一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法与流程

1.本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法。


背景技术：

2.间充质干细胞(msc)是用于细胞治疗的候选者，在大多数情况下，治疗反应显示出具有细胞剂量依赖性。大多数应用针对msc介导的组织修复或免疫调节，在许多应用中与自体msc细胞相比，同种异体msc更具有经济优势，可以从单一组织来源大规模制备大量细胞制剂用于更多的患者。人类足月胎盘组织富含msc，是一种物理上很大的组织，通常在胎儿出生后被丢弃。胎盘是大规模生产多细胞剂量的同种异体msc的理想起始材料。
3.在msc细胞疗法的发展过程历史中，临床前和临床研究起初使用骨髓来源的msc。(1)骨髓通常从志愿者捐献的髂嵴获得，这个过程是侵入性的，通过一次穿刺仅能收集少量的骨髓(20ml)。(2)基于此产生具有临床应用意义的msc需要长时间的体外扩增。细胞效力在扩增过程中随着第三代(p3)细胞传代而降低，从而产生了一个悖论，即临床疗效所需的理论细胞数量随着细胞数量的扩大而增加。相比于骨髓抽吸物，足月胎盘是体积较大的起始组织(通常为500～750g)，可以在剖宫产期间进行无菌采集，对供体没有风险。同时，(1)源于胎盘的msc具有长期增殖和免疫调节能力，优于骨髓来源的msc。(2)一个足月胎盘含有足够的msc，可用于制备多达7000次临床应用剂量。这些特性使得胎盘成为制备同种异体msc的理想组织来源。
4.胎盘是一种胎儿母体器官，由胎儿和母体组织组成，因此理论上可以分离出胎儿或母体来源的msc。胎盘本身主要由胎儿血管和成为滋养层的分泌和支持细胞组成，构成被绒毛膜板覆盖的绒毛膜绒毛。分枝的胎盘绒毛浸在从子宫螺旋动脉输送的母血中，保证胎儿和母亲之间进行营养、激素和气体交换。胎盘通过母体蜕膜基质细胞固定在子宫内膜上，胎儿绒毛外滋养层散布在细胞外基质中，绒毛会聚在胎儿绒毛膜板上，形成脐带。
5.(1)对于胎盘msc的分离和表征需要进行标准化操作以确保用于临床细胞制剂制备工艺的稳定，同时(2)由于操作人员对于胎盘解刨结构、不同组织位置处理、msc的分离手段的差异以及培养体系的不同，并不能从胎盘组织中获得目标数量的msc。目前并没有一种方法能够有效获得可用于临床治疗用的大量的胎盘来源间充质干细胞。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法。本发明所述优化培养基能够最大限度地提高胎盘来源msc体外扩增效率并减少批次间细胞的差异，在更短的时间范围内达到临床相关的细胞数量，从而减少培养基消耗，降低大规模细胞制备及生产成本，多代次均能保持较好的表型一致性和三系分化潜能。
7.本发明提供了一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基，所述培养基包括：
基础培养基、血清替代物和补充剂；所述基础培养基包括dmem-low glucose、l-谷氨酰胺和β-巯基乙醇；所述血清替代物包括knockout
tm
血清替代物；所述补充剂包括重组人fgf2蛋白、重组人fgf4蛋白、重组人pdgf ab蛋白、重组人egf蛋白、重组人vegf 165a蛋白、重组人hgf蛋白、重组人tgf-beta 1蛋白、烟酰胺单核苷酸和非必需氨基酸。
8.优选的是，所述基础培养基、血清替代物和补充剂的体积比为90:9:1；所述优化培养基中，l-谷氨酰胺的物质的量浓度为6mm、β-巯基乙醇的物质的量浓度为0.15mm、重组人fgf2蛋白的质量浓度为30ng/ml、重组人fgf4蛋白的质量浓度为20ng/ml、重组人pdgfab蛋白的质量浓度为6.0ng/ml、重组人egf蛋白的质量浓度为2.0ng/ml、重组人vegf 165a蛋白的质量浓度为0.4ng/ml、重组人hgf蛋白的质量浓度为0.4ng/ml、重组人tgf-beta 1蛋白的质量浓度为1.0ng/ml、烟酰胺单核苷酸的物质的量浓度为4mm和非必需氨基酸的体积百分含量为1％。
9.本发明还提供了一种培养人源胎盘来源间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的优化培养基、组织消化液、红细胞裂解液和培养皿；所述组织消化液包括100u/ml collagenase type i、1.5μg/ml dnase i和2.4u/ml dispase。
10.本发明还提供了一种人源胎盘来源间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
11.1)将预处理的胎盘组织与组织消化液混合，37℃消化2～3h，中止消化，得到消化后胎盘组织细胞悬液；
12.2)将消化后的胎盘组织细胞悬液进行过滤，得到含有单个核细胞的细胞悬液，离心，得到单个核细胞沉淀；
13.3)将单个核细胞沉淀与红细胞裂解液混合进行红细胞的裂解，得到胎盘组织细胞；
14.4)将胎盘组织细胞重悬于上述技术方案所述的优化培养基中，得到胎盘组织细胞重悬液，将所述胎盘组织细胞重悬液接种到t-175175培养瓶中进行培养，得到人源胎盘来源间充质干细胞。
15.优选的是，步骤1)所述预处理的胎盘组织的预处理方法包括：
16.以脐带为中心，从最接近脐带的区域剪切下半径为2～3cm的胎盘组织，剪掉脐带对侧胎盘组织，弃掉，将剩下的脐带侧胎盘组织剪为2～4cm的小块，使用hbss溶液对小块进行洗涤，直至没有明显血液，得到洗涤后的组织块；将洗涤后的组织块切成2～5mm的细小块，得到预处理的胎盘组织。
17.优选的是，步骤2)所述过滤包括：将消化后的胎盘组织进行过滤，得到含有单个核细胞的细胞悬液和未消化的胎盘组织碎片；将所述未消化的胎盘组织碎片悬浮后再次过滤，收集含有单个核细胞的细胞悬液；所述过滤的次数为2～3次。
18.优选的是，步骤3)所述裂解包括：将单个核细胞沉淀与红细胞裂解液混合后反复吹打2～3min，离心后弃上清；取沉淀再次与红细胞裂解液混合，反复吹打2～3min，离心弃上清，重复取沉淀和与红细胞裂解液混合、反复吹打和离心弃上清的操作，直至细胞沉淀中看不到明显的红色血细胞。
