一种里氏木霉及其降解秸秆的方法与流程

1.本发明属于土壤环境治理领域，特别涉及一种降解秸秆的里氏木霉及其降解秸秆的方法。


背景技术：

2.微生物降解秸秆，使秸秆分解产生营养成分，例如，将纤维素有效水解成纤维糊精、纤维二糖等中间产物，纤维素二糖在纤维二糖酶的作用下生成葡萄糖。微生物有机肥能够进行土壤肥力恢复和调控，其代谢产生的植物激素、维生素以及酸性物质等能不同程度地促进植物生长。以来源易得的农副产品为培养基，采用发酵培养制得肥料，提高农副产物的附加值，提高生产性能，提高农副产物利用率，降低成本，提高经济效益，对保护耕地土壤资源、实现农业可持续发展具有重要意义。
3.目前能够降解秸秆的菌种有很多种，中国申请号201810941807.3，含解淀粉芽孢杆菌的低温降解秸秆微生物复合菌剂及应用，采用的是6种菌的混合菌剂。中国申请号cn201710804153.5，地衣芽孢杆菌在秸秆降解中的应用、包含该菌的微生物菌剂及其应用，发酵温度为18℃-30℃。
4.中国申请号cn202110217463.3一种低温高效玉米秸秆降解菌剂的制备方法及应用，本发明所述菌剂由2个单株细菌组配而成，2个单株细菌分别为假单胞菌(pseudomonas sp.)和不动杆菌(acinetobacter sp.)。
5.中国申请号cn201910433174.x一株高温秸秆降解细菌b-8，分类命名为土芽孢杆菌geobacillus sp.。细菌b-8能产生有关降解纤维素和半纤维素的酶类，将农作物秸秆中的大分子物质转化为可供植物吸收利用的小分子物质，实现高温条件下农业废弃物的资源化利用。实验表明，水稻秸秆接种b-8菌剂后，75℃、170r/m液体发酵培养7d，水稻秸秆的降解率为17.67％。
6.但是由于环境温度或菌体生长速度的限制，这些现有技术中的菌种对秸秆的降解效果尚有待提高，或者有时需要采用混合菌剂。


