一种基于Cas14和链置换扩增的miR-21检测试剂盒及其应用的制作方法

一种基于cas14和链置换扩增的mir-21检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及小分子rna检测和胆管癌诊断领域，更特别地，涉及一种基于cas14a和链置换扩增的mir-21检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.胆管癌是最常见的肝脏恶性肿瘤之一，在患者有临床症状时常已进展到晚期。因此需要一种能够在早期筛查发现胆管癌方法。
3.mirna是一种短rna，通过与mrna相互作用调节蛋白质的表达。根据已有研究，mirna与细胞的生长、分裂和癌变等都息息相关，参与细胞的几乎所有关键过程。此外，有研究发现，一些mirna的表达水平与相关疾病联系密切，可用作相关疾病的检测标记。目前，mir-21已经被证实与胆管癌的发生有关，尤其是，循环mir-21水平可指示胆管癌的进展阶段。因此，可通过检测循环mir-21水平来早期诊断胆管癌。
4.最常用的mirna检测方法主要是northern blotting、microarray analysis和qpcr。其中，northern blotting是mirna检测的黄金方法，微量分析可以高度复用，但通常对血液中低含量的mirna检测不够灵敏。qpcr具有较高的灵敏度，但mirna的短序列特性使得qpcr引物的设计变得复杂。此外，qpcr的仪器昂贵，阻碍了其应用。等温扩增技术已被用于mirna的检测，并极大地促进了mirna图谱分析工具的发展。以mirnas为引物或模板，设计了滚动圆扩增、环介导等温扩增(lamp)、链置换扩增(sda)和指数扩增反应检测mirnas，并结合荧光、电化学以及电化学发光传感平台，可实现对mirna的高灵敏度检测。然而，由于缺乏精确鉴定扩增子的程序，扩增过程可能有助于mirnas的非特异性扩增。
5.crispr-cas系统是为免疫细菌而进化产生，现已发展为用于核酸检测。cas12a、cas13a等crispr-cas系统可以通过与靶基因或rna结合引发特异性激活。cas蛋白的激活可以切割单链rna或dna序列，称为反式切割过程。crispr-cas系统通过荧光团和猝灭基团标记短的dna/rna序列，可以作为核酸扩增的报告器，如pcr，或包括重组酶聚合酶扩增(rpa)和lamp等等温扩增。而cas12a和cas13a则需要具有明确核苷酸的靶序列，如cas12a需要tttv等原生间隔邻近基序。然而，最近的报道表明cas14a具有不受核苷酸限制的识别序列的能力。在这里，我们引入crispr-cas14a作为等温扩增sda的报告器，从而实现了一种快速、等温检测胆管癌肿瘤标志物mir-21的方法。sda的设计非常简单，只需要一个dna序列作为模板。通过crispr-cas14a可以严格检测靶mirna触发的扩增。mirnas的检测可以在1小时内完成。我们使用cas14sda检测胆管癌患者和健康人的血液样本。快速、简单的cas14sda检测可促进mirna的转化，为临床诊断提供依据。


技术实现要素：

6.为解决以上问题，本发明提供了一种用于检测mir-21的试剂盒，包括模板、cas14a、sgrna、报告单链dna、dna聚合和核酸内切酶。
7.在一个具体实施方案中，所述sgrna序列如seq id no:2所示。
8.在一个具体实施方案中，所述模板包括三个结构域，依次为：mir-21结合结构域、内切酶识别切割结构域和cas14a激活结构域。
9.在一个具体实施方案中，所述模板的序列如seq id no:4所示。
10.在一个具体实施方案中，所述核酸内切酶为nt.bstnbi。
11.在一个具体实施方案中，所述模板、核酸内切酶、dna聚合酶混合成预混液i，所述cas14a、sgrna和报告单链dna混合成预混液ii。
12.在一个具体实施方案中，所述预混液i中，还包括等温amp缓冲液和dntp。优选地，所述模板、核酸内切酶、dna聚合酶的物质的量浓度比为4:5:5。
13.在一个具体实施方案中，所述预混液ii中，所述cas14a与所述单链报告dna的浓度比为1:5。优选地，所述cas14a、sgrna和报告单链dna的物质的量浓度比为1:2:5。
14.本发明还提供了上述试剂盒在制备胆管癌诊断剂中的应用。
15.本发明针对mir-21构建了一个专门的cas14-sda体系，该体系可特异地精确定量检测包括临床样品在内的mir-21的含量，并且可用于区分胆管癌患者和健康人员。
附图说明
16.图1为cas14-sda体系定量检测的原理图。