19.优选的是，步骤4)中，所述接种的密度为6
×
106个细胞/t-175培养瓶；所述培养的
条件为37℃和5％co2加湿培养。
20.优选的是，步骤4)所述培养包括：培养48h后，使用新鲜的优化培养基进行半量换液，再培养24h后，使用37℃预热的d-pbs洗涤，去除非贴壁细胞和细胞碎屑，加入新的优化培养基，之后，每3天全量更换新的优化培养基一次，直至细胞单层铺满t-175培养瓶90％以上，得到第0代细胞。
21.优选的是，得到第0代细胞后，还包括对第0代细胞进行继代培养，所述继代培养包括：
22.待第0代细胞汇合率达到90％，使用37℃预热的d-pbs进行洗涤，洗涤后加入细胞消化液进行消化，消化后，将消化后细胞接种在新鲜的优化培养基中培养，实现细胞的继代培养；
23.所述继代培养以1.2
×
106个细胞/瓶的接种密度在t-175培养瓶中进行接种。
24.本发明提供了一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基。本发明所述优化培养基能够最大限度地提高胎盘来源msc体外扩增效率并减少批次间细胞的差异。优化培养基中补充剂的添加揭示了有利的生长动力学，能够在更短的时间范围内(14天)达到临床相关的细胞数量，从而减少培养基消耗，降低大规模细胞制备及生产成本。具体的，本发明所述优化培养基具有以下有益效果：(1)在原代和传代培养物中具有更大的集落形成能力；(2)显著的指数增长；(3)种群倍增较短；(4)更多数量的细胞；(5)更高程度的细胞尺寸均一性；(6)更小的培养面积需求；(7)多代次均能保持较好的表型一致性和三系分化潜能。
25.本发明应用温和的酶解法最大限度的释放胎儿侧胎盘内的单个细胞，并在进行红细胞裂解后进行细胞贴壁接种，在优化培养基为基础的条件下，最大限度的促进细胞群体中msc的贴壁和扩增，同时规避血细胞对msc的生长抑制。利用本发明培养方法具有以下有益效果：(1)酶解能够将细胞从组织中释放；(2)红细胞裂解能够降低大量红细胞对间充质细胞贴壁和增殖的影响；(3)优化培养基和涂层培养皿提高间充质细胞的黏附效率。
附图说明
26.图1为本发明提供的胎盘组织解剖图；
27.图2为本发明提供的胎盘来源细胞分离操作流程；
28.图3为本发明提供的fpmsc21041101胎盘来源间充质干细胞p1代细胞制备结果图；
29.图4为本发明提供的fpmsc21042101胎盘来源间充质干细胞p1代细胞制备结果图；
30.图5为本发明提供的fpmsc21062101胎盘来源间充质干细胞p1代细胞制备结果图；
31.图6为本发明提供的组织消化液效果对比结果图；
32.图7为本发明提供的红细胞裂解处理对原代细胞贴壁生长的影响；
33.图8为本发明提供的cellbind涂层培养瓶对原代细胞贴壁生长的影响结果；
34.图9为本发明提供的中科fp-msc优化培养基组合及同立海源msc培养基组合；
35.图10为本发明提供的不同培养体系下同一供体来源胎盘间充质干细胞p0/p2/p5/p10细胞状态；
36.图11为本发明提供的两种培养条件下t-25培养瓶接种相同数目细胞后传至p10代所获得的细胞总数；
37.图12为本发明提供的优化培养条件下胎盘间充质干细胞p10细胞表型鉴定；
38.图13为本发明提供的优化培养条件下胎盘来源间充质干细胞p2/p5/p10代次三系分化能力鉴定；
39.图14为本发明提供的不同接种方法原代胎盘间充质干细胞接种7/14/21天细胞状态。
具体实施方式
40.本发明提供了一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基，所述培养基包括：基础培养基、血清替代物和补充剂；所述基础培养基包括dmem-low glucose、l-谷氨酰胺和β-巯基乙醇；所述血清替代物包括knockout
tm
血清替代物；所述补充剂包括重组人fgf2蛋白、重组人fgf4蛋白、重组人pdgf ab蛋白、重组人egf蛋白、重组人vegf 165a蛋白、重组人hgf蛋白、重组人tgf-beta 1蛋白、烟酰胺单核苷酸和非必需氨基酸。本发明所述优化培养基具有以下优势：(1)在原代和传代培养物中具有更大的集落形成能力；(2)显著的指数增长；(3)种群倍增较短；(4)更多数量的细胞；(5)更高程度的细胞尺寸均一性；(6)更小的培养面积需求；(7)多代次均能保持较好的表型一致性和三系分化潜能。
41.在本发明中，所述基础培养基、血清替代物和补充剂的体积比为90:9:1；所述优化培养基中，l-谷氨酰胺的物质的量浓度为6mm、β-巯基乙醇的物质的量浓度为0.15mm、重组人fgf2蛋白的质量浓度为30ng/ml、重组人fgf4蛋白的质量浓度为20ng/ml、重组人pdgfab蛋白的质量浓度为6.0ng/ml、重组人egf蛋白的质量浓度为2.0ng/ml、重组人vegf 165a蛋白的质量浓度为0.4ng/ml、重组人hgf蛋白的质量浓度为0.4ng/ml、重组人tgf-beta 1蛋白的质量浓度为1.0ng/ml、烟酰胺单核苷酸的物质的量浓度为4mm和非必需氨基酸的体积百分含量为1％。
42.本发明还提供了一种培养人源胎盘来源间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的优化培养基、组织消化液、红细胞裂解液和培养皿；所述组织消化液包括100u/ml collagenase type i、1.5μg/ml dnase i和2.4u/mldispase。在本发明中，所述mldispase。在本发明中，所述培养皿的市售信息优选为：175cm2u-shapedangledneck cell culture flaskwithvent cap，#3292。在本发明中，所述collagenase type i的市售来源信息为：07416，stem cell；所述dnase i的市售来源信息优选为100-0273，stem cell；所述dispase的市售来源信息优选为07446，stem cell。在本发明中，上述消化酶的溶剂优选为hbss，ph优选为ph 7.4。本发明所述组织消化液包括三组成份，分别为：