技术实现要素：

7.本发明的目的开发能够单独使用的降解秸秆效果较好的菌种，提供了一种里氏木霉及其降解秸秆的方法。
8.为了实现本发明的目的，本发明的技术方案之一为，一种里氏木霉(trichoderma reesei)，编号s876-2，保藏编号cgmcc no.23276，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间2021年10月11日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
9.菌种培养：采用pda基本培养基。
10.本发明的技术方案之二为，里氏木霉降解秸秆的方法之一，包括如下步骤：
11.1)将粉碎的秸秆用去离子水泡发后，烘干；
12.2)在培养瓶中加入液态发酵液和烘干的秸秆，然后接入s876-2里氏木霉的菌悬液，在20～25℃的振荡培养箱中培养10～20天。
13.进一步的，上述里氏木霉降解秸秆的方法，所述液态发酵液、秸秆和菌悬液的比例为：90～100ml：4～6g：2～6ml。
14.进一步的，上述里氏木霉降解秸秆的方法，所述菌悬液的浓度为孢子数1～9
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107/ml。
15.进一步的，上述里氏木霉降解秸秆的方法，所述液体发酵培养液为：每3000ml去离子水中加入蛋白胨5～6g，mgso4.7h2o 1.2～1.5g，kh2po42.5～3.0g，nacl1.2～1.5g/l，cacl20.4～0.6g，酵母膏1.2～1.5g，并将溶液ph调至6.8～7.2。
16.里氏木霉降解秸秆的方法之二，包括如下步骤：
17.1)取秸秆，与含有s876-2里氏木霉的液态发酵液，加到物料中混合均匀；
18.2)将混合物料堆制成条垛状，上覆塑料布，用于防雨和防止热量散失；
19.3)控制初期发酵温度在26～30℃之间，含水率在55～60％之间，当堆腐物温度达到55℃时，掀开塑料布通风，使其与外界空气接触2h，然后盖上塑料布继续堆腐，每隔四至五天通风一次，直至堆腐物颜色变为黑褐色、手感明显变软即腐熟完毕。
20.进一步的，上述里氏木霉降解秸秆的方法，所述菌悬液的浓度为孢子数1～9
×
107/ml。
21.进一步的，上述里氏木霉降解秸秆的方法，所述秸秆与液态发酵液的比例为100kg：2～3l。
22.与现有技术相比，本发明的优势在于：
23.本发明的里氏木霉取自铁尾矿改良的盐碱土，单一菌种对秸秆降解率20天达到50％。
24.说明书附图
25.图1、里氏木霉s876-2(400
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)的图片。
具体实施方式
26.实施例1
27.里氏木霉的分离纯化选育方法，包括如下步骤：
28.1、获取目标菌株：无菌室，超净工作台上，称量20份经铁尾矿改良后的盐碱土土样，均匀的铺在培养皿内部，采用琼脂水培养基培养，将培养皿放入15℃-45℃培养箱中分别培养一周。
29.2、纯化目标菌株：无菌室，超净工作台上，将目标菌株的肉眼可见菌落，分离划线到pda基本培养基(200g新鲜马铃薯、20g蔗糖、15g琼脂、1000ml水)平皿中，15℃-45℃培养箱分别培养24小时。
30.3、目标菌株确证：无菌室，超净工作台上，向灭菌好的培养皿中加入秸秆水98％、琼脂2％的培养基，纯化目标菌株中分离的单菌落划线接种，将其分别放入15℃-45℃、培养箱分别进行培养。
31.4、目标菌株驯化：铁尾矿改良土壤、秸秆铺满平皿，采用1.5％琼脂水培养基，将确证后菌株接种到培养基上。
32.5、将目标菌株再次筛选，得到纯化菌株。
33.s876-2里氏木霉菌株为棉絮状，起初为白色致密的平坦菌丝，而后边缘出现浅绿的产孢子丛束区，分生孢子梗菌丝的短侧枝透明，小梗瓶形，中部弯曲，分生孢子椭圆形或长形，单细胞，透明，无色，壁光滑，成堆时绿色。
34.里氏木霉s876-2(400
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)的图片见图1。
35.实施例2
36.s876-2里氏木霉酶活测定：
37.以葡萄糖溶液的含量作为横坐标，以od值作为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线方程。
38.粗酶液的提取：将所筛s876-2菌株的14-40小时菌悬液吸取5ml于液体产酶培养液中培养，于4000r/min离心10min，弃沉淀，余下上清液即为粗酶液，用于后续操作。
39.滤纸酶活力的测定(fpa酶活测定)：各试管中加入0.5ml粗酶液和1.5ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，在各个空白组中加入1.5ml 3，5-二硝基水杨酸试剂(dns试剂)，钝化空白组酶活，终止酶反应。将试管混匀后放到50℃的水浴锅中水浴5～10分钟。然后将准备好的0.05g的卷好的滤纸条放各个试管中，保温1h后取出，立即向实验组的试管中加上1.5ml的3，5-二硝基水杨酸试剂(操作要快，快速终止反应)。在试管内溶液完全混匀后，放到100℃的水浴锅中，水浴加热5分钟，时间到后，取出放到冷水中，迅速降温冷却，用去离子水定容至20ml。以空白组做标定，调零，在波长540nm的紫外分光光度计下测定各个的吸光值，记录下结果。
40.根据上述每组三个吸光度的平均值，在葡萄糖标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，计算得出酶活力5.9u/ml。
41.实施例3
42.将粉碎的玉米秸秆用去离子水泡发后，在105℃的烘箱烘干至恒重，在250ml的锥形瓶中加100ml液态发酵液(液体发酵培养液：称量蛋白胨6g，mgso4.7h2o1.5g，kh2po43.0g，nacl 1.5g/l，cacl20.6g，酵母膏1.5g，煮溶于3000ml去离子水中，ph7.0，分装于锥形瓶内，在121℃的高压灭菌锅灭菌30分钟后，备用)，再加入5g干的秸秆，然后接入5ml降解秸秆的菌悬液(孢子数2.87
×
107/ml)，做五组平行实验，在25℃的振荡培养箱中培养，每四天测一次，计算秸秆前后重量的差值来算出秸秆的降解率。4天：20.88％，8天：32.74％，12天：36.42％，16天：45.22％，20天：49.54％。
43.实施例4
44.将粉碎的玉米秸秆用去离子水泡发后，在105℃的烘箱烘干至恒重，在250ml的锥形瓶中加100ml液态发酵液(液体发酵培养液：称量蛋白胨6g，mgso4.7h2o1.5g，kh2po43.0g，nacl 1.5g/l，cacl20.6g，酵母膏1.5g，煮溶于3000ml去离子水中，(ph7.0)，分装于锥形瓶内，在121℃的高压灭菌锅灭菌30分钟后，备用)，再加入5g干燥的玉米秸秆，按液态发酵液质量比的2％、3％、4％、5％、6％接入降解秸秆的菌悬液(孢子数2.87
×
107/ml)，每个菌做五组平行，在25℃的振荡培养箱中培养16天，水洗除去菌体及可溶物，测定秸秆的失重率。接入质量比为2％、3％、4％、5％、6％秸秆的降解率43.30％、44.10％、44.60％、45.22％、45.10％。
45.实施例5
46.取秸秆1吨，与含有浓度为孢子数2.87
×
107/ml的s876-2里氏木霉液态发酵液25升，混合均匀。将混合物料堆制成宽1.5m，高1.2m的条垛状，上覆塑料布，用于防雨、防止热量散失。控制初期发酵温度25℃，含水率在55％，当堆腐物温度达到55℃时，掀开塑料布通风，使其与外界空气接触2h，然后盖上塑料布继续堆腐，每隔四至五天通风一次，每次1.5h，直至堆腐物颜色变为黑褐色、手感明显变软即腐熟完毕，共计45天。