一种贴壁细胞大规模培养工艺的制作方法

1.本发明涉及细胞体外培养技术领域，特别是涉及一种贴壁细胞大规模培养工艺。


背景技术：

2.细胞大规模培养工艺是干细胞治疗、细胞农业等新兴技术应用的基础。目前常用的贴壁细胞大规模培养工艺技术主要有种：一种是在培养皿中通过贴壁方式小规模、手动的进行细胞培养，如市面上常见的corning公司的pe包被塑料培养皿，该装置具有生产成本低、操作简便、细胞生长状态稳定等特点，另外，近年来在此基础上开发的可进行贴壁细胞规模化扩增的细胞工厂也被广泛应用于疫苗生产、抗体制备等研究和应用领域；另一种是生物反应容器，相对于前一种培养方式生物反应容器是一种更为高效的细胞大规模扩增培养设备，具有生产规模大、细胞生长密度高、培养基利用效率高等突出优点，近年来被广泛应用于疫苗、单抗等对细胞培养规模和培养质量严格要求的生物医疗行业。
3.然而，在实践中上述两种细胞培养方式都存在一定的不足，培养皿的空间利用率低、人工操作效率低等缺点导致其无法进行大规模应用，细胞工厂中的细胞难以进行观测和调整，导致其生长过程中易出现细胞分布不均，单位面积细胞产率明显低于培养皿。生物反应容器的细胞培养方式虽然可以实现细胞的高密度、大规模生产，但要使用微载体、生物反应器等昂贵的耗材和设备，并且对配套设备、生产环境、操作技术等方面的要求都非常高，这极大提高了该设备使用门坎。
4.因此，亟需设计一种适于贴壁细胞低成本、大规模培养的培养工艺。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种贴壁细胞大规模培养工艺，以解决上述现有技术存在的问题，能够具有操作简便、生产成本低、培养基利用率高、细胞生长状态稳定等优点，可广泛应用于细胞农业、生物医疗等生物领域，具有广阔的应用前景。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：本发明提供一种贴壁细胞大规模培养工艺，其特征在于，包括以下步骤：
7.s1对细胞培养层清洗，并用酸液进行多次浸泡；
8.s2对细胞培养层加热灭菌；
9.s3将细胞培养层与补料瓶通过蠕动泵连通，并向补料瓶内加入pbs；
10.s4对补料瓶进行恒温水浴，通过补料瓶接种至细胞培养层；
11.s5向补料瓶内加入新鲜培养基并通过蠕动泵泵入细胞培养单层内；
12.s6将细胞培养层内培养基抽出后对细胞培养层进行润洗；
13.s7通过补料瓶向细胞培养层内泵入消化液，并将细胞培养层内细胞悬液收集；
14.s8通过补料瓶向细胞培养层内泵入pbs，将pbs收集，计数并离心收集细胞。
15.所述细胞培养层包括若干个培养单层；所述培养水平累设于co2培养箱内；所述细胞培养层中部设置有溢流管；所述培养单层内设置有若干层间隔栅板；每一所述培养单层
一侧均通过进液管与所述补料瓶连通；每一所述培养单层另一侧均通过收获管与收集瓶连通；所述溢流管顶部与每一所述培养单层连接处形成有液面调节口；所述溢流管底部与所述收集瓶连通；所述进液管与收获管上分别安装有进液蠕动泵和收获蠕动泵。
16.s1中对所述细胞培养层进行清洗使用纯净水；使用所述酸液与纯净水对所述细胞培养层交替浸泡至少三次。
17.s2中加热灭菌为对所述细胞培养层干热灭菌，温度为150℃-165℃；加热时间为0.9h-1.2h。
18.s3中具体步骤为在所述补料瓶中加入pbs；并先后打开所述进液蠕动泵和收获蠕动泵；使pbs将所述培养单层完全浸润后关闭所述进液蠕动泵和收获蠕动泵。
19.s4中具体步骤为对所述补料瓶进行恒温水浴，待温度恒定后将贴壁生长细胞用新鲜培养基稀释后加入所述补料瓶内；通过所述进液蠕动泵泵入所述培养单层内并进行培养。
20.所述培养的方式为将所述co2培养箱封闭，并设置恒温，使湿度饱和，co2浓度为4％-6％。
21.s5中具体步骤为向所述补料瓶补充新鲜培养基；当新鲜培养基ph值小于7后，打开所述收获蠕动泵将所述培养单层中的培养基吸走总体积的三分之一至二分之一后关闭所述收获蠕动泵，打开所述进液蠕动泵向所述培养单层补充相应体积的新鲜培养基后关闭，继续培养，培养过程中不断观察并及时更新培养基。
22.s6中的操作步骤为当所述贴壁生长细胞生长占据所述培养单层面积80％以上，通过所述收获蠕动泵将所述培养单层内的培养基完全抽出；将所述补料瓶内的培养基更换为dpbs，并通过所述进液蠕动泵泵入所述培养单层内；保持dpbs至所述液面调节口；静置1-5min后打开所述收获蠕动泵将dpbs完全排空。
23.s7中操作步骤包括向所述补料瓶内更换为消化液，并通过所述进液蠕动泵泵入所述培养单层内；保持消化液至所述液面调节口；消化贴壁细胞变远并完全脱落后通过所述收获蠕动泵将细胞悬液收集至所述收集瓶内。
24.本发明公开了以下技术效果：本发明克服了随着培养面积增加细胞分布不均导致的细胞生长密度下降的问题；有效降低了表面张力对营养物质传递和细胞分布的影响；操作过程简便，便于观察，节约实验耗材，整个操作过程中避免了培养皿培养中常用的枪头使用，避免了生物反应容器培养过程中的昂贵一次性耗材和支架材料使用，可明显降低大规模细胞培养的成本。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为整体结构示意图；
