细菌基因组绝缘位点的鉴定方法及应用

1.本发明涉及微生物合成生物学领域，具体地指一种细菌基因组绝缘位点的鉴定方法及应用。
背景技术：
：：2.合成生物学作为新兴交叉学科，综合基因工程，生物化学，系统生物学，计算机生物学等领域技术，用于活载体的编辑与重构，以赋予其特定的生理功能。随着基因组学，蛋白组学，代谢组学和表型组学理论的丰富和相关技术的发展，调节和重构宿主基因表达，精确设计目的基因表达线路以创造不同功能活细胞已成为合成生物学主要目标。其中，微生物细胞因其较为简单的遗传背景和成熟的编辑技术成为了“活工厂”的首选，为了活体生物治疗领域提供了良好的底盘。3.因此基于微生物合成生物学的发展，人们在尝试寻找新的治疗大分子的同时，也通过一系列编辑技术来定向改造一些工程菌株实现大分子的活体递送，尤其是针对肠道益生菌大肠杆菌nissle1917(ecn)及乳酸杆菌(lab)的编辑改造，其安全性已被证明，但自身治疗效果有限，需要利用合成生物学的手段拓宽其功能和应用价值。已有研究证明，乳酸杆菌lab引入分泌表达的il-10可以有效赋予其治疗炎症性肠炎(ibd)功能，编辑ecn基因组，多拷贝表达递送苯丙氨酸氨基裂解酶可治疗苯丙酮尿症，调控ecn精氨酸代谢途径可以显著提升高血氨小鼠的存活率，目前这些菌株都已进入临床测试期。除此以外，使用ecn递送基质纤维治疗肠粘膜损伤，利用群体感应系统控制ecn表达抑制病原菌的基因线路,借助大肠杆菌递呈特异性抗原激发黏膜免疫等，这些工程菌株的改造大部分都基于质粒表达外源蛋白，但是通过质粒承载活性分子的方式存在两大重要风险，即质粒在体内发挥功能的不稳定性和抗性基因对宏观环境所造成的威胁，因此使用基因组表达外源片段在维持遗传稳定及生物安全方面更符合生物活性载体的编辑准则。4.将外源片段插入基因组可以减轻细菌代谢负担，但会造成蛋白表达的削弱，且在很大程度上影响细菌其他基因的转录水平，甚至改变细菌本身的特性。为此，有研究用转座子文库的方式鉴定到e.colimg1655基因组上存在三个绝缘的“着陆垫”(landingpads)，psts/glms,thic/rsd,ytha/fece，为常用工程菌株e.colimg1655的改造提供较好的整合位点，但是这一方法搜寻的绝缘位点是否适用于其他菌株暂无报道。目前关于ecn的改造常选取malek,malpt,yics/nepi等作为外源基因插入位点，这些位点大都位于操纵子内部，已有部分证据表明将基因插入这些位点对于细菌整体转录组水平影响较大，其安全性和适用性目前还有待研究。因此，发掘并建立一套新型搜寻细菌基因组上绝缘位点的方法，对微生物后续在合成生物学领域的改造和应用具有重要意义。技术实现要素：5.本发明的目的是探索并鉴定合成生物学领域常用工程菌株基因组上可用于外源基因的插入的绝缘位点，以扩展其在合成生物学中的应用价值。基于细菌基因的保守性和细菌转录终止的共性特征，本发明在一些实施方式中，可以选择大肠杆菌e.colimg1655，e.colidh5ɑ；e.colidh10β，e.colibl21(de3)等工业常用菌株，还可以选择乳酸乳球菌(lactococcuslactis)，双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)，脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)，凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)，嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)等益生性菌株。6.为实现上述目的，本发明提供了一种细菌基因组绝缘位点的鉴定方法，所述细菌基因组绝缘位点是基因组内转录水平较低且不影响或较小影响周围基因表达的区域，该方法的步骤为：利用生物学方法测定待测位点的两端均具有转录强终止子且两个所述转录强终止子的末端相对，即鉴定为绝缘位点。7.上述方案中，细菌可以是大肠杆菌等任意一种细菌，不限于前述举例的菌种，其中优选益生性大肠杆菌(escherichiacoli)nissle1917。8.优选地，所述绝缘位点为大肠杆菌中位于uspg和aphf基因中间的序列。9.上述方案中，所述绝缘位点对应的序列转录成mrna二级结构符合转录终止子特征。生物信息学方法分析mrna转录终止子二级结构为发夹结构且强转录终止子符合发夹结构后紧接5个以上连续u核苷酸的特征。10.举例来说，上述鉴定方法可以通过如下步骤实现：11.(1)首先利用靶向细菌菌株现有转录组数据进行可视化统计，寻找表达几乎不随条件变化的无转录区域。