ZSWIM1蛋白在调控肺腺癌细胞增殖和转移中的应用

zswim1蛋白在调控肺腺癌细胞增殖和转移中的应用
技术领域
1.本发明属于蛋白质科学技术领域，具体涉及zswim1蛋白在调控肺腺癌细 胞增殖和转移中的应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤如肺癌的发病率及死亡率持续升高，严重威胁患者的健康。肺癌 细胞增殖过渡，以及其向脑、骨、淋巴结等远处部位的转移均是导致高死亡率 与不良预后的重要原因。尽管近些年来肿瘤(如非小细胞肺癌(nsclc))的 诊断和治疗不断改进，但是nsclc患者的5年生存率仍比较低。从抑制肿瘤细 胞增殖和转移的表型出发筛选新的抗肿瘤药物，将为肿瘤治疗提供新的方案。
3.2001年科学家们完成了20号染色体的测序分析工作，注释了895个基因， 其中很多基因的功能几乎未知。近几年来这些基因逐渐受到肿瘤研究人员的重 视，它们对肿瘤发生发展的调节开始被揭晓，其中两个基因fam210b和gid8 的功能分别发表在《cell death dis》和《cell res》杂志上。这些研究说明功能 未知的基因很可能在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色，将为肿瘤的靶向治疗 提供新线索。
4.zswim1基因位于20号染色体，功能几乎未知。zswim1转录长度2787bp， 编码蛋白质长度为485个氨基酸，预测只含有一个swim功能域。2002年， makarova ks等研究人员定义了swim结构域，swim基序的氨基酸序列为： cxcxncxh，n＝5-39，因含有半胱氨酸和组氨酸，研究者预测其具有锌指样结构， 并通过与dna或与蛋白质结合发挥功能。2014年，研究者首次证明了zswim1 在白细胞中的表达情况，其表达水平对分化信号非常敏感，并且在t细胞分化 过程中表达量显著下调，提示其具有参与细胞生命活动的潜能。而zswim1在 肿瘤中的作用至今未见任何报道。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供 zswim1蛋白在癌细胞增殖和转移中以及作为癌细胞增殖和转移调控靶标的应 用。
6.本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
7.本发明的第一个目的是提供一种zswim1蛋白在筛选调控癌细胞增殖和转 移的试剂中的应用。
8.优选的，所述试剂抑制zswim1蛋白活性或下调zswim1基因表达。
9.优选的，所述癌细胞为肺腺癌细胞。
10.本发明的第二个目的是提供一种zswim1蛋白在作为调控肺癌增殖和转移 的靶点中的应用。
11.首先，本发明提供了zswim1蛋白在调控癌细胞增殖和转移中的应用 zswim1蛋白在肺腺癌细胞中表达量升高，且参与肺腺癌增殖和迁移侵袭的调 节，增加zswim1的表达水平，促进肿瘤细胞的增殖和迁移侵袭，敲低zswim1 蛋白的表达则抑制肿瘤细胞的增殖和迁
移侵袭。
12.另外，本发明还提供一种筛选治疗癌症药物的方法，所述方法为：当待测 药物加到肿瘤细胞培养基中，进一步检测细胞中zswim1基因或蛋白的表达程 度，或联合检测erk1/2的磷酸化水平实现药物筛选的目的。当待测药物抑制 zswim1基因或蛋白的表达，或同时使erk1/2去磷酸化，则指示待测药物为抗 癌药物。
13.所述zswim1蛋白基因序列信息可参考网址：
14.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nm_080603.5；
15.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
16.本发明提供了zswim1蛋白在调控癌细胞增殖和转移中的应用，zswim1 蛋白可作为癌细胞增殖和转移调控的新靶标；通过检测zswim1蛋白的表达量 下降或erk1/2的去磷酸化情况以促进更多抗癌药物的开发。
附图说明
17.图1为tcga数据分析结果图；
18.图2为kaplan meier生存曲线图；
19.图3为zswim1在肺腺癌细胞的表达情况图；
20.图4为过表达或敲低zswim1影响腺癌细胞增殖的结果图；
21.图5为过表达或敲低zswim1影响肺腺癌细胞迁移、侵袭的结果图；
22.图6为pd98059处理erk1/2磷酸化、zswim1表达改变的图；
23.图7为pd98059联合过表达zswim1处理对癌细胞增殖影响的图。
具体实施方式
