冲液，ph为6.0至9.0，其中添加约1m的nacl；
138.步骤6)的洗脱缓冲液为约20mm枸橼酸缓冲液或约50mm醋酸缓冲液，ph为4.0至5.0；
139.可选地，可进一步包含步骤7)，其中再生缓冲液为0.01m至0.5m的枸橼酸或0.1m至2m的醋酸；
140.可选地，步骤1)、3)和5)可进一步添加约150mm的nacl；
141.可选地，步骤1)-7)中的流速为5ml/min至10ml/min；
142.可选地，步骤1)-7)中平衡或冲洗亲和层析柱的缓冲液为3至10倍柱体积；
143.可选地，所述方案中所纯化的抗体选自：包含如seq id no:19所示的轻链和seq id no:18所示的重链的抗pd-1抗体，或包含如seq id no:10所示的轻链和seq id no:9所示的重链的抗pd-l1抗体；所述方案中所纯化的fc融合蛋白为抗pd-l1抗体与tgfβrii胞外区的融合蛋白，其包含如seq id no:10所示的轻链和seq id no:11所示的重链。
144.一些具体实施方案中，前述具体实施方案中步骤1)、3)-5)的平衡或洗涤缓冲液可由约20mm磷酸缓冲液替换成20mm至80mm的tris-hcl缓冲液。具体地，可替换成约50mm的tris-hcl缓冲液。
145.一些具体实施方案中，前述具体实施方案中步骤1)、3)-5)的平衡或洗涤缓冲液可由约20mm磷酸缓冲液替换成20mm至80mm的tris-hac缓冲液。具体地，可替换成约50mm的tris-hac缓冲液。
146.一些实施方案中，本公开的抗体或fc融合蛋白靶向抗原或蛋白，所述抗原或蛋白可以选自：血管内皮生长因子(vegf)；ox-ldl；ox-apob100；肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素a-链；胰岛素b-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；高血糖素；凝固因子，例如因子viiic、因子ix、组织因子、和(冯)维勒布兰德(von willebrand)氏因子；抗凝固因子，例如蛋白c；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原活化剂，例如尿激酶或人尿型或组织型纤溶酶原激活剂(t-pa)；林蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；rantes(活化时受到调节，正常情况由t-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(mip-1-α)；血清清蛋白，例如人血清清蛋白；穆勒(muellerian)抑制性物质；松弛素a-链；松弛素b-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶；dna酶；ige；抑制素；活化素；激素或生长因子的受体；蛋白a或d；类风湿因子；神经营养因子，例如骨衍生神经营养因子(bdnf)、神经营养蛋白-3、-4、-5、或-6(nt-3、nt-4、nt-5、或nt-6)，或神经生长因子，例如ngf-β；血小板衍生生长因子(pdgf)；成纤维细胞生长因子，例如afgf和bfgf；表皮生长因子(egf)；转化生长因子(tgf)，例如tgf-α和tgf-β，包括tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4、或tgf-β5；胰岛素样生长因子-i和-ii(igf-i和igf-ii)；des(1-3)-igf-i(脑igf-i)，胰岛素样生长因子结合蛋白；cd蛋白，例如cd3、cd4、cd8、cd19和cd20；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白(bmp)；干扰素，例如干扰素-α、-β、和-γ；集落刺激因子(csf)，例如m-csf、gm-csf、和g-csf；白介素(il)，例如il-1至il-10；超氧化物歧化酶；t细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如aids被膜的一部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，例如cd11a、cd11b、cd11c、cd18、icam、vla-4和vcam；肿瘤相关抗原，例如her2、her3或her4受体；免疫点蛋白，例如b7家族分子、ctla-4、
pd-1、pd-l1、pd-1-pd-l1、pd-1-pd-l2、吲哚胺2,3-二加氧酶(ido)、il-10、t细胞免疫球蛋白及黏蛋白3(tim3或havcr2)、半乳糖凝集素9-tim3、磷脂醯丝胺酸-tim3、淋巴球活化基因3蛋白、mhc ii类-lag3、41bb、41bbl、ox40-ox40l、gitr、gitrl-gitr、cd25、cd27、cd70-cd27、tnfrsf25、tnfrsf25-tl1a、cd40l、cd40、hvem-light-lta、hvem、hvem-btla、hvem-cd160、hvem-light、hvem-btla-cd160、cd80、cd80-pd-l1、pdl2-cd80、cd244、cd48-cd244、cd244、icos、icos-icosl、b7 h3、b7 h4、vista、tmigd2、hhla2-tmigd2、嗜乳脂蛋白(包括btnl2)、siglec家族、tigit及pvr家族成员、kirs、ilts及lirs、nkg2d及nkg2a、mica及micb、cd244、cd28、cd86-cd28、cd86-ctla、cd80-cd28、cd39、cd73腺苷-cd39-cd73、cxcr4-cxcl12、磷脂醯丝胺酸、tim3、磷脂醯丝胺酸-tim3、sirpa-cd47、cd79、garp、gitr、psma、神经纤毛蛋白(neuropilin)、cd160、cd30及cd155；和任何以上多肽的片段。
