一种须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记及其引物对和应用

1.本发明涉及入侵物种种群遗传学dna分子标记技术领域，尤其涉及一种须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记及其引物对和应用。


背景技术：

2.须鳗虾虎鱼taenioides cirratus，也称灰盲条鱼，隶属于鲈形目perciformes 虾虎鱼科gobiidae鳗虾虎鱼属taenioides。该鱼作为肉食性鱼类，繁殖力大且初次性成熟年龄小，能够在新环境中快速建立自我繁衍的入侵种群；目前已入侵我国内陆多个大型湖泊，被报道造成湖泊小型鱼虾资源量的急剧下降 (liang y,fang t,li j,yang k,zhao x.x,cui k,and lu w.x,age,growth andreproductive traits of invasive goby taenioides cirratus in the chaohulake,china.jappl ichthyol,2020,36(2):219
–
226)。在20世纪80年代，该鱼在高邮湖偶见，2000年后，资源量显著增加，成为湖泊常见种；随后，分别于 2005年和2011年在骆马湖和南四湖下级湖出现，2014年扩散到南四湖上级湖(qin j,cheng f,zhang l,schmidtb.v,liuj,xie s.g,invasions oftwo estuarinegobiid species interactively induced from water diversion and saltwaterintrusion.manag biol invasion,2019,10(1):139
–
150)；2012年在巢湖出现。须鳗虾虎鱼湖泊入侵种群的规模大，有增加、爆发甚至进一步扩散的风险，对湖泊生态系统的结构和功能完整性的破坏力大。因此，急需开展入侵种群的来源地、入侵路径等方面研究，进而科学合理制定入侵鱼类的防控对策。
3.针对入侵物种种群来源地和入侵路径模糊的问题，利用分子标记反应出的种群内和种群间遗传上的亲缘关系的种群遗传学方法，能够对上述问题进行准确回溯，已在国内外众多入侵物种中得到应用与证实。微卫星 (microsatellite),又被称为简单序列重复(simple sequence repeat，ssr)或短串联序列重复(shorttandemrepeat，str)，由核心序列及其两端的侧翼序列构成，广泛存在于真核生物基因组中，具有共显性遗传、多态性广、分布广、易于检测的特点，是当前入侵物种种群来源地和入侵路径研究中应用最广的分子标记。为了快速有效的鉴别须鳗虾虎鱼不同湖泊入侵种群的来源地及其入侵路径，对其微卫星引物的开发尤为重要。目前，须鳗虾虎鱼的微卫星标记分子还未得到开发应用。