17.图2为cas14-sda体系检测mir-21的可行性验证。其中，a为mir-21触发链置换扩增过程的荧光分析；b为激活剂触发crispr-cas14a的活化的荧光分析；c为cas14-sda体系中不同组分对扩增反应的影响。
18.图3为实验条件的优化。其中，a为信号和背景的荧光强度随反应时间的变化；b为不同的crispr-cas14a蛋白-报告基因摩尔比导致的荧光强度和信噪比。
19.图4为cas14-sda体系检测mir-21的定量能力和特异性。其中，a为mir-21的总浓度与荧光强度的关系；b为添加浓度0-10nm(0、500fm、1pm、5pm、10pm、50pm、100pm、500pm、1nm、5nm、10nm)的mir-21对应的荧光曲线；c为不同mirna对应产生的荧光响应(mir-21、mir-24、mir-141、mir-15、mir-192、mir-378、mir-let-7a)。
20.图5为使用本发明的方法检测血液样品中的mir-21的结果。其中，a为使用本发明的方法检测健康志愿者和胆管癌患者的mir-21的荧光强度统计；b为健康志愿者和胆管癌患者血液样品进行qpcr检测mir-21的ct值统计。
具体实施方式
21.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
22.1、cas14-sda体系进行定量检测mirna的原理
23.cas14-sda体系检测原理如图1所示。cas14-sda体系包括模板、cas14a、sgrna、报告单链dna(一端连接荧光基团，另一端连接淬灭基团)、dna聚合和核酸内切酶nt.bstnbi。
24.其中，模板包括三个模块，依次为mirna结合片段(与mirna互补)、内切酶nt.bstnbi切割位点和cas14a激活片段(与sgrna互补)。样品中的mirna可结合到mirna结合位点上，并在dna聚合的作用下进行链延伸，形成双链dna，双链dna被nt.bstnbi切割，释放cas14a激活片段。cas14a激活片段结合到sgrna上，激活crispr-cas14a核糖核蛋白的反式
切割活性，使cas14a切割报告单链dna，使荧光基团和淬灭基团分开，荧光基团释放荧光，被检测装置读取，然后将荧光强度转化为目的mirna浓度。
25.2、样品处理和总rna提取
26.招募4名胆管癌的患者和4名健康者作为志愿者，采集外周血样品(由福建医科大学协和医院提供)，保存于-80℃下，需要分析时取出。从样品中提取mirna，方法如下：
27.将100μl的样品加入1ml trizol，将匀浆样品转移到1.5ml ep管中，室温下放置5分钟，以完全分离核蛋白复合物。加入0.2ml氯仿进行相分离，12000g离心15min后，将水相转移到另一个干净的ep管中。加入0.5ml异丙基进行rna沉淀。在上述离心管中加入1ml 75％乙醇洗涤rna沉淀。将获得的rna溶解在30μl水中，提取的rna可立即用于在下一步操作或在-80℃保存。
28.3、体系中各试剂的制备
29.本方法中用到的序列见表1所示。
30.表1相关序列
31.名称序列mir-21seq id no:1sgrnaseq id no:2sda体系模板seq id no:3报告单链dnaseq id no:4
32.sgrna的制备方法如下：设计引物对cas14a-sgrna-f和cas14a-sgrna-r(seq id no:5和6)，来扩增cas14a质粒，得到cas14a-sgrna的dna模板。然后,通过使用t7 rna聚合酶转录获得sg-rna。方法如下：
33.将16μl 5
×
转录缓冲液、2μl t7 rna聚合酶(20u/μl)、3μl rntps(25mm的atp、gtp、ctp和ttp)和51μl水与8μl pcr产物混合，在37℃下孵育12h。反应完成后，加入4μl dnase i，于37℃下继续孵育3h以去除dna模板。在85℃下加热15分钟使dnase i失活，得到可用于下一步实验的sgrna。
34.4、cas14-sda体系检测mir-21的验证与优化
35.为确定cas14-sda体系适用于mir-21的检测，我们对每一步进行荧光测量和凝胶电泳分析。我们首先测试了cas14a的活化过程，在没有激活剂(cas14a激活片段)的情况下，荧光值仍然很低(图2a)，因为6-fam的荧光被bhq1基团猝灭。激活剂的加入显著提高了荧光强度，说明cas14a的反式切割活性被激活，切割单链报告基因。对于sda反应，与没有mir-21靶点相比，nt.bstnbi酶和bst dna聚合酶的缺失都没有导致显著的荧光增强。反应体系中同时存在mir-21与nt.bstnbi酶和bst dna聚合酶促进了荧光信号从2015到12881的显著增强。