43.i型胶原酶：来自溶组织梭菌，是一种粗胶原酶制剂，可用于分离原代细胞或通过酶促方法进行组织解离。该制剂还可能含有酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶活性。该制剂可用于分离培养物中的细胞，并已成功用于传代无动物成分培养基培养的人类胚胎干细胞。
44.脱氧核糖核酸酶i(dnase i)无动物成分(acf)：从不含动物源性材料的培养物中获得，并通过色谱法纯化。dnase i是一种核酸内切酶，由具有两个二硫键的单个糖基化多肽链组成。dnase通常包含在组织解离方案中，用于消化由于细胞损伤而泄漏到解离介质中的dna。dnase i，acf优先切割单链和双链dna中与嘧啶核苷酸相邻的磷酸二酯键，产生具有
5'-磷酸和3'-羟基的多核苷酸。dnase i已用于消化人体组织，例如小胶质细胞、软骨、结肠、上皮、肝脏、肺、神经细胞和干细胞。
45.dispase，animal component-free(acf)：一种中性的氨基内切蛋白酶，可切割非极性氨基酸残基的n端肽键，从不含动物源性材料的培养物中获得。dispase具有温和的蛋白水解活性，这使得它特别适用于原代细胞的分离和传代。它的蛋白水解活性也使它能够保持膜的完整性。dispase通常与其他蛋白酶一起使用，如胶原酶，用于神经组织、肾脏、上皮组织、内皮组织、肺组织、结肠组织和干细胞的细胞分离和组织解离。
46.本发明上述组分的组合得到的组织消化液对胎盘组织消化更彻底，细胞释放的更充分，在2h内可以实现胎盘组织达到更好的单细胞释放水平。
47.本发明还提供了一种人源胎盘来源间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
48.1)将预处理的胎盘组织与组织消化液混合，37℃消化2～3h，中止消化，得到消化后胎盘组织细胞悬液；
49.2)将消化后的胎盘组织细胞悬液进行过滤，得到含有单个核细胞的细胞悬液，离心，得到单个核细胞沉淀；
50.3)将单个核细胞沉淀与红细胞裂解液混合进行红细胞的裂解，得到胎盘组织细胞；
51.4)将胎盘组织细胞重悬于上述技术方案所述的优化培养基中，得到胎盘组织细胞重悬液，将所述胎盘组织细胞重悬液接种到t-175175培养瓶中进行培养，得到人源胎盘来源间充质干细胞。
52.本发明将预处理的胎盘组织与组织消化液混合，37℃消化2～3h，中止消化，得到消化后胎盘组织。预处理操作前，本发明优选将胎盘保存在含葡萄糖和抗生素的dmem中，所述抗生素优选包括庆大霉素、链霉素和青霉素，所述庆大霉素的质量百分含量优选为0.1％，链霉素的质量百分含量优选为0.2％，青霉素的质量百分含量优选为0.12％。在本发明中，胎盘的保存温度优选为4℃。本发明优选在收集胎盘后的2～4h内处理胎盘，所有操作优选均在无菌环境下进行。本发明优选使用4℃预冷的d-pbs对胎盘进行洗涤和浸泡，洗涤去除血块，浸泡使胎盘保持湿润，不让组织变干。本发明所述d-pbs使用的是商品化的无菌d-pbs，cytiva，sh30028.01。在本发明中，所述预处理的胎盘组织的预处理方法优选包括：以脐带为中心，从最接近脐带的区域剪切下半径为2～3cm的胎盘组织，剪掉脐带对侧胎盘组织，弃掉，将剩下的脐带侧胎盘组织剪为2～4cm的小块，使用hbss溶液对小块进行洗涤，直至没有明显血液，得到洗涤后的组织块；将洗涤后的组织块切成2～5mm的细小块，得到预处理的胎盘组织。在所述剪切前，本发明优选去除胎盘中的羊膜，留下绒毛膜，保持绒毛膜板组织完好无损。在对胎盘进行剪切的过程中，本发明优选使用hbss对胎盘组织碎片进行浸泡，保持水分。本发明优选以脐带或胎盘连接处(cpj)为中心，剪切半径为2～3cm的圆柱体状组织，总质量优选35～55g，更优选40g。本发明剪掉的脐带对侧胎盘组织的厚度优选为0.2cm。本发明所述小块的质量优选为4～6g，更优选为5g。本发明将预处理的胎盘组织与组织消化液优选按照体积比为1:1进行混合。在本发明中，所述消化的过程中，优选每30min摇晃一次，每次摇晃的时间优选为10s。本发明所述消化的过程不需要加湿和5％二氧化碳的环境。当组织消化液出现浑浊的外观，并且组织中有明显的白血管时，消化完成。本发明优选通过加入消化终止液实现消化的终止。本发明对消化终止液的来源没有特殊限定，使用
常规市售非血清消化终止液即可。
53.得到消化后的胎盘组织后，本发明将消化后的胎盘组织进行过滤，得到含有单个核细胞的细胞悬液，离心，得到单个核细胞沉淀。在本发明中，所述过滤包括：将消化后的胎盘组织进行过滤，得到含有单个核细胞的细胞悬液和未消化的胎盘组织碎片；将所述未消化的胎盘组织碎片悬浮后再次过滤，收集含有单核细胞的细胞悬液；所述过滤的次数为2～3次。在本发明中，所述过滤优选使用70μm的细胞滤器。本发明通过过滤，能够实现单个核细胞和未消化的胎盘组织的碎片的分离，为了最大程度地收集每个组织来源的单个核细胞，本发明优选对未消化的胎盘组织进行反复的悬浮和过滤操作，收集单个核细胞的细胞悬液。
54.得到单个核细胞沉淀后，本发明将单个核细胞沉淀与红细胞裂解液混合进行红细胞的裂解，得到胎盘组织细胞。在本发明中，所述裂解优选包括：将单个核细胞沉淀与红细胞裂解液1:1.5混合后反复吹打2～3min，离心后弃上清；取沉淀再次与红细胞裂解液1:1.5混合，反复吹打2～3min，离心弃上清，重复取沉淀和与红细胞裂解液混合、反复吹打和离心弃上清的操作，直至细胞沉淀中看不到明显的红色血细胞。在本发明中，所述离心的条件优选为1200rpm，5min。
55.得到胎盘组织细胞后，本发明将胎盘组织细胞重悬于上述技术方案所述的优化培养基中，得到胎盘组织细胞重悬液，将所述胎盘组织细胞重悬液接种到培养皿中进行培养，得到人源胎盘来源间充质干细胞。本发明重悬细胞后，优选进行细胞计数，保证后续接种密度的控制。在本发明中，所述接种的密度优选为6
×
106个细胞/t-175培养瓶；所述培养的条件为37℃和5％co2加湿培养。本发明优选使用175cm
