温郁金凝集素高纯品、制备方法及应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种温郁金凝集素高纯品、制备方法及应用。


背景技术：

2.温郁金curcuma wenyujin y.h.chen & c.ling系姜科姜黄属植物，是浙江省道地药材，其地下根茎、块根采用不同加工方式可制成莪术、片姜黄和郁金等三种中药。现代研究表明从温郁金根茎提取的挥发油（莪术油）含有蓬莪术二烯、莪术醇、郁金二醇、莪术烯、δ-榄香烯、β-榄香烯等萜类成分，具有抗病毒、抗炎、镇痛、抗肿瘤等疗效。然而，温郁金中萜类有效含量低，拓展温郁金新药源是今后发展趋势。
3.植物凝集素是一类非免疫原性蛋白，蛋白分子表面含有众多糖特异结合的位点。最近研究发现，植物凝集素可以特异性结合癌细胞膜表面的糖分子，从而导致癌细胞凋亡或抑制肿瘤的生长，是药物设计开发和医学应用的新领域。我们前期通过高通量基因组测序发现，温郁金根茎中含有大量编码凝集素蛋白的基因，其表达量很高，暗示温郁金根茎含有丰富的植物源凝集素蛋白。因此，提取制备高纯度的温郁金凝集素产品具有广阔的应用前景。
4.中国专利文献“一种温郁金凝集素粗品、纯品、pgrp菌株混合物的制备方法及温郁金肥料”（专利号：cn 109553672a）公开了一种温郁金凝集素的提取方法，包括：打浆、酶解、硫酸铵沉淀、透析等步骤，所得产品为凝集素粗品，该技术产品主要应用于植物地下根茎促生细菌菌株（pgrp）的结合，从而制备生物肥料。上述专利实施过程中采用了丙酮、石油醚等有机溶剂，技术产品也达不到直接作为生物药物开发新药源的需求。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种温郁金凝集素高纯品、制备方法及应用。
6.本发明所采取的技术方案如下：温郁金凝集素高纯品的制备方法，包括以下步骤：s1: 样品处理：将新鲜的温郁金根茎洗净、去皮、粉碎，加入tris-hcl缓冲液，浸提12~16 h，离心，收集上清液；s2: 粗品制备：在步骤s1得到的上清液中加入固体硫酸铵并充分搅拌至饱和度为60~70%，静置10~12 h，离心，沉淀物tirs-hcl缓冲液溶解，透析，冷冻干燥得温郁金凝集素粗品；s3: 半成品制备：将步骤s2得到的温郁金凝集素粗品加入tris-hcl缓冲液溶解，用deae-52纤维素阴离子交换柱分离纯化，使用含0.2~1.0 mol/l nacl的tris-hcl 缓冲液梯度洗脱，合并收集具凝血活性的蛋白峰，冷冻干燥得温郁金凝集素半成品；s4: 高纯品制备：将步骤s3得到的温郁金凝集素半成品加入tris-hcl缓冲液溶解，用葡聚糖凝胶sephadex g-75柱分离纯化，使用含0.2~1.0 mol/l nacl的tris-hcl 缓
冲液梯度洗脱收集具凝血活性蛋白峰的试管液，合并，冷冻干燥得温郁金凝集素高纯品。
7.步骤s1中浸提及步骤s2中静置均于4~6 ℃进行。
8.步骤s1中的粉碎物质量与缓冲液体积的料液比1：4~6。
9.步骤s3中凝集素粗品和步骤s4中的半成品均使用重量/体积为1：8~15的料液比的tris-hcl缓冲液进行溶解。
10.步骤s3和s4中梯度洗脱过程中，包含采用紫外分光光度计实时监测流出液280 nm处的吸光值的步骤，以此确定洗脱液的蛋白峰，直至流出液吸光值趋于正常值为止。
11.步骤s1和s2中离心的具体参数如下：温度4~6 ℃，转速5000 ~8000 rpm，离心时间10~15 min。
12.所述tris-hcl 缓冲液浓度为10~12 mm，ph=7~9。
13.如上所述的制备方法制备得到的温郁金凝集素高纯品。
14.如上所述的温郁金凝集素高纯品用于制备抗肿瘤药物的应用。
15.一种抗肿瘤药物，其包含如上所述的温郁金凝集素高纯品。
16.本发明的有益效果如下：本发明制备得到的温郁金凝集素纯度高，杂蛋白少，可保障产品的药效价值。进一步的，本发明所提供的温郁金凝集素高纯品具有广谱抗肿瘤活性，对肺癌h460、肺癌a549、乳腺癌bt-549、肝癌smmc-772、结肠癌hct-116等细胞的50%的抑制浓度（ic
50
）分别为146.60 ug/ml、113.38 ug/ml、141.96 ug/ml、138.10 ug/ml、98.46 ug/ml。本发明得到纯品凝集素可作为抗肿瘤药物研发的新药源，有利于加速新颖性天然蛋白药物的开发。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
18.图1 是实施例1中温郁金凝集素阴离子交换色谱deae-52柱层析洗脱曲线。
19.图2 是实施例1中温郁金凝集素半成品葡聚糖凝胶色谱sephadex g-75柱层析洗脱曲线。
20.图3 是实施例1所制备的温郁金凝集素纯品wlt的sds-page图。
21.图4 是实施例1-3所制备的温郁金凝集素纯品wlt凝血活性图。
22.图5 是实施例1-3所制备的温郁金凝集素纯品wlt抗肺癌a549细胞活性图。
23.图6 是实施例1-3所制备的温郁金凝集素纯品wlt抗肺癌h460细胞活性图。
24.图7 是实施例1-3所制备的温郁金凝集素纯品wlt抗乳腺癌bt-549细胞活性图。
25.图8是实施例1-3所制备的温郁金凝集素纯品wlt抗肝癌smmc-772细胞活性图。
26.图9是实施例1-3所制备的温郁金凝集素纯品wlt抗肝癌结肠癌hct-116细胞活性图。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一