技术实现要素：

4.为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明通过构建须鳗虾虎鱼简化基因组文库，进行高通量测序，对基因组中的微卫星位点进行筛选，提供了一种须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记及其引物对和应用。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记，包含14个须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记位点，所述分子标记位点为tc144、tc145、 tc176、tc208、tc220、tc119、tc149、tc155、tc203、tc13、tc35、 tc33、tc37和tc48。
7.本发明还提供了一种须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记的引物对，
8.所述tc144的正反引物分别如seq id no.1和seq id no.2所示；
9.所述tc145的正反引物分别如seq id no.3和seq id no.4所示；
10.所述tc176的正反引物分别如seq id no.5和seq id no.6所示；
11.所述tc208的正反引物分别如seq id no.7和seq id no.8所示；
12.所述tc220的正反引物分别如seq id no.9和seq id no.10所示；
13.所述tc119的正反引物分别如seq id no.11和seq id no.12所示；
14.所述tc149的正反引物分别如seq id no.13和seq id no.14所示；
15.所述tc155的正反引物分别如seq id no.15和seq id no.16所示；
16.所述tc203的正反引物分别如seq id no.17和seq id no.18所示；
17.所述tc13的正反引物分别如seq id no.19和seq id no.20所示；
18.所述tc35的正反引物分别如seq id no.21和seq id no.22所示；
19.所述tc33的正反引物分别如seq id no.23和seq id no.24所示；
20.所述tc37的正反引物分别如seq id no.25和seq id no.26所示；
21.所述tc48的正反引物分别如seq id no.27和seq id no.28所示。
22.优选的，所述须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记位点的正引物5
′
端带有荧光标记，其中，所述tc144、tc208、tc149、tc13和tc37的荧光标记为fam，所述tc145、tc220、tc155、tc35和tc48的荧光标记为hex，所述tc176、tc119、tc203和tc33的荧光标记为tamra。
23.本发明还提供了须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记或须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记的引物对在须鳗虾虎鱼遗传学的研究中的应用。
24.优选的，所述遗传学研究包括入侵种群来源和入侵路径的回溯。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
26.本发明通过构建须鳗虾虎鱼简化基因组文库，进行高通量测序，对基因组中的微卫星位点进行筛选，对其中的14个位点进行大样本种群的多态性实验验证。首次筛选得到了14个多态性微卫星标记，包括10个高度多态性标记和4个中度多态性标记。本发明为须鳗虾虎鱼入侵种群遗传学的研究提供分子技术支持，有助于对其进行入侵种群来源、入侵路径的回溯研究。
附图说明
27.图1为本发明tc144基因分型峰图(纯合子)；
28.图2为本发明tc144基因分型峰图(多重扩增)。
具体实施方式
29.本发明提供了一种须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记，包含14个须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记位点，所述分子标记位点为tc144、tc145、 tc176、tc208、tc220、tc119、tc149、tc155、tc203、tc13、tc35、 tc33、tc37和tc48。
30.本发明还提供了一种须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记的引物对，
31.所述tc144的正反引物分别如seq id no.1和seq id no.2所示；
32.所述tc145的正反引物分别如seq id no.3和seq id no.4所示；
33.所述tc176的正反引物分别如seq id no.5和seq id no.6所示；
34.所述tc208的正反引物分别如seq id no.7和seq id no.8所示；
35.所述tc220的正反引物分别如seq id no.9和seq id no.10所示；
36.所述tc119的正反引物分别如seq id no.11和seq id no.12所示；
37.所述tc149的正反引物分别如seq id no.13和seq id no.14所示；
38.所述tc155的正反引物分别如seq id no.15和seq id no.16所示；
39.所述tc203的正反引物分别如seq id no.17和seq id no.18所示；
40.所述tc13的正反引物分别如seq id no.19和seq id no.20所示；
41.所述tc35的正反引物分别如seq id no.21和seq id no.22所示；
42.所述tc33的正反引物分别如seq id no.23和seq id no.24所示；
43.所述tc37的正反引物分别如seq id no.25和seq id no.26所示；
44.所述tc48的正反引物分别如seq id no.27和seq id no.28所示。
45.在本发明中，所述须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记位点的正引物5
′
端优选带有荧光标记，其中，所述tc144、tc208、tc149、tc13和tc37 的荧光标记优选为fam，所述tc145、tc220、tc155、tc35和tc48的荧光标记优选为hex，所述tc176、tc119、tc203和tc33的荧光标记优选为tamra。
46.本发明还提供了须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记或须鳗虾虎鱼多态性微卫星分子标记的引物对在须鳗虾虎鱼遗传学的研究中的应用。
47.在本发明中，所述遗传学研究优选包括入侵种群来源和入侵路径的回溯。
48.下面结合实验例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
49.实验例1
50.(1)须鳗虾虎鱼基因组dna的提取：
51.采集长江口须鳗虾虎鱼成鱼55尾，取1g肌肉组织并用95％酒精保存。利用动物dna提取试剂盒(北京擎科生物科技有限公司武汉分公司)，参照试剂盒的说明书提取须鳗虾虎鱼总基因组dna，放于-20℃低温保存待用。
52.(2)简化基因组文库的构建与高通量测序：
53.选取1尾须鳗虾虎鱼的基因组dna样品，使用mi seq测序仪illuminausa进行全基因组随机测序(测序服务由中国科学院水生生物研究所公共技术服务中心提供)，测序量设定为1gbp，之后对测得片段进行拼接和校对，并使用misa(microsatellite)软件从拼接片段中搜索微卫星位点。搜索标准：2个碱基重复6次及6次以上；3个碱基、4个碱基、5个碱基及6个碱基均重复5次及5次以上。
54.(3)微卫星引物合成、检测与筛选：
55.根据搜索到的微卫星序列，使用primer premier 5.0设计微卫星位点的 pcr扩增引物。引物设计的主要参数：gc含量在40-60％之间，引物长度在18-25bp之间，退火温度在45-60℃之间，pcr产物的预期长度在130-350bp 之间。在2个原产地种群(长江口)和4个湖泊入侵种群(高邮湖、骆马湖、南四湖和巢湖)各取2个样品进行pcr扩增，pcr反应体系为30μl：26μl 1.1
×
t3 super pcr mix，1μl 10μm primer f，1μl 10μm primer r和2μl dna 模板。pcr扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，52-60℃退火10s (具体引物用的温度
如表1所示)，72℃延伸10s，35个循坏；72℃延伸10min， 4℃保存。将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μl样品+6μl溴酚蓝)， 300v电压下12min，获取鉴定胶图，通过胶图确定模板浓度，加水稀释到毛细管电泳所需浓度，随后上3730测序仪进行毛线管电泳监测。用软件genemapper4.1进行数据准确位点的分析，分析数据按照引物对应关系的核心碱基重复数来确定位点准确大小。根据分析出来的位点信息来判断检测引物是否具有位点多态性，最终成功设计14对微卫星标记引物。
56.表1 14对微卫星标记引物表
57.58.[0059][0060]
(4)微卫星标记的大样本验证：
[0061]
利用须鳗虾虎鱼长江口原产地种群55个样品对上述微卫星位点进行多态性的验证，使用cervus v.3.0.7软件对基因分型结果进行分析。具体结果如表2所示。
[0062]
表2 14个微卫星位点的多态性参数表
[0063]
[0064][0065]
由表2可知，等位基因的分布范围为2-13，均值为5.5；观测杂合度的变异范围是0.327-1.000，均值为0.610；期望杂合度的变异范围是0.345-0.866，均值为0.605；位点多态信息含量(pic)的变异范围是0.317-0.841，均值是 0.550，其中0.25＜pic≤0.5(中度多态性)的微卫星位点有4个，pic＞0.5(高度多态性)的微卫星位点有10个；14个多态性位点中，有2个位点显著偏离哈迪温伯格平衡(p＜0.001)。
[0066]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。