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培养瓶。本发明培养瓶的使用能够促进从组织分离的原代细胞在其表面的黏附，结合组织酶解和红细胞裂解处理的步骤，能够大幅缩短原代细胞黏附时间，增大原代细胞黏附面积，进而提高单位时间内原代msc细胞产量。
56.在本发明中，所述培养优选包括：培养48h后，使用新鲜的优化培养基进行半量换液，再培养24h后，使用37℃预热的d-pbs洗涤，去除非贴壁细胞和细胞碎屑，加入新的优化培养基，之后，每3天全量更换新的优化培养基一次，直至细胞单层铺满t-175培养瓶90％以上，得到第0代细胞。
57.在本发明中，得到第0代细胞后，还包括对第0代细胞进行继代培养，所述继代培养包括：
58.待第0代细胞的培养物汇合率达到90％，使用37℃预热的d-pbs进行洗涤，洗涤后加入细胞消化液进行消化，消化后，将消化后细胞接种在新鲜的优化培养基中培养，实现细胞的继代培养。在本发明中，所述细胞消化液优选为tryple express细胞消化液。
59.所述继代培养优选以1.2
×
106个细胞/瓶的接种密度在t-175培养瓶中进行接种。本发明每次继代培养4～5天细胞达到90％的汇合。
60.在本发明中，所述第0代细胞的培养物的制备，优选以1
×
104/cm2的接种密度，将第0代细胞接种到优化培养基中。
61.目前常用的胎盘来源间充质干细胞的提取一是组织贴壁法，此方法的限制在于可
获得的(1)细胞量极少，同时由于(2)每个组织块爬出细胞数目和时间不可控，细胞呈现不均一的状态，临床应用的批间一致性很差，同时(3)实验周期极长，平均5～6周能收获一批细胞，满足不了临床需要的细胞总量的需求。而且，常规方法使用pbs或生理盐水对组织表面进行清洗或冲洗，并不能很好的去除组织内部的血细胞，因此在尝试通过组织贴壁法分离间充质干细胞时，大量血细胞的存在会占用培养皿的表面，进而抑制细胞从组织爬出。另一种方法是使用组织绞碎机联合酶消法，(1)会对细胞会产生较严重的机械损伤，同时胎盘组织切碎后，内包括胎儿来源的滋养细胞、内皮细胞和造血细胞，以及母体来源的造血细胞和蜕膜间质细胞，这些细胞所占比例很高，在(2)接种细胞过程中会限制间充质干细胞的贴壁和扩增。
62.本发明所述培养方法在优化的培养基中通过酶解法进行人源胎盘来源间充质干细胞的提取及扩增工艺，(1)首先预处理剪切的组织块更大，减少了细胞的机械损伤，(2)过程中采用的组织消化酶配比更加温和，(3)通过细胞滤器和红细胞裂解的流程降低了组织碎片和红细胞对msc间充质干细胞的贴壁和增殖的抑制；(4)同时使用的是胎盘间充质干细胞促黏附和扩增作用的优化培养基，(5)配合surface treatment培养瓶大大增加间充质的黏附效率和细胞增殖速度。
63.下面结合具体实施例对本发明所述的一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
64.实施例1
65.一、胎盘组织的采集
66.(1)胎儿娩出后，待胎盘与母体完全分离，用生理盐水充分清洗胎盘，再用75％医用酒精快速冲洗表面。
67.(2)迅速将胎盘放入组织保存袋，加入组织保存液(含有4,500mg/ml葡萄糖和抗生素溶液(0.1％庆大霉素、0.2％链霉素和0.12％青霉素)的dmem)予以全部浸润，转入胎盘采集盒。
68.(3)将组织保存袋储存在4℃组织运输盒内运输至实验室。在收集组织后的2～4h内处理样品，所有操作均在无菌实验室环境中进行。
69.(4)将样品置于生物安全柜内的医用不锈钢托盘中。使用针头和注射器，用4℃预冷的d-pbs冲洗组织表面多次以去除血块。确保样品在处理过程中用浸于d-pbs中保持湿润，不要让组织变干。为了保持无菌，在整个样品处理过程中使用无菌的d-pbs和手术工具对样品进行无菌处理。
70.二、胎盘间充质干细胞的分离
71.(1)从胎盘的胎儿表面机械去除羊膜，留下绒毛膜，绒毛膜板组织完好无损。
72.(2)在解剖过程中，将组织碎片放入装有hbss的培养皿中，以保持水分。
73.(3)以脐带和胎盘连接处(cpj)为中心，从最靠近脐带的区域剪切下半径为2～3cm的圆柱体状组织，总质量约40g。
74.(4)剪掉厚度约0.2cm母体一侧的胎盘组织(脐带对侧胎盘组织)，弃掉。将剩下的组织(脐带侧胎盘组织)剪为2～4cm，5g左右的小块(图1，胎盘组织解剖图，脐带侧胎盘组织(右上)，脐带对侧胎盘组织(右下))。
75.(5)转移2～3块组织碎片至50ml离心管中，直至10ml标记(约10g组织)。
76.(6)在每个试管中分别填充20mlhbss溶液，反复倒转试管以冲洗组织(约10s)。
77.(7)倒出上清液，并重复此洗涤步骤2～3次，直到溶液中基本上没有血液为止。使用10ml移液管或更长的镊子，确保倒出上清液时，组织碎片不会从管中丢失。
78.(8)将组织块放入10cm培养皿中，尽量减少液体转移。用剪刀将组织切碎，切成约2～5毫米的细小块。图2为胎盘来源细胞分离操作流程，此处对应图2中的(1)。
79.(9)将切碎的组织转入新的50ml离心管中，每管约10g组织小块。
80.(10)与组织以1：1的比例添加新鲜制备的组织消化液(例如10ml组织加入10ml组织消化液)。在每个试管上盖上盖子，并将试管翻转几次以进行充分混合。对应图2中的(2)。
81.(11)在37℃下用组织消化液与试管中的组织共同孵育2～3h，每30min手动快速剧烈摇动试管10s，这一步不需要加湿和5％的二氧化碳的环境。
82.(12)当组织消化液出现浑浊的外观，并且组织中有明显的白血管时，消化就完成了。对应图2中的(3)。
83.三、收集单个核细胞并接种至t-175培养瓶
84.(1)向每个试管中加入10ml消化终止液，以灭活组织消化液中的酶。
85.(2)通过70μm细胞滤器将未消化的组织碎片与单核细胞分离，将含有单个核细胞的细胞悬液转移至新的50ml离心管中。对应图2中的(4)。
86.(3)向剩余的胎盘组织碎片中加入20ml间充质干细胞基础培养基(中科基础培养基，不加血替和补充剂)，并剧烈摇动。使剩余的已分离的单个核细胞进入悬浮液，再次收获假定的msc细胞。
