一种NLS-RARα单克隆抗体的制备方法和一种基于该抗体的快速检测卡及其制备方法

一种nls-rar
α
单克隆抗体的制备方法和一种基于该抗体的快速检测卡及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种nls-rarα单克隆抗体的制备方法和一种基于该抗体的快速检测卡及其制备方法。


背景技术：

2.急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，apl)在fab分型中属m3亚型，是一种有特异染色体改变和融合基因的特殊类型急性白血病。apl在早期常发生严重出血及弥散性血管内凝血(dic)，一直被认为是最凶险的急性白血病尽管应用全反式维甲酸和砷剂靶向诱导疗效可靠，但仍有15％的apl患者因诊断不及时而出现早期死亡。
3.目前，apl诊断主要依赖骨髓形态学、染色体检测、荧光原位杂交(fish)、免疫分型和融合基因检测技术。骨髓形态学是直接肉眼镜检骨髓细胞形态来进行分型诊断，因细胞形态异质性和多形性，即使有经验的人员也常常与其他类型白血病混淆，给临床带来困扰甚至误诊。染色体检测和荧光原位杂交(fish)可检测apl典型t(15；17)(q22；q21)染色体核型改变；免疫分型是利用流式细胞术检测apl细胞表面免疫标志cd33、cd13等；而融合基因检测是运用实时定量pcr(rq-pcr)检测特征性白血病-维a酸受体α(pml-rarα)融合基因。这些技术较形态学更为客观、灵敏，但亦存在诸多局限性：
①
仪器设备昂贵(需流式细胞仪、免疫荧光显微镜等)；
②
检测周期长(需要数天)；
③
检测人员技术要求高；
④
经济成本高，患者负担重；
⑤
需要骨髓样本，不能检测外周血，不易取材，对患者创伤大。因此，探索可早期、快速、客观检测apl的新技术非常必要。
4.apl在遗传学上以t(15；17)(q22；q21)染色体异位和pml-rarα融合基因为特征，后者编码形成的pml-rarα融合蛋白是apl发生发展的关键。既往大部分研究都将pml-rarα融合蛋白作为一个整体，然而，本团队前期创新性发现，ne裂解pml-rarα融合蛋白生成的nls-rarα蛋白是促进apl的发生发展另一关键指标，是早期诊断apl的新型诊断标志物。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种nls-rarα单克隆抗体的制备方法和基于该抗体的apl快速检测卡，该检测卡是基于nls-rarα新型蛋白标志物为核心，通过制备nls-rarα特异性单克隆抗体，进而结合免疫相关技术，研发用于apl的快速检测卡。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明提供了一种nls-rarα单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
8.s1、根据nls-rarα靶蛋白序列选择和设计免疫原；
9.s2、用s1设计的免疫原进行实验动物免疫；
10.s3、将s2免疫后的实验动物的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；
11.s4、将s3中融合的杂交瘤细胞培养2-3周后，取培养液上清进行elisa检测，初步筛选阳性克隆；
12.s5、采用免疫印迹方法进行验证与再次筛选，获得特异性好，抗体浓度高的阳性克隆；
13.s6、大量制备单克隆抗体。
14.作为本发明的优选实施方式，所述免疫原为com-1a，所述com-1a的序列为vqsvpgahpvpv-c，所述com-1a对应的抗体为1a，1a多肽针对pml-rarα的ne切割位点，可以特异性识别nls-rara特异性多肽。
15.作为本发明的优选实施方式，s2中动物免疫选择的动物为健康的新西兰大白兔。