147.一些实施方案中，本公开的抗体或fc融合蛋白为低ph敏感的。
148.一些实施方案中，本公开的抗体为单克隆抗体。一些具体实施方案中，本公开的抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、骆驼抗体。一些具体实施方案中，本公开的抗体为全长抗体。
149.一些具体实施方案中，本公开的抗体为贝伐单抗或其变体。例如，所述变体的重链或重链可变区较之贝伐单抗的重链或重链可变区具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链或轻链可变区较之贝伐单抗的轻链或轻链可变区具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。
150.一些具体实施方案中，本公开的抗体为抗pd-l1抗体。在一些具体实施方案中，所述抗pd-l1抗体的重链cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列如seq id no：1-3所示，轻链cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列如seq id no：4-6所示；重链可变区氨基酸序列如seq id no：7所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no：8所示；重链氨基酸序列如seq id no：9所示，轻链氨基酸序列如seq id no：10所示。抗pd-l1抗体可以为变体，在一些实施方案中，变体的重链cdr 1-3分别与seq id no：1-3具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链cdr1、cdr2、cdr3分别与seq id no：4-6具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链可变区与seq id no：7具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链可变区与seq id no：8具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链与seq id no：9具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链与seq id no：10具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链cdr 1较之seq id no：1有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链cdr 2较之seq id no：2有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链cdr 3较之seq id no：3有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链cdr 1较之seq id no：4有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链cdr 2较之seq id no：5有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链cdr 3较之seq id no：6有4、3、2、1个氨基酸突变。
151.表1.抗pd-l1抗体的cdr序列
no：1-3具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链cdr1、cdr2、cdr3分别与seq id no：4-6具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链可变区与seq id no：7具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链可变区与seq id no：8具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链与seq id no：11具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链与seq id no：10具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链cdr 1较之seq id no：1有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链cdr 2较之seq id no：2有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链cdr 3较之seq id no：3有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链cdr 1较之seq id no：4有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链cdr 2较之seq id no：5有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链cdr 3较之seq id no：6有4、3、2、1个氨基酸突变。
170.抗pd-l1抗体与tgfβrii胞外区的的融合蛋白的序列信息如下。