本发明中，我们以益生菌ecn为例，在其基因组中找到一处无转录区位于基因uspg(seq.id.no:003)和ahpf(seq.id.no:004)之间(图1)，并提供该区域在基因组上的序列信息seq.id.no:001；12.(2)确定基因组上无转录区域后，进一步通过rna二级结构预测软件搜寻具备绝缘表达位点特征的序列区域，即位点两端具备朝向绝缘位点的转录强终止子结构。例如本发明阐述的ecn中高度绝缘位点(highly-insulatedsite1,his-1)两端均具有明显的转录终止子结构(图2)，并提供其具体的位置信息和序列信息(seq.id.no:005)；13.(3)筛选到符合条件的绝缘位点后，使用基因编辑手段对该位点进行编辑改造，插入包含启动子、编码区、转录终止子区的外源基因片段，后通过表型验证和转录组学验证绝缘位点表达外源基因对细菌本身生理功能和基因表达的影响。本发明具体实施方式中以在ecn的his-1表达假丝酵母来源的尿酸氧化酶基因为例，利用生长表型和转录组分析等证明该策略可以实现外源基因的绝缘表达；14.(4)能够在外源插入基因绝缘表达的基础上进行功能性高表达，为拓展细菌成为合成生物学领域的底盘提供合理改造策略。本发明具体实施方式中，提供了一株在益生菌ecnhis-1位点表达假丝酵母来源的尿酸氧化酶基因的改造菌ecnua，已证实其在体外具备降解尿酸的功能。15.本发明还提供了一种制备重组细菌的方法，将外源基因插入到细菌的绝缘位点，使外源基因表达不影响细菌其他基因的表达；所述绝缘位点为两端均具有转录强终止子且两个所述转录强终止子的末端相对的位点。16.上述方案中，绝缘位点可位于细菌染色体上或质粒上。插入的外源基因可以是任意基因，但该基因需自带启动子、编码基因、转录终止子等基本元件，保证外源基因正常表达。优选表达尿酸氧化酶等代谢相关基因，满足seq.id.no:002序列特征。外源基因表达不影响细菌其他基因的表达的验证主要体现在引入外源基因后细菌的表型和转录组学等分析不会表现出整体的明显差异。17.同样上述方案中的细菌可选为大肠杆菌、乳酸乳球菌，双歧杆菌，脆弱拟杆菌，凝结芽孢杆菌或嗜热链球菌，但不限于以上几种。优选地，所述细菌为大肠杆菌。更优选地，所述绝缘位点为大肠杆菌中位于uspg和aphf基因中间的序列。18.可选地，所述外源基因的引入方式选自同源重组交换，crispr基因编辑，噬菌体转导。优选同源重组、crispr基因编辑等不会引入抗性基因的技术。19.本发明还提供了一种重组细菌，包含上述绝缘位点及插入到所述绝缘位点的外源基因。20.本发明还揭示了上述细菌基因组绝缘位点的鉴定方法在细菌基因编辑技术中的应用。21.本发明的有益效果：22.通过细菌基因组绝缘位点的发掘策略与应用，实现了将外源基因插入到细菌绝缘表达位点，使外源基因表达不影响细菌其他基因的表达。为益生性大肠杆菌ecn等细菌用于整合基因线路的改造及应用提供新思路。附图说明23.图1为不同条件下his-1位点附近区域转录及位置信息显示。24.图2为his-1双侧终止子二级结构预测结果。25.图3为his-1位点外源表达尿酸氧化酶结果。26.图4为改造菌株ecnua生长曲线。27.图5为改造菌株ecnua杀菌表型结果。28.图6为改造菌株ecnua与未改造菌株转录组比较结果。29.图7为改造菌株ecnua中外源基因插入对his-1周围基因转录的影响分析。具体实施方式30.以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。31.本发明优先提出一种寻找细菌基因组上转录绝缘位点的方法，原核细菌基因组是连续的，且转录背景研究较为清晰，因此使用细菌相关转录组数据搜寻基因组上转录绝缘位点的方法具备通用性。本实施例中优选益生性大肠杆菌ecn作为研究对象，采用了生物信息学的手段对ecn相关转录组数据进行分析，搜寻到一处转录水平较低的着陆垫，对其周围基因表达情况进行统计并使用rna二级结构预测软件发现其内部存在天然双终止子结构，建立了一套寻找基因组绝缘位点的方法。随后在该位点引入外源基因，通过转录组数据和体外酶活实验证实了目的基因实现功能性表达,且该位点具备高度绝缘性，对细菌整体转录影响非常小，同时针对改造菌株的表征分析证明其基础特性不受改变并实现特定功能，该位点的发现为遗传改造ecn在合成生物学领域的应用提供借鉴。32.以下实施例中首要针对益生性大肠杆菌ecn相关的转录组数据进行分析。在一些实施例中，转录组文库的构建条件可以是环境压力变化，也可以是涉及特定基因过表达或敲除的变化。33.通过分析ecn在不同条件下的转录组变化情况，筛选在各种条件下均的无明显转录的区域，并定义该区域为“转录绝缘区”(seq.id.no:001)；34.敲定转录绝缘区域后，使用rna二级结构在线预测软件(mfold)对该序列进行预测，确定该区域中存在两个自然的终止子t1和t2，位于uspg和ahpf基因3’端，序列信息分别是seq.id.no:003和seq.id.no:004，结构如图2所示。