87.(4)重复步骤(2)和(3)两次，均将细胞悬液液转移至新的50ml离心管中，以最大程度地收集每个组织来源的单个核细胞。对应图2中的(5)。
88.(5)将收集的单个核细胞悬液汇集到四个50ml离心管中。将每个试管以1200rpm离心5min。此步骤会将单个核细胞沉淀到试管底部。
89.(6)向每个试管添加30ml红细胞裂解液，用移液枪反复吹打2min，1200rpm离心5min后弃上清。对应图2中的(6)。
90.(7)重复步骤(6)至细胞沉淀看不到明显的红色血细胞。
91.(8)小心倾析或用移液器将上清液倒入废液缸，不必尝试消除每滴上清液。
92.(9)除去大部分上清液后，用手指轻拂试管几次，以移出细胞沉淀。合并沉淀，然后将其重悬于35mlmsc优化培养基中。
93.(10)细胞计数后，按照6
×
106/瓶将胎盘组织细胞悬液转移到单个175cm2培养瓶中，并在37℃和5％co2的加湿培养箱中培养。
94.四、原代(p0)胎盘间充质干细胞分离后扩增
95.(1)在最初分离的48h后，从每个175cm2培养瓶中除去培养基，并用新鲜的msc优化培养基进行半量换液，将培养瓶再放回培养箱中培养24h。
96.(2)再培养24h后，用37℃预热的d-pbs(25ml)洗涤培养瓶两次，通过旋转周围的液体在培养瓶底部移出非贴壁细胞和细胞碎屑，向培养瓶中加入新的25mlmsc优化培养基，然后移至培养箱。
97.(3)每3天全量更换培养基一次，并孵育培养物，直到细胞单层铺满90％以上。
98.(4)此工艺条件下获得的细胞被认为是第0代(p0)，将其重悬悬浮在msc优化培养基中，并使用细胞计数仪进行计数，并以1
×
104/cm2的播种密度进行传代，用于放大、表征和冷冻保存(注：从组织提取msc原代细胞的时候，使用175cm2培养瓶，在之后的传代中使用无涂层t-175即可)。多余的细胞可以以4
×
106/ml浓度在cryostor cs10细胞冻存液中进行冷冻保存。
99.五、胎盘间充质干细胞体外继代培养
100.(1)当p0代培养物汇合率达到90％时，用20ml，37℃预热的d-pbs洗涤两次，并丢弃洗涤液。向每个培养瓶中添加5ml，37℃预热的tryple express细胞消化液。
101.(2)将培养瓶在室温条件下孵育2～4min，以从组织培养瓶底部表面释放msc。每隔约1min轻微振荡培养瓶以促进分离。
102.(3)当细胞从培养瓶表面上脱离形成单个细胞悬液中时，加入5ml消化终止液，轻微振荡以稀释tryple express细胞消化液，随后将细胞收集在试管中。
103.(4)将每个组织培养瓶的内容物转移到新的50ml离心管中。
104.(5)将离心管以1200rpm离心5min以沉淀细胞。
105.(6)弃去上清液，将细胞沉淀重悬于2ml培养基中。
106.(7)在10μl台盼蓝中稀释10μl细胞悬液，用血细胞计数器计数细胞并计算细胞总数。
107.(8)在新鲜的msc优化培养基中以1.2
×
106/瓶将细胞转移到新的t-175培养瓶中，并在细胞培养箱中孵育。在这种播种密度下，在25mlmsc优化培养基中，4～5天细胞将达到90％汇合。
108.(9)后续每个t-175培养瓶均以1.2
×
106/瓶的速率传代。
109.实施例2
110.(一)本发明胎盘间充质干细胞培养方法具有可重复应用的稳定性
111.本发明设置了3个不同组织供体来源的胎盘组织间充质干细胞分离和扩增组，在实验中期和后期进行细胞形态的镜检和制备总量的计算，验证本发明培养方法是否可以实现胎盘来源间充质干细胞稳定的分离和扩增。
112.实验结果如下所示：
113.(1)fpmsc21041101胎盘来源间充质干细胞p1代细胞制备；
114.通过实施例1的培养方法进行人源胎盘来源间充质干细胞(p0代)的提取及扩增工艺，取胎盘组织50g，实验第12天，接种p1代fp来源msc50个t-175培养瓶(2
×
106/瓶)。图3为fpmsc21041101胎盘来源间充质干细胞p1代细胞制备结果图。
115.(2)fpmsc21042101胎盘来源间充质干细胞p1代细胞制备；
116.通过实施例1的培养方法进行人源胎盘来源间充质干细胞(p0代)的提取及扩增工艺，取胎盘组织45g，实验第12天，接种p1代fp来源msc47个t-175培养瓶(2
×
106/瓶)。图4为fpmsc21042101胎盘来源间充质干细胞p1代细胞制备结果图。
117.(3)fpmsc21062101胎盘来源间充质干细胞p1代细胞制备；
118.通过实施例1的培养方法进行人源胎盘来源间充质干细胞(p0代)的提取及扩增工艺，取胎盘组织55g，实验第14天，接种p1代fp来源msc60个t-175培养瓶(2
×
106/瓶)。图5为
fpmsc21062101胎盘来源间充质干细胞p1代细胞制备结果图。
119.通过上述实验数据可知，基于本发明培养方法，在3个不同供体来源的胎盘组织均实现的大量的间充质干细胞的分离和扩增，通过镜检结果可知3批次分离的细胞均能保持良好的间充质干细胞形形态，同时根据组织采集重量(45g～55g)，能实现50～60个细胞达到90％汇合度的t-175培养瓶的p0原代细胞总量，满足临床应用需求，说明此胎盘间充质干细胞培养方法具有可重复应用的稳定性。
120.(二)细胞分离工艺中增加的组织消化处理、红细胞裂解处理和涂层培养皿工艺缩短原代细胞制备流程时间，增加单位时间内的细胞产量。
121.(1)优化的组织消化液在2h左右可以实现胎盘组织达到预期单细胞释放标准
122.为了将细胞从胎盘组织中进行释放以利于下游细胞培养，需要将组织进行消化。
123.胶原酶是一种蛋白酶，由单条多肽链组成，长度约为1,000个氨基酸残基。胶原酶能够消化结缔组织中常见的天然胶原纤维，因此经常用于组织解离。胶原酶制剂含有多种蛋白酶的活性，包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶。ii型胶原酶含有高水平的蛋白酶活性，尤其是梭菌蛋白酶，已被用于消化肺、肾、肝、胸腺、内皮细胞和间充质干细胞。