171.融合蛋白重链：
172.qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewmgrigpnsgftsynekfknrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycarggssydyfdywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgaavkfpqlckfcdvrfstcdnqkscmsncsitsicekpqevcvavwrkndenitletvchdpklpyhdfiledaaspkcimkekkkpgetffmcscssdecndniifseeyntsnpd
173.(其中，单下划线为抗pd-l1抗体的重链可变区，双下划线为连接子)
174.seq id no：11融合蛋白轻链：氨基酸序列如seq id no：10所示。
175.一些具体实施方案中，本公开的抗体为抗pd-1抗体。在一些具体实施方案中，所述抗pd-1抗体的重链cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列如seq id no：12-14所示，轻链cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列如seq id no：15-17所示；重链氨基酸序列如seq id no：18所示，轻链氨基酸序列如seq id no：19所示。抗pd-1抗体可以为变体，变体的重链cdr 1-3分别与seq id no：12-14具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链cdr1、cdr2、cdr3分别与seq id no：15-17具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链可变区与seq id no：18中的重链可变区具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链可变区与seq id no：19的轻链可变区具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链与seq id no：18具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性，和/或轻链与seq id no：19具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，变体的重链cdr 1较之seq id no：12有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链cdr 2较之seq id no：13有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或重链cdr 3较之seq id no：14有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链cdr 1较之seq id no：15有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链cdr 2较之seq id no：16有4、3、2、1个氨基酸突变；和/或轻链cdr 3较之seq id no：17有4、3、2、1个氨基酸突变。
176.表2.抗pd-1抗体的cdr序列
[0177][0178]
抗pd-1抗体的重链：
[0179]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssymmswvrqapgkglewvatisgggantyypdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarqlyyfdywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0180]
seq id no：18
[0181]
抗pd-1抗体的轻链：
[0182]
diqmtqspsslsasvgdrvtitclasqtigtwltwyqqkpgkapklliytatsladgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqvysipwtfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0183]
seq id no：19
[0184]
本公开中的抗体编码规则均采用kabat规则。
[0185]
本公开提供一种抗体或fc融合蛋白的纯化方法，尤其适用于上游工艺开发的快速样品制备。本公开的方法充分利用unimab(例如unimab 50)填料亲和层析填料的高特异性、耐压(最大8bar)、耐高流速、载量受流速影响小和洗脱条件温和的优点，通过一步蛋白a亲和层析柱快速纯化，从抗体工艺开发过程中的细胞培养澄清液制备得到足量可用于分析检测的高纯度蛋白样品。本公开的方法通过提高流速，使得单个样品制备时间可以缩短至10～40分钟。本公开纯化方法的优点在于：操作简便，速度快，洗脱条件温和，获得的样品稳定性好且纯度高，洗脱样品无需进行碱中和，减少电导对iec-hplc等检测干扰。
附图说明
[0186]
图1：实施例1的unimab 50填料亲和层析制备的抗体样品的sec-hplc谱图，单体纯度为97.1％。
[0187]
图2：实施例1的unimab 50填料亲和层析制备的抗体样品的iec-hplc谱图，主峰纯度为73.3％。
[0188]
图3：实施例1的unimab 50填料亲和层析制备的抗体样品的nr-ce谱图，主峰纯度97.3％。