24.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详 细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。若未特 别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用 原料为市售商品。
25.所述肺上皮细胞hbe购自atcc，crl-2741；所述肺腺癌细胞a549购自 上海中科院细胞库，目录号：tchu150；所述肺腺癌细胞h1299购自上海中科 院细胞库，目录号：tchu160；所述h1299细胞购自中科院细胞资源中心；所 述pd98059购自美国medchemexpress生物科技公司(mce)，货号：hy-12028； 所述zswim1的sirna购自上海吉玛制药技术有限公司；所述pvdf膜为聚偏 二氟乙烯膜，美国millipore公司，购自广州铖铵生物科技有限公司，货号： iseq00010；所述transwell小室购自美国corning公司；所述血清和dmem培 养基购自美国gibco公司；所述zswim1抗体购自美国novus公司，货号：nbp2-13606；所述vimentin抗体购自美国proteintech公司，货号：10366-1-ap； 所述e-cadherin抗体购自美国cst(cell signaling technology)公司，货号：3195t； 所述beta-actin抗体购自美国proteintech公司货号：66009-1-ig；所述鼠二 抗购自美国jackson immuno research公司，货号：115-035-003；所述兔二抗购 自美国jackson immuno research公司，货号：111-035-003；所述pcmv-n-flag 载体购自上海碧云天生物技术有限公司；所述puromycin嘌呤霉素购自北京酷来 搏科技有限公司，货号：sl4130；所述ptsb02-gfp-puro和 ptsb02-zswim1-flag-gfp质粒购自上海权阳生物科技有限公司；所述293t细 胞购自上
海中科院细胞库；所述zswim1慢病毒质粒购自上海权阳生物科技有 限公司；
26.所述ebc裂解液配方为：1mm pi、1mm pmsf、1mm naf、1mm na3vo4。
27.实施例1 zswim1在肺腺癌细胞和肺上皮细胞中的表达情况
28.1.1下载分析57对成对的肺腺癌与癌旁组织mrna测序结果以及另外10 个肺腺癌组织mrna测序结果(下载网址参考： https://portal.gdc.cancer.gov/projects/tcga-luad)，上述结果中的基因表达数据 通过“fpkm.txt.gz”文件类型的fpkm进行量化，表达结果如下表1所示。
29.表1 zswim1在肺腺癌和癌旁组织中的表达情况
30.31.[0032][0033]
[0034]
实验结果如图1所示，****p《0.0001，student’s t-test，可以看出zswim1 蛋白在成对的肺腺癌组织中具有显著的高表达趋势；如图2所示kaplan meier 生存曲线分析得出高表达zswim1的肺腺癌患者生存期明显缩短，提示 zswim1和患者的总生存期呈负相关关系。据此，可以推测此蛋白可能参与了 肺腺癌的发生发展。
[0035]
1.2在细胞水平检测zswim1蛋白的表达情况，具体步骤见下：
[0036]
western blot实验
[0037]
a.正常的肺上皮细胞hbe，zswim1在肺腺癌细胞a549和h1299，用 1
×
pbs洗去残留的培养基，直接在板上加入ebc裂解液，于冰上裂解细胞30min， 每隔10min左右晃动六孔板数次，让ebc裂解液充分和细胞接触。
[0038]
b.将细胞裂解液转移至低速离心机4℃12000rpm离心30min。
[0039]
c.取上清液并转移到新的ep管中，弃底部沉淀。
[0040]
d.bca法测蛋白质浓度；
[0041]
所述bca法测蛋白浓度中各组分加入量如下表所示：
[0042]
表2 bca法测蛋白浓度各组分加入量表
[0043]
蛋白标准品/μl01248121620ebc裂解液/μl2019181612840bca工作液/μl200200200200200200200200
[0044]
其中，蛋白标准品的浓度为0.5mg/ml；a、b液比例为50:1。
[0045]
e. 制样：根据浓度取相应体积的样品与5
×
sds上样缓冲液混合，沸水浴加热10min使蛋白充分变性。