124.常规方法中使用胶原酶ii型进行胎盘组织的消化，能够消化结缔组织中常见的天然胶原纤维，因此经常用于组织解离。胶原酶相对温和，在生理温度和ph值下具有良好的解离能力，无需机械搅拌或特殊设备。
125.但是单一的酶成分决定了相对多种酶组合消化需要更长的时间，而产生对已经从组织释放出细胞的损伤，为此本发明使用了一种优化的消化酶组合，设计胶原酶ii型实验组和优化消化酶实验组，在37℃摇床孵育2h后对消化效果进行比较。
126.表1、胎盘组织酶解效果比对实验分组
[0127][0128]
将10g组织以1：1的比例添加新鲜制备的各实验组组织消化液。在每个试管上盖上盖子，并将试管翻转几次以进行充分混合。
[0129]
在37℃下用组织消化液与试管中的组织共同孵育2h，每30min手动快速剧烈摇动试管10s，2h后取出，观察组织消化状况。结果如下所示：
[0130]
图6为组织消化液效果对比结果图。结果显示，两实验组经过2h的消化后均出现浑浊的外观，组织中有明显的白血管时，消化就完成了。常规组织消化液相对清澈，优化组织消化液颜色更浓，证明优化组织消化后红细胞释放的更完全，间接证明组织消化更彻底，细胞释放的更充分。以上结果说明优化的组织消化液相比常规组织消化液在2h内可以实现胎盘组织达到更好的单细胞释放水平。
[0131]
(2)通过红细胞裂解处理可以显著降低血细胞对间充质细胞贴壁的影响
[0132]
本发明增加红细胞裂解的步骤，能够降低红细胞对间充质干细胞的生长干扰，而在培养初期通过半量换液能够降低其他非粘附细胞对间充质干细胞的干扰。
[0133]
本发明设计两个实验组，红细胞裂解处理组和非红细胞裂解处理组，根据上述工艺流程，在获得原代组织消化的单细胞悬液后，红细胞裂解组按照工艺流程进行，非红细胞裂解组略过工艺步骤三中的(6)(7)步骤，直接执行(8)步骤，即在1200rpm离心5min后将细胞重悬于35ml msc优化培养基中。将两组细胞悬液进行细胞计数，后按照1.2
×
106/瓶接种于t-175培养瓶中，实验第4天和第8天镜下检查间充质干细胞的生长状态。(注：本实验目的是确认红细胞对间充质干细胞的影响，因细胞成分不一样，初始混合细胞内间充质细胞含量不一样，无法保证实验的完全平行性，只是根据间充质细胞黏附效率和生长状态进行红细胞干扰效果验证，并不需要统计细胞数目)。
[0134]
实验结果如图7所示：
[0135]
图7为红细胞裂解处理对原代细胞贴壁生长的影响；结果表明，红细胞裂解组经过红细胞裂解处理后细胞为白色状态，上清液澄清，接种第4天能观察到明显的初始细胞贴壁，实验第8天能观察的均一的贴壁细胞增殖；非红细胞裂解组经过细胞清洗操作处理后细胞为淡粉色状态，说明存在血细胞，上清液呈现淡红色状态，接种第4天观察不到初始细胞贴壁，实验第8天观察到大量血细胞的存在，占用了培养瓶大部分空间，观察不到间充质细胞的贴壁及生长。
[0136]
以上结果说明通过红细胞裂解处理可以显著降低血细胞对间充质细胞贴壁的影响。
[0137]
(3)采用surface treatment涂层的培养皿可以促进从组织分离的原代细胞在其表面的黏附效率
[0138]
为测试cellbind涂层培养瓶和无涂层培养瓶对原代细胞黏附的影响，本发明设置了cellbind组(175cm
2 u-shapedangled neck cell culture flaskwithvent cap，#3292)和正常对照组t-175培养瓶(175cm
2 u-shapedanglednecknot treated cell culture flask with vent cap，#431466)各3瓶，接种相同胎盘组织来源红细胞裂解处理后的单细胞悬液(1.2
×
106/瓶)，实验第16天观察细胞的粘附状态并统计最后收获的细胞数目。结果如图8所示：
[0139]
图8为cellbind涂层培养瓶对原代细胞贴壁生长的影响结果；结果显示，正常对照组在d16天细胞呈现稀疏的不均一的分布状态，但是培养瓶中存在明显的细胞孔隙，cellbind组在d16天细胞呈现密集的均一分布状态，几乎观察不到培养瓶中存在细胞孔隙。
[0140]
总细胞数目显示，正常对照组细胞总数为(6.993
±
0.473)
×
106/t-175培养瓶，cellbind组细胞总数为(9.033
±
0.321)
×
106/t-175培养瓶。此结果说明，采用surface treatment涂层的培养皿可以促进从组织分离的原代细胞在其表面的黏附效率，增加单位时间内获得细胞的总量。
[0141]
(三)培养方法中使用的fp-msc优化培养基可以实现msc的长期传代，保持细胞一致性的同时维系间充质干细胞的三系分化潜能。
[0142]
人类胎盘间充质干细胞的纯度和特征会受到它们培养条件的极大影响。胎牛血清虽然定义不明确，但已经被广泛用作传统间充质干细胞培养的关键要求。然而，因其具有动
物源性，临床上可接受的生物过程开发和可重复的稳定细胞制剂制备工艺流程，需要无血清的培养基。本发明选用的是优化的fp-msc培养基，与市售对照培养基相比，优化的fp-msc培养基支持以更快速和一致的方式从胎盘组织原代培养混合细胞中扩增hmscs，表现出：(1)在原代和传达培养物中具有更大的集落形成能力；(2)显著的指数增长；(3)种群倍增较短；(4)更多数量的细胞；(5)更高程度的细胞尺寸均一性；(6)更小的培养面积需求；(7)多代次均能保持较好的表型一致性和三系分化潜能。
[0143]
表2优化fp-msc培养基(500ml)组成
[0144]
dmem-low glucose445.5mll-glutamine6mm(1.5ml)β-mercaptoethanol0.15mm(3ml)kosr45mlrecombinant human fgf2 protein30ng/mlrecombinant human fgf4 protein20ng/mlrecombinant human pdgf ab protein6.0ng/mlrecombinant human egf protein2.0ng/mlrecombinant human vegf protein0.4ng/mlrecombinant human hgf protein0.4ng/mlrecombinant human tgf-beta11.0ng/mlnicotinamide4mmneaa5ml