[0189]
发明详述
[0190]
术语
[0191]
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
[0192]
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如j.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
[0193]
本公开中的“抗体”涵盖“免疫球蛋白”，包括但不限于人抗体(或重组人抗体)、鼠源抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体。
[0194]“免疫球蛋白”是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即igm、igd、igg、iga和ige，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如igg可分为igg1、igg2、igg3、igg4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类ig中第每类ig都可以有κ链或λ链。抗体重链和轻链靠近n端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(v区)；靠近c端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(c区)。可变区包括3个高变区(hvr)和4个序列相对保守的骨架区(fr)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(cdr)。每条轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)由3个cdr区4个fr区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。轻链的3个cdr区指lcdr1，lcdr2，和lcdr3；重链的3个cdr区指hcdr1，hcdr2和hcdr3。本公开的抗体还涵盖多价抗体(例如，双、多特异性抗体)。以及，本公开的抗体可以和任意的多肽、药物通过共价、非共价键连接。
[0195]“人抗体”或“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，所涉及的技术和方法在本领域中是熟知的，诸如：
[0196]
(1)从人免疫球蛋白基因的转基因、转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；
[0197]
(2)从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；
[0198]
(3)从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及
[0199]
(4)通过将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他dna序列等方法制备、表达、创建或分离的抗体。
[0200]
此类重组人抗体包含可变区和恒定区，这些区域利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但也包括随后诸如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。
[0201]“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的针对抗原或其表位的单克隆抗体。制备时用抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个具体的实施方案中，所述的鼠源抗抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源igg1、igg2、igg3或igg4或其变体的重链恒定区。
[0202]“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本公开的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括这样的抗体，即其中
已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的cdr序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗体”)。
[0203]“人源化抗体(humanized antibody)”也称为cdr移植抗体(cdr-grafted antibody)，是指将小鼠的cdr序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应。为避免在免疫原性下降的同时引起活性的下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。
[0204]“嵌合抗体(chimeric antibody)”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。人抗体的恒定区可选自人源igg1、igg2、igg3或igg4或其变体的重链恒定区，优选包含人源igg2或igg4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无adcc(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的igg1。