16.作为本发明的优选实施方式，s2中实验动物免疫的具体步骤为：选取健康的新西兰大白兔按常规实验兔注射免疫方法进行动物免疫，免疫注射共5针，注射免疫间隔3周、2周、2周、2周，免疫注射前com-1a免疫原需要与合适的佐剂1:1混合，充分乳化以保证免疫注射的效果。作为本发明的优选实施例，s4中的elisa检测所用的多肽有com-1a和com-1b，所述com-1b的序列为vpgahpvpvya-c，所述com-1b对应的抗体为1b，1b多肽，没有特异性，可同时识别nls-rarα和pml-rarα。
17.作为本发明的优选实施方式，s4中初步筛选阳性克隆的标准为：克隆体培养液上清同时与cqm-1a-bsa和cqm-1b-bsa蛋白反应，呈双阳性的克隆视为可以同时nls-rarα和pml-rarα；只与cqm-1a-bsa蛋白反应呈阳性的克隆视为更有可能只识别nls-rarα特异切割片段，即为筛选的目的克隆。
18.作为本发明的优选实施方式，s5中筛选阳性克隆的标准为：将克隆体培养液上清分别与经慢病毒转染了nls-rarα质粒的293t细胞和转染空载对照质粒的293t细胞的蛋白提取物进行免疫印迹验证，可与转染了nls-rarα质粒的293t细胞蛋白提取物反应而不与转染了空载的293t细胞蛋白提取物反应的克隆为理想克隆。
19.作为本发明的优选实施方式，s6的具体步骤为：将s5中选取的阳性克隆，经细胞裂解后制备抗体mrna模板，以所述模板进行rt-pcr反应得到抗体的重链和轻链cdna，进行测序确认后构建到表达载体，构建好的抗体表达质粒转染细胞制备nls-rarα重组单克隆抗体，经蛋白纯化柱纯化后的抗体即为单克隆抗体。
20.本发明提供了一种基于nls-rarα单克隆抗体的apl快速检测卡的制备方法，包括如下步骤：
21.s1、运用免疫胶体金标记nls-rarα特异性单克隆抗体；
22.s2、用金复溶液将沉淀复溶后铺在6mm
×
150mm金垫上干燥备用；
23.s3、用所述nls-rarα特异性单克隆抗体原液和稀释液分别包被在nc膜上检测线和质控线上，低湿度进行干燥备用；
24.s4、选取底板，从上到下依次粘贴吸水纸、nc膜、金垫、样品层析垫，组装获得针对nls-rarα的快速检测反应板。
25.本发明提供了一种基于nls-rarα单克隆抗体的apl快速检测卡，采用上述的制备方法制得。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
27.1.本发明提供了一种nls-rarα单克隆抗体的制备方法，根据nls-rarα靶蛋白序列，设计特异性好的免疫原，从而得到特异性好的nls-rarα单克隆抗体。
28.2.本发明提供基于nls-rarα单克隆抗体的apl快速检测卡，具有微创、方便、快速、
经济的特点，可用于外周血检测，且不需要特殊设备，是现有诊疗技术所不具备的优势，且较现有技术更易推广。
附图说明
29.图1为nls-rarα靶蛋白序列；
30.图2为nls-rarα动物免疫血清的elisa验证；
31.图3为阳性克隆的wb验证与筛选；
32.图4为#36、#47、#49三株克隆体的验证；
33.图5为cqm-1a-bsa#36单克隆抗体滴度检测；
34.图6为.sds-page电泳验证nls-rarα重组单克隆抗体特异性；
35.图7为apl快速检测技术原理示意图；
36.图8为apl快速检测技术结果判读规则。
具体实施方式
37.下面结合附图，对本发明作详细的说明。
38.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
39.实施例1
40.制备nls-rarα单克隆抗体
41.nls-rarα靶蛋白序列如图1所示，根据nls-rarα序列的结构性质、片段免疫原性和水溶性进行分析，选择和设计免疫原。