36.电泳分析进一步证实了sda的过程(图2c)。反应由mir-21(lane 2)启动。它将与模板(lane 1)稳定杂交以启动反应，一个不完整的双链dna/rna双链比mir-21移动得慢，并形成模板(lane 3)。随后，sda反应是通过添加nt.bstnbi酶和bst dna聚合酶(lane 4和lane 5)进行的。此外，利用剪切酶nt.bstnbi可以对双链进行裂解，生成激活剂条带。在没有mir-21(lane5)的情况下，双链模板和激活子的条带没有形成。结果表明，mir-21启动了sda反应。
37.在实验中，我们发现，rispr-cas14a体系的裂解时间对cas14sda检测的荧光响应有很大影响，因此我们首先对其进行了优化(图3a)。当mir-21存在时，荧光强度将随着反应时间的增长而增强,直到40分钟。缺乏mir-21时，在0-80分钟反应时间内，背景荧光强度只引起轻微改变。因此,40分钟被选为最优化的crispr-cas14a裂解反应时间。此外，报告基因的浓度也影响荧光强度(图3b)。阴性组(mir-21缺失)和阳性组(mir-21存在)的荧光强度均随报告基因数量的增加而升高，cas14与报告基因的最大信号与背景(s/b)比为6.65，此时cas14与报告基因比例为1:5。在此比例基础上，增加报告基因，阳性组的荧光强度略有增加，而阴性组的荧光强度急剧增加，导致s/b比值降低。因此，选择cas14a与报告基因的比例为1:5作为优化的实验条件。
38.5、mir-21浓度检测验证
39.通过上面的实验，我们验证了本发明的cas14-sda体系可以检测到mir-21，接下来我们继续验证该体系检测mir-21浓度的准确度，方法如下：
40.首先，将4μl模板(1μm),4μl不同浓度梯度的mir-21，2μl等温amp缓冲液,1μl核苷酸(10mm/atp,gtp,ctp和ttp)，0.5μl nt.bstnbi(10u/μl)和0.5μl bst dna聚合酶(10u/μl)和14μl水混合,混合物在55℃反应30分钟。
41.然后,加入4μl neb buffer 3.1,4μl cas14(1μm),4μl sg-rna(2μm)和4μl报告基因(5μm)添加到反应体系中,最后反应体系在37℃孵育30分钟。使用多功能微孔板检测仪synergy h1通过在480nm激发，并在510nm检测荧光发射的荧光信号。所有样品均进行3次分析。
42.荧光光谱如图4a所示，我们发现随着mir-21浓度的增加，荧光强度逐渐升高。在0.5-50pm浓度范围内，荧光强度与mir-21浓度的对数(lg)值呈良好的线性关系(图4b)。根据3σ/s计算，检测限估计为680fm(σ为空白溶液的标准差，s为校准曲线的斜率)。相关回归方程为y＝625.89x+2205.7(r2＝0.9826)，其中x和y分别代表mir-21浓度的对数(lg)值和cas14sda检测的荧光强度。这些结果表明，cas14sda实验可以作为一个检测mir-21的敏感检测平台。
43.区分mirna之间的差异对于探索人类疾病与mirna生物学功能之间的关系具有重要意义。然而，由于mirna序列的高度相似性和序列较短，区分不同mirna仍然是一个巨大的挑战。为了评价本文方法的选择性，我们通过将cas14sda系统暴露于不同的mirna(mir-24,mir-141,mir-155,mir-192,mir-378,let-7a)来对它的选择性进行评估。在这些mirna中，实验组(在有mir-21存在的情况下)与其他干扰组(在有其他mirna存在的情况下)相比，荧光增强效果明显，干扰组的荧光强度与空白组几乎相同(图4c)。这些结果表明所构建的方法对mirna检测具有显著的特异性。
44.6、临床胆管癌样品检测
45.使用上述cas14-sda体系检测采集的血液样本的总rna提取液中mir-21的含量，结果如图5所示。总rna样本被稀释到100ng/μl，用于cas14sda检测。荧光强度如图5a所示，样品平行检测三次。这些结果表明，mir-21在健康志愿者和胆管癌患者之间有不同程度的表达。患者血液中mir-21的表达明显低于健康志愿者。同时，对血样进行rt-qpcr分析(图5b)。8份样品的cas14sda检测结果与rt-qpcr检测结果一致。对cas14-sda检测的初步估计表明其在非侵袭性诊断胆管癌方面有潜在的应用价值。
46.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。