[0205]“缓冲液”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受ph变化的缓冲液。将ph控制在适当范围中的缓冲液的例子包括醋酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸、草酸盐、乳酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液。
[0206]“组氨酸缓冲液”是包含组氨酸离子的缓冲液。组氨酸缓冲液的示例包括组氨酸-盐酸，组氨酸-醋酸，组氨酸-磷酸盐，组氨酸-硫酸盐等缓冲液，优选组氨酸-盐酸缓冲液。组氨酸-醋酸缓冲液是组氨酸与醋酸或组氨酸与组氨酸-醋酸盐配制而成。
[0207]“柠檬酸(盐)缓冲液”是包括柠檬酸根离子的缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的示例包括柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-柠檬酸钾、柠檬酸-柠檬酸钙、柠檬酸-柠檬酸镁等。优选的柠檬酸盐缓冲液是柠檬酸-柠檬酸钠。
[0208]“琥珀酸(盐)缓冲液”是包括琥珀酸盐离子的缓冲液。琥珀酸盐盐缓冲液的示例包括琥珀酸盐-琥珀酸盐、琥珀酸盐-琥珀酸盐钾、琥珀酸盐-琥珀酸盐钙盐等。优选的琥珀酸盐盐缓冲液是琥珀酸盐-琥珀酸盐。
[0209]“醋酸(盐)缓冲液”是包括醋酸根离子的缓冲液。醋酸盐缓冲液的示例包括醋酸-醋酸钠、醋酸组氨酸盐、醋酸-醋酸钾、醋酸醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。优选的醋酸盐缓冲液是醋酸-醋酸钠。
[0210]
本公开所用术语“约”或“基本上包含”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，“约”或“基本上包含”可意味着至多10％的范围。除非另外说明，否则当具体值在本技术和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
具体实施方式
[0211]
以下结合实施例进一步描述，但所述实施例并非限制的范围。
[0212]
实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当
代分子生物学方法，ausubel等著，greene出版协会，wiley interscience，ny。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
[0213]
实施例1
[0214]
用装有1ml unimab 50填料(购于苏州纳微科技公司)的亲和层析柱，采用20mm磷酸缓冲液(ph7.0)在5ml/min的流速下平衡亲和层析柱10倍柱体积，将5ml含抗pd-1抗体的细胞澄清液以5ml/min流速上样到亲和层析柱上。20mm磷酸缓冲液(ph7.0)在5ml/min的流速下冲洗亲和层析柱3倍柱体积，20mm磷酸缓冲液+1m nacl(ph6.0)在5ml/min的流速下继续冲洗亲和层析柱3倍柱体积，20mm磷酸缓冲液(ph7.0)在5ml/min的流速下冲洗亲和层析柱3倍柱体积。采用20mm枸橼酸缓冲液(ph4.0)在5ml/min的流速下进行产品洗脱并收集洗脱组分。接着用0.1m枸橼酸在5ml/min的流速下冲洗亲和层析柱3倍柱体积进行亲和柱再生。最终得到3ml蛋白样品，其sec-hplc谱图如图1所示，sec纯度为97.1％。iec-hplc谱图如图2所示，主峰纯度为73.3％。nr-ce谱图如图3所示，主峰纯度97.3％。工艺运行时间为10分钟。
[0215]
上述抗体为抗pd-1抗体，其轻链、重链序列分别如seq id no:19、18所示。
[0216]
实施例2
[0217]
用装有7ml unimab 50填料的亲和层析柱，采用50mm tris-hac(ph7.9)在7ml/min的流速下平衡亲和层析柱6倍柱体积，将15ml含实施例1中抗pd-1抗体的细胞澄清液以7ml/min流速上样到亲和层析柱上。50mm tris-hcl+150mm nacl(ph7.6)在7ml/min的流速下冲洗亲和层析柱6倍柱体积，50mm tris-hac+1m nacl(ph7.6)在7ml/min的流速下继续冲洗亲和层析柱6倍柱体积，50mm tris-hac(ph7.9)在7ml/min的流速下冲洗亲和层析柱6倍柱体积。采用50mm醋酸缓冲液(ph4.3)在7ml/min的流速下进行产品洗脱并收集洗脱组分。接着用1m醋酸在7ml/min的流速下冲洗亲和层析柱6倍柱体积进行亲和柱再生。最终得到7ml蛋白样品，sec纯度为97.0％。工艺运行时间为40分钟。
[0218]
实施例3
[0219]
用装有8ml unimab 50填料的亲和层析柱，采用50mm tris-hcl+150mm nacl(ph7.6)在8ml/min的流速下平衡亲和层析柱4倍柱体积，将25ml含抗pd-l1抗体的细胞澄清液以8ml/min流速上样到亲和层析柱上。50mm tris-hcl+150mm nacl(ph7.6)在8ml/min的流速下冲洗亲和层析柱4倍柱体积，50mm tris-hcl+1m nacl(ph7.0)在8ml/min的流速下继续冲洗亲和层析柱4倍柱体积，50mm tris-hcl+150mm nacl(ph7.6)在8ml/min的流速下冲洗亲和层析柱4倍柱体积。采用50mm醋酸缓冲液(ph4.2)在8ml/min的流速下进行产品洗脱并收集洗脱组分。接着用0.1m枸橼酸在8ml/min的流速下冲洗亲和层析柱4倍柱体积进行亲和柱再生。最终得到10ml蛋白样品，sec纯度为98.0％。工艺运行时间为27分钟。
[0220]
上述抗pd-l1抗体的轻链、重链全长序列分别如seq id no:10、9所示。