[0145]
其中：
[0146]
(1)dmem-low glucose(thermo fisher#11885)。
[0147]
(2)l-glutamine(l-谷氨酰胺)(thermo fisher#a2916801)。
[0148]
(3)β-mercaptoethanol(β-巯基乙醇，thermofisher#21985023)。
[0149]
(4)knockout
tm
血清替代物(knockout
tm
sr，kosr)。(humanplatelet lysate(clinical grade)，sartorius，pltgold100gmp)
[0150]
(5)fgf
[0151]
重组人fgf2蛋白(animal free)，(ab179489)，本细胞因子不含动物成分。
[0152]
重组人fgf4蛋白(animal free)，(ab222368)，本细胞因子不含动物成分。
[0153]
(6)pdgf-ab
[0154]
重组人pdgfab蛋白(animal free)，(ab179496)，本细胞因子不含动物成分。
[0155]
(7)egf
[0156]
重组人egf蛋白(animal free)，(ab9697)，本细胞因子不含动物成分。
[0157]
(8)vegf
[0158]
重组人vegf 165a蛋白(animal free)，(ab179624)，本细胞因子不含动物成分。
[0159]
(9)hgf(肝细胞生长因子)
[0160]
重组人hgf蛋白(ab105061)。
[0161]
(10)重组人tgf-beta 1蛋白(animal free)(ab217396)
[0162]
(11)nicotinamide mononucleotide，烟酰胺单核苷酸(nmn)(merck n3501)。
[0163]
(12)neaa(non-essential amino acid，非必需氨基酸)，(merck n7145)
[0164]
将neaa添加到细胞培养基中可以减轻由这些非必需氨基酸的自我产生引起的潜在副作用。
[0165]
本发明通过筛选获得培养基中各组分包括细胞因子的最佳比例。基于上述胎盘间充质干细胞提取方法，通过酶解法(此处的酶指的是本技术的组织消化酶)将组织内间充质干细胞释放出来，在各自培养体系上扩增至p10代细胞，通过镜检各代次细胞状态，获得的细胞总数，比对各自的培养效率及细胞功能评价。同时通过检测p2/p5/p10代次间充质干细胞的三系分化能力以及p10代次间充质干细胞的细胞表型，来验证经过多次传代后，优化培养基体系上的间充质干细胞是否仍保持临床所需的细胞表型以及分化能力。
[0166]
试验共设置两个培养体系测试组，如图9所示：
[0167]
培养体系1：中科msc基础培养基(450ml)+中科msc血清替代物(45ml)+中科fp-msc培养基补充剂(5ml)
[0168]
培养体系2：同立海源msc基础培养基(480ml)+同立海源血清替代物(20ml)
[0169]
基于各自的培养体系，取同一组织供体来源胎盘位置，按工艺流程处理，每t-175培养瓶接种培养皿接种4
×
106红细胞裂解后的单细胞悬液，期间同一时间点进行细胞消化，传代，缓液操作以降低其他因素对实验的干扰，将细胞培养至p10代。
[0170]
图9为中科fp-msc优化培养基组合及同立海源msc培养基组合。
[0171]
期间显微镜下检测两实验组p0/p5/p10代细胞状态，如图10所示:
[0172]
图10为不同培养体系下同一供体来源胎盘间充质干细胞p0/p2/p5/p10细胞状态。根据p0代镜下细胞形态对比，可以发现，与对照培养体系相比，优化的中科fp-msc培养基中培养的hmsc表现出更具有干性细胞塔状形态学特点。同立海源培养基中培养的hmsc细胞的形态干性细胞团较少，可达到1.0～3.0
×
104个细胞/cm2的汇合状态，而优化培养基中培养的hmsc细胞体积小很多，呈纺锤形，切密度可达》5.0
×
104个细胞/cm2。
[0173]
而通过比对各组p2/p5/p10代次细胞状态，可以发现，中科优化培养基条件下，传代至p10代细胞仍能保持与早期代次细胞相同均一的间充质干细胞的形态特征，与其初始代次细胞干性强相关；而同立海源培养基条件下，随着传代次数增加，p10代细胞与p5代间大小出现明显差异，形态一致性较差。
[0174]
以上结果说明，优化的中科fp-msc培养体系可以在长期细胞培养和传代中可以保持细胞稳定的正常生长状态。
[0175]
同时，为了测试不同培养体系的细胞扩增效率，本发明以2.5
×
104/培养瓶接种p0收获的fp-msc细胞在含有不同培养基的t-25培养瓶中，每组3个平行样本，在p1/p3/p5/p7/p10传代时进行了细胞计数，以根据收获的细胞体积计算获得的细胞总量。结果如图11所示：
[0176]
图11为两种培养条件下t-25培养瓶接种相同数目细胞后传至p10代所获得的细胞总数。根据结果所示，分别在两种培养体系下接种相同数目的细胞(0.25
×
106/t25)，在p1代检测细胞计数时，中科培养体系下总细胞量达到2.733
±
0.153
×
106，而同立海源培养体系下总细胞量为0.463
±
0.055
×
106，说明在细胞培养初期中科体系细胞增殖更快，优于同立海源体系，在p1即获得了较高的细胞数目，随后仍以相同细胞接种数目进行传代，至p10代，中科培养体系下共获得8.187
±
0.353
×
106细胞，达科为培养体系下共获得5.167
±
0.172
×
106细胞，中科培养体系下获得的细胞总数约为达科为培养体系下的1.6倍，说明随着培养时间的增长，中科培养基条件下获得的细胞总量相对同立海源培养体系极具优势。
[0177]
基于上述实验结果，本发明在t-175培养瓶上进行了扩大实验，以2
×
106细胞/t175接种同一组织来源的p4代胎盘来源间充质干细胞，每个培养体系下接种10瓶，以细胞汇合达到90％为细胞收集终点，计算中科培养体系和同立海源培养体系下获得2亿细胞计算时间、培养基消耗以及人力成本，结果见表：