[0046]
f.配制page胶，将样品上样到page胶的胶孔后，80v电压跑胶30min， 待marker分开后，电压调到100v跑胶1h。
[0047]
g.转膜：切割5.5
×
8.0cm的pvdf膜，孔径为0.22μm，用100％无水甲醇活 化3min；取出page胶后在左侧切个角标记好顺序，然后按照胶块在下，pvdf 膜在上贴合地在一起，用刮子刮去接触面中产生的气泡；把胶块和膜放入卡槽 中，100v电压转膜90min，并按所需蛋白的分子大小可适当调整转膜时间。
[0048]
h.封闭：转膜完成后，将pvdf膜放入5％牛奶中封闭2h。
[0049]
i.孵一抗；按所需蛋白分子大小切割相应条带，4℃20rpm孵一抗过夜；所 述一抗包括zswim1抗体、vimentin抗体、e-cadherin抗体及beta-actin抗 体。
[0050]
j.回收一抗，用1
×
tbst洗膜3次，每次时长为5min。
[0051]
k.孵二抗；根据一抗相应的种属来源孵育同种来源二抗2h；所述二抗包括 鼠二抗及兔二抗。
[0052]
l.洗膜：回收二抗，1
×
tbst洗膜洗3次，每次时长为10min。
[0053]
m.显影：ecl发光液a、b液比例为1:1，避光配置。
[0054]
实验结果如图3所示，对比正常的肺上皮细胞hbe，zswim1在肺腺癌细 胞a549和h1299中均具有明显高表达，已知这两株肺腺癌细胞具有递增程度 的转移能力，这个实验结果提示zswim1可能和肺腺癌的转移等恶性潜能有 关。
[0055]
实施例2过表达或敲低zswim1蛋白促进肺腺癌细胞增殖的结果
[0056]
对zswim1蛋白对肺腺癌h1299细胞增殖水平的调节能力进行实验，具体 实验步骤
如下：
[0057]
2.1克隆形成实验：
[0058]
a.将zswim1的cdna插入到pcmv-n-flag载体中构建falg-zswim1质 粒，瞬时转染falg-zswim1质粒的h1299细胞及其对照细胞(flag-v)， 或者稳定敲低zswim1(kd-zswim1)的h1299细胞及对照细胞(kd-v)， 有胰酶消化细胞，2000g离心3min，弃上清并用1ml培养基重悬细胞，取100μl 细胞悬液稀释50倍，吸10μl稀释后的悬液在血球计数板中计数。
[0059]
b.铺1500个细胞于六孔板中，六孔板每孔加入2ml培养基；孔间加入pbs 保持湿润环境，37℃5％co2培养12天。
[0060]
c.培养期间每天观察细胞生长情况，若细胞长到肉眼可见的克隆斑时则可以 收取细胞。
[0061]
d.收克隆板。弃板中的培养基，加入1
×
pbs润洗细胞，然后换成4％多聚甲 醛溶液固定细胞18min。回收4％多聚甲醛，加入0.1％的结晶紫染色10min，接 着用超纯水洗去多余的结晶紫，室温干燥后2d成像仪成像。
[0062]
所述稳定敲低zswim1(kd-zswim1)的h1299细胞及对照细胞(kd-v) 构建如下：将plko.1-shzswim1-egfp和plko.1-egfp质粒转染293t细胞， 转染72h后，收上清培养基至50ml离心管；将收集的上清培养基，3500rpm， 室温离心10min，将上清倒入新的离心管中，用0.45μm滤膜过滤上清，备用， 用于感染肿瘤细胞。
[0063]
所述慢病毒感染和筛选细胞：
[0064]
1)将h1299细胞铺板于6孔板中，过夜，细胞密度为75％；
[0065]
2)去上清。每孔加入2ml新鲜病毒液(上述0.45μm滤膜过滤后的上清)；
[0066]
3)24h后换新鲜培养基；
[0067]
4)72h后，用含有2μg/ml puromycin嘌呤霉素的新鲜培养基培养细胞；
[0068]
5)至细胞长满后，进行传代至24孔板，并维持用含有2μg/ml puromycin 的新鲜培养基培养细胞；
[0069]
6)待细胞长满后，消化细胞，细胞计数，铺于96孔板中控制每个孔只有1 个细胞，并维持用含有2μg/ml puromycin的新鲜培养基培养细胞；
[0070]
7)待细胞长满后，将细胞传代至24孔板中，用含有2μg/ml puromycin的 新鲜培养基继续培养，直至传到6孔板中培养；
[0071]
8)第二天，去上清，更换含有5μg/ml puromycin的新鲜培养基培养；
[0072]
9)用倒置荧光显微镜观察细胞中egfp蛋白的表达和收集细胞进行wb检 测蛋白表达水平。
[0073]
2.2 mtt检测
[0074]