[0221]
实施例4
[0222]
用装有6.5ml unimab 50填料的亲和层析柱，采用50mm tris-hac+150mm nacl(ph7.1)在5ml/min的流速下平衡亲和层析柱5倍柱体积，将10ml含实施例3中抗pd-l1抗体的细胞澄清液以5ml/min流速上样到亲和层析柱上。50mm tris-hac+150mm nacl(ph7.1)在5ml/min的流速下冲洗亲和层析柱3倍柱体积，50mm tris-hac+1m nacl(ph7.9)在5ml/min的流速下继续冲洗亲和层析柱4倍柱体积，50mm tris-hac+150mm nacl(ph7.1)在5ml/min
的流速下冲洗亲和层析柱4倍柱体积。采用50mm醋酸缓冲液(ph4.5)在5ml/min的流速下进行产品洗脱并收集洗脱组分。接着用1m醋酸在5ml/min的流速下冲洗亲和层析柱4倍柱体积进行亲和柱再生。最终得到10ml蛋白样品，sec纯度为97.5％。工艺运行时间为30分钟。
[0223]
实施例5
[0224]
用装有10ml unimab 50填料的亲和层析柱，采用20mm磷酸缓冲液+150mm nacl(ph8.0)在10ml/min的流速下平衡亲和层析柱3倍柱体积，将50ml含fc融合蛋白的细胞澄清液，以10ml/min流速上样到亲和层析柱上。20mm磷酸缓冲液+150mm nacl(ph8.0)在10ml/min的流速下冲洗亲和层析柱3倍柱体积，50mm tris-hcl+1m nacl(ph9.0)在10ml/min的流速下继续冲洗亲和层析柱3倍柱体积，20mm磷酸缓冲液+150mm nacl(ph8.0)在10ml/min的流速下冲洗亲和层析柱3倍柱体积。采用50mm醋酸缓冲液(ph5.0)在10ml/min的流速下进行产品洗脱并收集洗脱组分。接着用1m醋酸在10ml/min的流速下冲洗亲和层析柱3倍柱体积进行亲和柱再生。最终得到15ml蛋白样品，sec纯度为97.5％。工艺运行时间为20分钟。
[0225]
上述fc融合蛋白为抗pd-l1抗体与tgfβ的融合蛋白，其轻链和重链序列分别如seq id no：10、11所示。
[0226]
实施例6
[0227]
用装有5ml unimab 50填料的亲和层析柱，采用50mm tris-hcl(ph7.4)在7ml/min的流速下平衡亲和层析柱5倍柱体积，将25ml含实施例5中fc融合蛋白的细胞澄清液以7ml/min流速上样到亲和层析柱上。50mm tris-hcl(ph7.4)在7ml/min的流速下冲洗亲和层析柱5倍柱体积，50mm tris-hac+1mnacl(ph8.0)在7ml/min的流速下继续冲洗亲和层析柱5倍柱体积，50mm tris-hcl(ph7.4)在7ml/min的流速下冲洗亲和层析柱5倍柱体积。采用50mm醋酸缓冲液(ph4.5)在7ml/min的流速下进行产品洗脱并收集洗脱组分。接着用1m醋酸在7ml/min的流速下冲洗亲和层析柱5倍柱体积进行亲和柱再生。最终得到10ml蛋白样品，sec纯度为98.0％。工艺运行时间为25分钟。
[0228]
实施例7
[0229]
用装有4.5ml unimab 50填料的亲和层析柱，采用20mm磷酸缓冲液(ph8.0)在10ml/min的流速下平衡亲和层析柱4倍柱体积，将16ml含实施例5中fc融合蛋白的细胞澄清液以5ml/min流速上样到亲和层析柱上。20mm磷酸缓冲液(ph8.0)在10ml/min的流速下冲洗亲和层析柱3倍柱体积，20mm磷酸缓冲液+1m nacl(ph6.5)在10ml/min的流速下继续冲洗亲和层析柱3倍柱体积，20mm磷酸缓冲液(ph8.0)在10ml/min的流速下冲洗亲和层析柱4倍柱体积。采用50mm醋酸缓冲液(ph4.0)在5ml/min的流速下进行产品洗脱并收集洗脱组分。接着用1m醋酸在10ml/min的流速下冲洗亲和层析柱5倍柱体积进行亲和柱再生。最终得到9ml蛋白样品，sec纯度为96.3％。工艺运行时间为12分钟。
[0230]
实施例8
[0231]
用装有3.5ml unimab 50填料的亲和层析柱，采用20mm磷酸缓冲液(ph8.0)在10ml/min的流速下平衡亲和层析柱4倍柱体积，将16ml含实施例5中fc融合蛋白的细胞澄清液以5ml/min流速上样到亲和层析柱上。20mm磷酸缓冲液(ph8.0)在10ml/min的流速下冲洗亲和层析柱3倍柱体积，20mm磷酸缓冲液+1m nacl(ph6.5)在10ml/min的流速下继续冲洗亲和层析柱3倍柱体积，20mm磷酸缓冲液(ph8.0)在10ml/min的流速下冲洗亲和层析柱4倍柱体积。采用50mm醋酸缓冲液(ph4.0)在5ml/min的流速下进行产品洗脱并收集洗脱组分。接
着用0.1m枸橼酸在10ml/min的流速下冲洗亲和层析柱5倍柱体积进行亲和柱再生。最终得到9ml蛋白样品，sec纯度为96.3％。工艺运行时间为12分钟。
[0232]
对比例：
[0233]
用装有18ml prosep ultra plus的亲和层析柱，采用20mm磷酸缓冲液(ph8.0)在3ml/min的流速下平衡亲和层析柱4倍柱体积，将16ml含实施例5中fc融合蛋白的细胞澄清液以3ml/min流速上样到亲和层析柱上。20mm磷酸缓冲液(ph8.0)在10ml/min的流速下冲洗亲和层析柱3倍柱体积，20mm磷酸缓冲液+1m氯化钠(ph6.5)在3ml/min的流速下继续冲洗亲和层析柱3倍柱体积，20mm磷酸缓冲液(ph8.0)在3ml/min的流速下冲洗亲和层析柱4倍柱体积。采用20mm柠檬酸缓冲液(ph3.0)在3ml/min的流速下进行产品洗脱并收集洗脱组分。接着用0.1m枸橼酸在3ml/min的流速下冲洗亲和层析柱5倍柱体积进行亲和柱再生。最终得到20ml蛋白样品，sec纯度为93.5％。工艺运行时间为120分钟。