42.确定多肽免疫原序列，序列见表1。其中com-1a序列vqsvpgahpvpv-c为nls-rarα的1-12氨基酸位点，对应的1a多肽针对pml-rarα的ne切割位点，是可以特异性识别nls-rara特异性多肽。com-1b序列vpgahpvpvya-c为nls-rarα的4-14氨基酸位点，对应的1b多肽没有特异性，理论上能识别nls-rarα，也能识别pml-rarα，主要用来筛选和对照验证。确定序列后，通过人工化学方法合成免疫原。合成好的多肽经过lc-ms进行分子量分析，确定氨基酸序列的正确性和利用hplc方法进行纯度检测，保证纯度不低于90％，符合要求后作为免疫原进行实验动物免疫。
43.表1.nls-rara单抗制备的免疫原序列
44.肽段名称序列用途pepitde1com-1avqsvpgahpvpv-c用于免疫pepitde2com-1bvpgahpvpvya-c用于筛选和对照验证
45.用合成好的多肽免疫原com-1a进行实验动物免疫：
46.选取健康的新西兰大白兔按常规实验兔注射免疫方法进行动物免疫，免疫注射共4-5针，注射免疫间隔3+2+2+2(周)，免疫注射前免疫原需要与合适的佐剂1:1混合，充分乳化以保证免疫注射的效果。期间收集少量兔血清运用elisa方法进行效价检测，评估免疫效果。结果显示：经免疫的两只家兔(编号1141、1142)的血清，均能够与免疫原com-1a和转染nls-rarα质粒的u937细胞(nr)蛋白提取物发生抗原抗体反应，符合预期。结果见图2所示，
其中,nc代表转染空载对照质粒的u937蛋白提取物，nr代表转染nls-rarα质粒(带ha标签)的u937细胞蛋白提取物，com1a代表com-1a免疫原。
①
pre-1141：编号1141家兔免疫前血清；
②
pre-1142：编号1142家兔免疫前血清；
③
anti-1141：编号1141家兔免疫后1个月血清；
④
anti-1142：编号1142家兔免疫后1个月血清；
⑤
anti-ha：抗ha抗体，用作实验对照。
47.免疫结束后分离实验动物的脾细胞并与骨髓瘤细胞进行融合开发杂交瘤细胞。融合操作的细胞混合物补充fbs等营养后，静置于细胞培养箱中培养2-3周，取杂交瘤培养上清进行elisa检测，初步筛选阳性杂交瘤克隆，od(sups 1：20)＞1.0视为阳性克隆。其中，cqm-1a-bsa和cqm-1b-bsa双阳性的克隆说明可以同时识别nls-rarα和pml-rarα。只有cqm-1a-bsa阳性的克隆说明更有可能只识别nls-rara特异片段，结果见表2所示。
48.表2.elisa筛选杂交瘤克隆的免疫
49.[0050][0051]
为进一步筛选抗体效价更高的阳性克隆，保证抗体的特异性和敏感性。我们先将空载(nc)与nls-rarα(nr)质粒导入293t细胞，同时采用免疫印迹(wb)方法对克隆体进行验证与再次筛选，结果显示：#36、#47、#49三株克隆体特异性较好，抗体浓度较高，结果见图3和图4，其中
①
293t-nc：转染空载对照质粒的293t细胞
②
293t-nr：经慢病毒转染nls-rarα质粒的293t细胞。
[0052]
选取cqm-1a-bsa#36阳性克隆，经细胞裂解后制备抗体mrna模板，以此模板结合使用专门设计的引物进行rt-pcr反应扩增出来抗体的重链和轻链基因(cdna)，并进行测序确认以后构建到表达载体。构建好的抗体表达质粒转染hek293细胞制备nls-rarα重组单克隆抗体，经蛋白纯化柱纯化抗体后，用elisa检测单克隆抗体浓度，见图5，用sds-page电泳再次验证nls-rarα重组单克隆抗体的特异性，见图6。纯化后的抗体用pbs缓冲低温保存。
[0053]
实施例2
[0054]
制备基于nls-rarα单抗的apl快速检测卡
[0055]
运用免疫胶体金标记nls-rarα特异性单抗，用金复溶液将沉淀复溶后铺在6mm
×
150mm金垫上干燥备用。用nls-rarα抗体原液和稀释液分别包被在nc膜上检测线和质控线上，低湿度进行干燥备用。选取底板，从上到下依次粘贴吸水纸、nc膜、金垫、样品层析垫，组装获得针对nls-rarα的快速检测反应板。快速检测技术原理示意图见图7，结果判断规则见
图8。
[0056]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。