a.将zswim1的cdna插入到pcmv-n-flag载体中构建falg-zswim1质 粒，瞬时转染falg-zswim1质粒的h1299细胞及其对照细胞(flag-v)， 或者稳定敲低zswim1(kd-zswim1)的h1299细胞及对照细胞(kd-v)， 用胰酶消化细胞，血球计数板计数。
[0075]
b.铺3000个细胞到96孔板中，每组铺3个复孔，样品周围的空孔加入pbs 以维持湿润的环境。
[0076]
c.24h后取出96孔板，弃掉培养基，换成10％的mtt溶液37℃5％co2孵 育4h，4h后换成150μl的dmso溶液(溶解细胞中的甲臜)，避光20rpm处 理10min后读取od490/od570的
吸光度值。
[0077]
d.每间隔1天测量一次，至少3个时间点。
[0078]
实验结果如图4所示，如图4a-c所示，在瞬时过表达zswim1的h1299 细胞，细胞的克隆形成能力明显升高；如图4d所示，mtt检测显示zswim1 促进了肺腺癌细胞的增殖能力；相反，如图4e-g所示，在瞬时敲低或稳定敲低 zswim1的h1299细胞中，细胞的克隆形成能力均明显下降；如图4h所示mtt 检测显示敲低zswim1抑制了肺腺癌细胞的增殖。因此，过表达zswim1蛋白 能够促进肺腺癌细胞的增殖，敲低zswim1蛋白会抑制肺腺癌细胞的增殖。
[0079]
实施例3过表达或敲低zswim1促进肺腺癌细胞迁移、侵袭的结果
[0080]
对swim1对肺腺癌细胞转移能力的影响进行实验，具体实验步骤如下：
[0081]
3.1迁移侵袭实验
[0082]
a.稳定表达zswim1(oe-falg-zswim1)的h1299细胞及其对照细胞 (oe-v)，或者稳定敲低zswim1(kd-zswim1)的h1299细胞及对照细胞(kd-v)，用胰酶(含2.5％edta)消化细胞后离心，无血清的培养基重悬细 胞并用血球计数板统计细胞的数量。
[0083]
所述稳定表达zswim1(oe-falg-zswim1)的h1299细胞及其对照细胞 (oe-v)的构建如下：将ptsb02-gfp-puro和ptsb02-zswim1-flag-gfp质 粒转染293t细胞，转染72h后，收上清培养基至50ml离心管；将收集的上清 培养基，3500rpm，室温离心10min，将上清倒入新的离心管中，用0.45μm滤 膜过滤上清，备用，用于感染肿瘤细胞。
[0084]
b.将小室放入24孔板中，迁移组的小室铺入60000个细胞，侵袭组的小室 加100μl的基质胶后铺入120000个细胞，迁移和侵袭组均设置两个复孔；接着 再沿小室外壁轻轻加入650μl 10％fbs的培养基到小室底部，注意不能产生气 泡，然后把24孔板放在37℃5％co2培养12h。
[0085]
c.收取小室。取出小室，用1xpbs轻轻地清洗一遍，洗完后将其泡在4％多 聚甲醛中固定20min，20min后回收4％多聚甲醛(有毒)并将小室转移到0.1％ 的结晶紫中染色15min，最后用1
×
pbs洗小室，晾干后拍照保存。
[0086]
实验结果如图5所示，如图5a-b所示，在稳定表达zswim1 (oe-flag-zswim1)的h1299细胞中，transwell实验结果表明过表达zswim1 与对照组相比明显促进细胞迁移和侵袭；相反，如图5c-d所示，在稳定敲低 zswim1(kd-zswim1)的h1299细胞中，transwell实验结果显示细胞的迁移 和侵袭能力均明显下降。因此，过表达zswim1促进肺腺癌细胞迁移、侵袭， 敲低zswim1抑制肺腺癌细胞迁移、侵袭。通过检测zswim1在肺腺癌中的表 达量可作为评价药物影响肺腺癌细胞迁移侵袭的一个指标。
[0087]
实施例4 pd98059处理对erk1/2磷酸化和对zswim1表达的影响
[0088]
对zswim1对肺腺癌细胞erk1/2磷酸化的影响进行实验，具体实验步骤 如下：
[0089]
4.1western blot实验
[0090]
a.在稳定表达zswim1(oe-falg-zswim1)的h1299细胞及其对照细胞 (oe-v)中，直接进行实验，或加入pd98059进行处理8小时，用1
×
pbs洗 去残留的培养基，直接在板上加入ebc裂解液于冰上裂解细胞30min，每隔 10min左右晃动六孔板数次，让ebc裂解液充分和细胞接触。
[0091]
b.将细胞裂解液转移至低速离心机4℃12000rpm离心30min。
[0092]
c.取上清液并转移到新的ep管中，弃底部沉淀。
[0093]
d.bca法测蛋白质浓度。e. 制样。根据浓度取相应体积的样品与5
×