定义t1与t2之间的8bp序列定义为高度绝缘位点(highly-insulatedsite,his-1)，序列信息为seq.id.no:005；35.在his-1位点插入外源基因uricase，序列信息为seq.id.no:002，获得重组菌株ecnua以验证该位点的绝缘性。在一些实施方式中，可以通过基因工程技术(包括同源重组、基因编辑等)将外源基因整合到肠道益生菌基因组中。36.实施例中改造菌株的表型测定是通过生长曲线反应。在一些实施例中，细菌表型的鉴定是通过细菌菌落形态反应，还可以借助显微镜反应细菌微观结构形态的变化反应。37.通过比较ecnua与ecn转录组数据以分析该位点表达外源基因后对细菌全局性基因的影响，结果显示改造菌株的绝大部分基因的表达与ecn野生型一致，呈良好线性关系，说明该位点基因的插入并未对细菌其基因造成影响，绝缘性较高。38.还通过体外酶促动力学曲线验证改造菌株ecnua可以高表达外源基因uricase并有较好功能。在一些实施例中，目的基因的表达可以通过荧光定量pcr反应从mrna水平检测，还可以通过westernblot检测蛋白表达水平。39.上述实验过程提供了益生性大肠杆菌ecn基因组上一处可用于外源遗传线路整合的绝缘位点his-1，并获得了一株改造重组菌株ecnua证实该位点的绝缘性和实用性，为ecn的遗传改造和应用提供借鉴。40.实施例141.利用细菌相关转录组数据分析基因组上的无转录区域42.原核细菌的基因组是连续的，且基因之间的调控作用网络是复杂变化的，因此用合成生物学手段将目的基因片段引入底盘基因组需规避外源基因对宿主菌造成干扰。细菌的转录组数据可直观的反应细菌基因组不同位置的转录活跃水平，因此可以作为寻找基因组转录绝缘位点的依据。本实施例中，我们以益生性大肠杆菌ecn为研究对象，调取ncbisequencereadarchive(sra)数据库中ecn相关的转录组数据:err:2983261,srr:11357513,srr:6658275,srr:9994133，使用r(v3.2.2)可视化分析这些转录组中不同基因在各自条件下的转录水平，在方向相反的两个基因uspg(seq.id.no:003)和ahpf(seq.id.no:004)终止密码子后发现一处无转录区域(图1)，初步分析其可能为ecn基因组上的外源基因绝缘表达的插入位点(seq.id.no:001)。43.实施例中所使用的相关软件：44.ncbisradatabase：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra45.转录组数据分析使用r(v3.2.2)46.实施例247.无转录区域周围双终止子结构的发现与绝缘表达位点的鉴定48.实施例1中我们发现的“转录绝缘区”(seq.id.no:001)可能存在某些特殊元件导致其转录绝缘，因此在本实施例中，我们首先使用rna二级结构在线预测软件(mfold)对该序列进行分析，结果显示序列中存在两个基因组上自然的终止子结构t1(seq.id.no:003)和t2(seq.id.no:004)，t1负责uspg的转录终止，t2负责ahpf的转录终止(图2)，此类双终止子结构可提供一个天然的“转录绝缘区”，作为遗传改造的整合位点，且这一天然结构在原核细菌基因组中具有普适性(precisiondesignofstablegeneticcircuitscarriedinhighly-insulatede.coligenomiclandingpads.molsystbiol16,e9584(2020)。t1与t2之间存在8bp的间隔序列(seq.id.no:005)，我们将该序列定义为高绝缘位点(highly-insulatedsite1,his-1)49.实施例中所使用的相关软件：50.mfold：http://www.unafold.org/51.实施例352.肠道益生菌ecn基因组his-1位点整合外源基因uricase的构建53.本实施例中，构建结合转移自杀质粒pdm4携带假丝酵母来源的ua编码基因(seq.id.no:002)，基因上游引入人工优化的强启动子p6(seq.id.no:006)，基因下游添加强终止子rrnbt(seq.id.no:007)，利用同源重组方式将上述元件敲入整合至大肠杆菌ecn基因组上his-1位点(图4)，获得重组菌株ecnua。54.具体实施步骤如下：55.1.构建携带温敏质粒pkd46(amp)的ecn菌株。将pkd46质粒(one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa.2000,97,6640-6645)通过电转仪(eppdorffelectroporator2510)电转ecn，30℃培养，得到携带amp抗性的ecn菌株。