nacl的tris-hcl 缓冲液（ph=9，12 mm）进行梯度洗脱，蠕动泵控制流速为0.5 ml/min，每管收集5 ml，收集具有凝血活性蛋白峰的试管液，合并，冷冻干燥得即得凝集素高纯品wlt。wlt蛋白sds-page电泳检测结果同实施例1。
37.实施例3：一种温郁金凝集素高纯品，其制备过程如下：s1: 样品处理：取300 g新鲜温郁金根茎洗净、去皮，匀浆机粉碎，加入1800 ml 的tris-hcl缓冲液（ph=8，浓度为10 mm），置5 ℃冰箱浸提14 h，6℃，6000 rpm转速离心12 min，收集上清液。
38.s2: 粗品制备：上述上清液置于磁力搅拌器上并加入固体硫酸铵充分搅拌至饱和度为60%，置5 ℃冰箱浸提12 h，6 ℃，6000 rpm转速离心12 min，沉淀物使用tirs-hcl缓冲液（（ph=8，浓度为10 mm）溶解，透析除盐，24 h后冷冻干燥得温郁金凝集素粗品。
39.s3: 半成品制备：取上述凝集素粗品1 g，溶于8 ml tris-hcl缓冲液（ph=8，浓度为10 mm）中，溶解液上deae-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，使用含1.0 mol/l nacl的tris-hcl 缓冲液（ph=8，10 mm）进行梯度洗脱，蠕动泵控制流速为0.5 ml/min，每管收集5 ml，合并收集具有凝血活性蛋白峰的试管液，冷冻干燥即得凝集素半成品。
40.s4: 高纯品制备：取上述凝集素半成品500 mg溶于7.5 ml的tris-hcl缓冲液（ph=8，浓度为10 mm）中，溶解液上葡聚糖凝胶sephadex g-75柱进行分离纯化，使用含1.0 mol/l nacl的tris-hcl 缓冲液（ph=8，10 mm）进行梯度洗脱，蠕动泵控制流速为0.5 ml/min，每管收集5 ml，收集具有凝血活性蛋白峰的试管液，合并，冷冻干燥得即得凝集素高纯品wlt。wlt蛋白sds-page电泳检测及其结果同实施例1。
41.本发明制备的温郁金高纯品凝集素wlt为甘露糖结合型凝集素，对人体肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌细胞具有明显的抑制作用，可作为抗癌药物的新药源。
42.为了进一步了解温郁金凝集素wlt特点，以下对其糖抑制性和抗肿瘤活性进行详细描述。
43.实施例4：温郁金凝集素wlt凝血活性检测与糖抑制实验取上述wlt凝集素配成0.5 mg/ml溶液。96孔板中加入50 μl生理盐水（含10 mm ca
2+
），并在各行首孔中加入50 μl凝集素溶液，每孔再加入50 μl 2%兔红细胞悬液，混匀，室温静置2 h后观察结果。结果如图4，表明温郁金凝集素wlt具有强烈凝血活性。
44.将d-葡萄糖、d-果糖、d-甘露糖、d
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半乳糖、d-阿拉伯糖及l-鼠李糖配制成50 mm的糖溶液，分别取30 μl 糖溶液和30μl 2% 的兔血红细胞悬液加入到96 孔板中，混匀，随后各行首孔中加入40 μl凝集素溶液，室温静置2 h后观察凝血效果。糖抑制试验结果见表1，其中d-甘露糖溶液对wlt凝集素活性抑制最明显，其它糖溶液具有少量的抑制效果，说明d-甘露糖能够与红细胞竞争性结合wlt，因此wlt属甘露糖结合型的凝集素。
45.实施例5：温郁金凝集素wlt抗肿瘤细胞系的活性检测
采用cck-8法检测wlt抗肿瘤活性，所用肿瘤细胞系为肺癌a549、肺癌h460、乳腺癌bt-549、结肠癌hct-116、肝癌smmc-772。分别取对数生长期的细胞，各细胞系用培养基配成溶度为2
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106个/ml，每孔取200 μl加入到96孔板中培养，培养至贴壁; 配制10 mg/ml温郁金凝集素wlt母液，加入至96孔板中，稀释成浓度为0、20、50、100、200 ug/ml凝集素的含药培养基，培养48 h;随后，每孔再加10 μl cck-8溶液，置于培养箱中孵育30 min，在酶标仪上于450 nm处读取吸光度值，试验重复3次，计算细胞抑制率。空白对照为含cck-8溶液的培养基；对照组为含细胞与cck-8溶液的培养基（未添加药物）。按以下公式统计肿瘤细胞生长抑制率：肿瘤细胞生长抑制率（%）= ，ic
50 为细胞生长抑制率为50%的药物质量浓度。
46.结果如图5~9所示，温郁金凝集素wlt对肿瘤细胞系具有明显的抑制作用，随wlt给药剂量的增加，细胞生长抑制率呈上升趋势，表明抑制率呈剂量效应关系。wlt对肺癌h460细胞、肺癌a549细胞、乳腺癌bt-549细胞、肝癌smmc-772细胞、结肠癌hct-116细胞的50%的抑制浓度（ic
50
）分别为146.60 ug/ml、113.38 ug/ml、141.96 ug/ml、138.10 ug/ml、98.46 ug/ml。尤其，温郁金凝集素wlt对结肠癌hct-116细胞抑制作用最为明显。
47.上述实施例中采用的材料、试剂等，如无特殊说明均可商业途径采购。
48.以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。