sds上样缓冲液混合，沸水浴加热10min使蛋白充分变性。
[0094]
f.配制page胶，将样品上样到page胶的胶孔后，80v电压跑胶30min， 待marker分开后，电压调到100v跑胶1h。
[0095]
g.转膜。切割5.5
×
8.0cm的pvdf膜(聚偏二氟乙烯膜，美国millipore公司， 购自广州铖铵生物科技有限公司货号：iseq00010)，孔径为0.22μm，用100％ 无水甲醇活化3min。取出page胶后在左侧切个角标记好顺序，然后按照胶块 在下，pvdf膜在上贴合地在一起，用刮子刮去接触面中产生的气泡。把胶块和 膜放入卡槽中，100v电压转膜90min，并按所需蛋白的分子大小可适当调整转 膜时间。
[0096]
h.封闭。转膜完成后，将pvdf膜放入5％牛奶中封闭2h。
[0097]
i.孵一抗(flag一抗:日本mbl公司，货号：m185-3s；zswim1抗体： 美国novus公司，货号：nbp2-13606；phospho-p44/42mapk(erk1/2)抗体：美 国cell signaling technology公司，货号：9101；gapdh抗体：美国proteintech 公司货号：10494-1-ap)。按所需蛋白分子大小切割相应条带，4℃20rpm孵 一抗过夜。
[0098]
j.回收一抗，用1
×
tbst洗膜3次，每次时长为5min。
[0099]
k.孵二抗(鼠二抗，美国jackson immuno research公司，货号：115-035-003； 兔二抗，美国jackson immuno research公司，货号：111-035-003)。根据一 抗相应的种属来源孵育同种来源二抗2h。
[0100]
l.洗膜。回收二抗，1
×
tbst洗膜洗3次，每次时长为10min。
[0101]
m.显影。ecl发光液a、b液比例为1:1，避光配置。
[0102]
实验结果如图6所示，如图6a所示在稳定表达zswim1 (oe-flag-zswim1)的h1299细胞中，过表达zswim1与对照组相比明显 促进erk1/2的磷酸化；相反，在稳定敲低zswim1(kd-zswim1)的h1299 细胞中，erk1/2的磷酸化明显下降，如图6b所示；如图6c所示，当细胞中加 入erk1/2的抑制剂pd98059时，两组细胞(oe-v和oe-flag-zswim1)均 出现erk1/2的磷酸化明显下降，zswim1的表达则先升高后下降。因此， pd98059处理能够对erk1/2磷酸化和对zswim1表达产生抑制作用。
[0103]
实施例5 pd98059联合过表达zswim1处理对癌细胞增殖影响
[0104]
对pd98059联合过表达zswim1处理对癌细胞增殖影响进行实验，实验步 骤具体如下：
[0105]
5.1 mtt检测，方法与实施例2中mtt检测方法相同
[0106]
a.在稳定表达zswim1(oe-z)的h1299细胞及其对照细胞(oe-v)中， 加入pd98059(20μg/ml)进行处理10小时，胰酶消化细胞，血球计数板计数。
[0107]
b.铺3000个细胞到96孔板中，每组铺3个复孔，样品周围的空孔加入pbs 以维持湿润的环境。
[0108]
c.24h后取出96孔板，弃掉培养基，换成10％的mtt溶液37℃5％co2孵 育4h，4h后换成150μl的dmso溶液(溶解细胞中的甲臜)，避光20rpm处 理10min后读取od490/od570的吸光度值。
[0109]
d.每间隔1天测量一次，检测3个时间点。
[0110]
实验结果如图7所示，在稳定表达zswim1(oe-zswim1)的h1299细胞 及其对照细胞(oe-v)中，分别加入pd98059(20μg/ml)进行处理，利用mtt 检测细胞的活性变化；如图7所示，在对照组加入pd98059后，细胞的活性明 显下调，而在存在过表达zswim1蛋白的情况下，细胞活性未出现下调现象。 因此，在zswim1表达量较高的情况下，pd98059抑制肿瘤生长的作用受到抑 制。
[0111]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。 任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进 行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所 揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利 要求所涵盖。