56.2.pdm4-uam构建。以pdm4自杀质粒(flagellinaisessentialforthevirulenceofvibrioanguillarum.jbacteriol.1996,178,1310-1319)为出发载体，构建重组质粒pdm4-uam质粒,携带uricase及his-1上下游同源臂各750bp。57.3.ecnua菌株构建。将pdm4-uam质粒通过接合转移的方法导入到转化有pkd46质粒的ecn菌，涂布到amp+cm双抗lb平板，30℃培养过夜获得单交换菌株。单交换克隆通过划线至无盐lb+10％蔗糖平板，40℃培养，获得去除了pkd46质粒的双交换突变体命名为ecnua。58.实施例中所使用的培养基和试剂：59.lb培养基：60.在1l的蒸馏水中加入61.蛋白胨：10g(oxoid货号lp0042)；62.nacl:10g(国药货号7647-14-5)；63.酵母粉：5g(oxoid货号lp0021)，64.121度高压灭菌20分钟。65.蔗糖(国药货号57-50-1)66.氨苄amp(上海源叶生物技术有限公司货号69-52-3)67.氯霉素cm(biobasicinc货号56-75-7)68.实施例469.改造菌株ecnua生长等表型测试结果70.实施例3中，我们使用同源重组技术在his-1位点无痕插入外源基因尿酸氧化酶基因。本实施例中，通过测定生长曲线反应改造菌株ecnua的表型变化。71.挑取ecn和ecnua单克隆一式三份于lb无抗液体中过夜培养。1：100接种至新鲜lb中37℃培养基，在特定时间点取样测定od600。结果显示，改造菌株ecnua与未改造菌株相比生长无差异(图4)，证实his-1位点的改造对细菌生长表型不造成影响。72.除了生长表型的验证以外，我们也针对ecn特有的表型，靶杀鼠伤寒沙门氏菌lt2做了表型验证。首先转化ecn及ecnua携带有kan抗性的质粒，转化lt2以cm抗性质粒，挑取转化子单克隆于lb对应抗性液体中过夜培养。1：100接种至新鲜lb抗性液体中，补充0.2mmdip模拟低铁环境，于37℃培养过夜。再转接约103cfu菌至100μl新鲜dmem/f12低铁培养基中，做单独培养及共培养组合，另做一份补充1μmfe(iii)作为对照，共培养8h后，10倍梯度稀释，于各自抗性筛选平板进行计数点斑。结果显示，低铁条件下，ecnua与ecn野生型表型一致，均展现出良好的杀菌活性(图5)，说明his-1位点整合外源基因对ecn杀菌特性也无影响。73.实施例中所使用的培养基和试剂：74.lb培养基如同实施例3；75.氯霉素cm(biobasicinc货号56-75-7)76.卡那霉素kan(安耐吉化学，货号25389-94-0)77.dip(sigma，货号112246-73-8)78.dmem/f12(thermofisher,货号11320033)79.酶标仪(biotek)80.实施例581.改造益生菌ecnuarna-seq分析82.为了分析his-1位点引入外源基因表达后对细菌转录层面的影响，我们构建了ecn与ecnua的转录组文库用于分析his-1的绝缘性。具体实施过程如下：83.1.挑取ecn和ecnua单克隆菌落一式三份于无抗lb液体中培养过夜，按照1：100接种至4ml新鲜lb中培养2.5h，37℃，200rpm；84.2.5000rpm，5min收集4ml菌，去除上清，按照说明书步骤使用trizol提取样品rna，使用ribo-offrrnadepletionkit试剂盒去除rrna，使用ultratmdirectionalrnalibraryprepkit试剂盒进行建库，步骤参考说明书，样品测序使用illuminahiseqx平台，转录组数据分析使用r(v3.2.2)。85.转录组分析结果显示，相比于未改造菌株，his-1位点插入的uricase具有较高表达水平，同时将ecnua与ecn整体转录水平做比较发现，ecnua转录组中除了少数几个基因表达水平发生明显变化以外，ecn整体基因的转录均不受影响(图6)，外源基因的插入并未影响his-1位点上下游基因uspg和ahpf的转录水平(图7)，证明his-1的确具备高度绝缘性，适用于外源基因的绝缘整合。86.实施例中所使用的培养基和试剂：87.lb培养基如同实施例3；88.trizol(invitrogen，货号15596018)89.ribo-offrrnadepletionkit(vazyme，货号n407-01)90.ultratmdirectionalrnalibraryprepkit(neb，货号e7420l)。当前第1页12当前第1页12