[0178]
表3扩增至2亿细胞的时间、成本比较
[0179][0180]
扩大hmsc的产量对于任何活细胞治疗而言都至关重要。根据实验结果，使用优化的fp-msc间充质干细胞培养基与同立海源基础培养基添加血替的培养体系相比，生产2亿细胞所需的培养基总量减少70.83％，表面积减少65％，时间缩短33.33％，时间精力减少60％。
[0181]
以上结果说明，在高细胞密度下实现中科fp-msc基础培养基添加补充剂的优化条件下，可实现高效胎盘来源hmsc扩增，减少培养基的用量、降低细胞培养所需培养界面表面积，节省细胞制剂制备时间。
[0182]
临床应用的msc需要保成单一的细胞组成，即极高的细胞纯度以保证安全性。mscs具有独特的形态并表达一组特定的cd(分化簇)分子。临床用于鉴定mscs细胞的表型模式需要表达cd44、cd73、cd90和cd105，并且缺少cd34、cd45和hla-dr抗原。本发明通过流式细胞技术检测的p10代uc-msc流式表型，鉴定结果如图12所示，间充质细胞表面标志物cd44、cd73、cd90和cd105表达占比分别为100％、99.8％、99.9％和99.7％；而阴性标志物表达为0.62％
[0183]
图12为优化培养条件下胎盘间充质干细胞p10细胞表型鉴定。以上结果说明，优化的工艺条件下获得至p10代次fp-msc细胞的纯度极高，符合临床应用标准。
[0184]
(四)在优化培养工艺条件下培养的fp-msc保持其三系分化潜能
[0185]
本发明验证了在优化培养体系条件下，多次传代后获得的高代次msc是否与仍具有与低代次细胞相同的三系分化能力。
[0186]
在进行分化实验之前，人脐带来源msc在优化培养基中扩增至p10代。随后使用间充质干细胞相应的成脂(stempro
tm
脂肪生成分化试剂盒，thermo fisher a1007001)、成骨(stempro
tm
骨生成分化试剂盒，thermo fishera1007201)、成软骨(stempro
tm
软骨生成分化试剂盒，thermo fisher a1007101)分化诱导试剂盒，根据操作手册进行培养，随后分别用
油红o、茜素红、阿莉西亚蓝队脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞进行染色，评测uc-msc的分化能力。结果如图13所示：
[0187]
图13为优化培养条件下胎盘来源间充质干细胞p2/p5/p10代次三系分化能力鉴定。根据图13可知，优化培养体系条件下获得的p2/p5/p10代次胎盘间充质干细胞均具有分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞的能力，说明，在优化培养体系条件下扩增胎盘来源msc，经过多次传代后仍能保证msc细胞功能的稳定性。
[0188]
(五)酶解消化法获得的间充质干细胞满足临床应用需求
[0189]
目前常用的胎盘来源间充质干细胞的提取一是组织贴壁法，此方法限制在于可获得的细胞量极少，同时由于每个组织块爬出细胞数目和时间不可控，细胞呈现不均一的状态，同时实验周期极长，平均5～6周能收获一批细胞，满足不了临床需要的细胞量需求。
[0190]
另一种方法是使用组织绞碎机联合酶消法，会对细胞会产生较严重的机械损伤，同时胎盘组织切碎后，内包括胎儿来源的滋养细胞、内皮细胞和造血细胞，以及母体来源的造血细胞和蜕膜间质细胞，这些细胞所占比例比约90％，在接种细胞过程中会限制间充质干细胞的贴壁和扩增。
[0191]
为此，本发明开发的在优化的培养体系条件下通过酶解法进行人源胎盘来源间充质干细胞的提取及扩增工艺，首先预处理剪切的组织块更大，减少了细胞的机械损伤，过程中采用的消化酶配比更加温和，通过细胞滤器和红细胞裂解的流程降低了组织碎片和红细胞对msc间充质干细胞的贴壁和增殖的抑制。同时使用的是配套的fp-msc间充质干细胞促黏附和扩增培养基，配合surface treatment涂层大大增加间充质的黏附效率和细胞增殖速度。
[0192]
为了验证酶解法处理胎盘组织的msc制备方法是否能达到临床需要的细胞数目，本发明设置了组织贴壁法实验组和酶解消化法(本发明方法)实验组，使用同一供体来源的组织进行msc的提取和培养，除了原代细胞提取方法不同以外，其他实验条件均一致。间隔7天显微镜下检查以评估细胞生长状态。实验结果如图14。
[0193]
其中，组织贴壁法实验：在完成实施例1第二部分的(8)将组织块放入10cm培养皿中，尽量减少液体转移。用剪刀将组织切碎，切成约2～5毫米的细小块。将小组织块均匀接种在10mm培养皿上，置入37℃细胞培养箱中静置10min，后将培养皿倒置放置在细胞培养箱中30min，以使得组织块粘附在培养皿表面。待组织块黏附在培养皿表面后，取出培养皿，加入5ml新鲜配置的预热优化完全培养基中，于37℃，5％co2条件下培养3天后进行半量换液，随后间隔3天更换新的完全培养基，定期镜下观察细胞从组织中爬出的情况。
[0194]
图14为不同接种方法原代胎盘间充质干细胞接种7/14/21天细胞状态。如图14所示，在实验第7天即能观察到两实组均有细胞出现，组织贴壁法获得的细胞数目相对较少，细胞呈现不规则状态，分布不均一。而酶解消化法获得的细胞数目较多，呈现细胞区域性扩散，大小均一。随着时间增加，组织贴壁法获得的细胞呈现个体增长而非扩增的状态，生长速度相对较慢，酶解消化法获得的细胞已经形成了细胞集落群。实验第21天，组织贴壁法获得的细胞局部开始扩增，但仍是不均一的状态，酶解消化法获得的细胞已经增殖到需要收集的状态。
[0195]
细胞增殖代次对于细胞的功能至关重要，一定时间内少的扩增代次降低了细胞突变的概率，使得细胞的临床应用更加安全。同时，短时的大量细胞获得才能满足临床需求并
降低细胞制备成本。以上结果说明酶解消化法获得的间充质干细胞满足临床应用需求，而组织贴壁法并不适用于临床级别细胞制备需要。
[0196]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。