27.图2为培养单层结构示意图；
28.图3为贴壁细胞培养基流动模拟示意图；
29.其中，1、溢流管；2、培养单层；3、间隔栅板；4、补料瓶；5、收集瓶；6、进液蠕动泵；7、收获蠕动泵。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
32.本发明提供一种贴壁细胞大规模培养工艺，其特征在于，包括以下步骤：
33.s1对细胞培养层清洗，并用酸液进行多次浸泡；
34.s2对细胞培养层加热灭菌；
35.s3将细胞培养层与补料瓶通过蠕动泵连通，并向补料瓶内加入pbs；
36.s4对补料瓶进行恒温水浴，通过补料瓶接种至细胞培养层；
37.s5向补料瓶内加入新鲜培养基并通过蠕动泵泵入细胞培养单层内；
38.s6将细胞培养层内培养基抽出后对细胞培养层进行润洗；
39.s7通过补料瓶向细胞培养层内泵入消化液，并将细胞培养层内细胞悬液收集；
40.s8通过补料瓶向细胞培养层内泵入pbs，将pbs收集，计数并离心收集细胞。
41.细胞培养层包括若干个培养单层2；培养单层2水平累设于co2培养箱内；细胞培养层中部竖直设置有溢流管1；培养单层2内设置有若干层间隔栅板3；每一培养单层2一侧均通过进液管与补料瓶4连通；每一培养单层2另一侧均通过收获管与收集瓶5连通；溢流管1顶部与每一培养单层2连接处形成有液面调节口；溢流管1底部与收集瓶5连通；进液管与收获管上分别安装有进液蠕动泵6和收获蠕动泵7。
42.s1中对细胞培养层进行清洗使用纯净水；使用酸液与纯净水对细胞培养层交替浸泡至少三次。
43.s2中加热灭菌为对细胞培养层干热灭菌，温度为150℃-165℃；加热时间为0.9h-1.2h。
44.s3中具体步骤为在补料瓶4中加入pbs；并先后打开进液蠕动泵6和收获蠕动泵7；使pbs将培养单层2完全浸润后关闭进液蠕动泵6和收获蠕动泵7。
45.s4中具体步骤为对补料瓶4进行恒温水浴，待温度恒定后将贴壁生长细胞用新鲜培养基稀释后加入补料瓶4内；通过进液蠕动泵6泵入培养单层2内并进行培养。
46.培养的方式为将co2培养箱封闭，并设置恒温，使湿度饱和，co2浓度为4％-6％。
47.s5中具体步骤为向补料瓶4补充新鲜培养基；当新鲜培养基ph值小于7后，打开收获蠕动泵7将培养单层2中的培养基吸走总体积的三分之一至二分之一后关闭收获蠕动泵7，打开进液蠕动泵6向培养单层2补充相应体积的新鲜培养基后关闭，继续培养，培养过程中不断观察并及时更新培养基。
48.s6中的操作步骤为当贴壁生长细胞生长占据培养单层2面积80％以上，通过收获蠕动泵7将培养单层2内的培养基完全抽出；将补料瓶4内的培养基更换为dpbs，并通过进液
蠕动泵6泵入培养单层2内；保持dpbs至液面调节口；静置1-5min后打开收获蠕动泵7将dpbs完全排空。
49.s7中操作步骤包括向补料瓶4内更换为消化液，并通过进液蠕动泵6泵入培养单层2内；保持消化液至液面调节口；消化贴壁细胞变远并完全脱落后通过收获蠕动泵7将细胞悬液收集至收集瓶5内。
50.在本发明一个实施例中。酸液配置按照称取称取120g重铬酸钾，用1000ml蒸馏水彻底溶解，然后缓慢加入200ml浓硫酸并不断搅拌，使其完全混合均匀。另外，可对该配制体系进行等比例放大以根据实际需要量。
51.在本发明一个实施例中，s1中首先用纯水对细胞培养单层进行浸泡，去除表面吸附的灰尘及其他可溶性杂质；然后用酸液对细胞培养单层进行浸泡，以进一步去除细胞培养单层表面吸附的难以清理的微量杂质；最后用纯水对细胞培养单层进行进一步浸泡，并换液三次以完全去除表面吸附的酸液。
52.在本发明一个实施例中，s3中需保证细胞培养层内均被完全浸润。
53.在本发明一个实施例中，s4中恒温水浴的温度与s5中培养温度均为37℃。
54.在本发明一个实施例中，s4中需运行足够时间待pbs浸润整个细胞培养单层底面后关闭进液蠕动泵6和收获蠕动泵7，操作过程要确保细胞培养层底面被完全浸润。
55.在本发明一个实施例中，培养单层2的面壁不小于1000000cm2；进而使得单次培养细胞收获量大幅度增加，单层细胞收获量可至5.1
×
10
10
个。
56.在本发明一个实施例中，消化液为0.25％胰蛋白酶。
57.在本发明一个实施例中，本工艺克服了随着培养面积增加细胞分布不均导致的细胞生长密度下降的问题，细胞培养密度与10cm直径培养皿一致，这是由于装置设计过程中增加了间隔栅板3的原因，栅板的存在有效降低了表面张力对营养物质传递和细胞分布的影响，如图3培养基流动模拟示意图所示培养基在整个培养平面均匀流动，实现了细胞在大平面上的均密度培养，另外，细胞培养过程中及时更新部分培养基也为细胞的高密度生长提供了营养支持；
58.每百万细胞消耗培养基体积与培养皿和细胞工厂极为接近，无明显增加；操作过程简便，便于观察，节约实验耗材，整个操作过程中避免了培养皿培养中常用的枪头使用，避免了生物反应容器培养过程中的昂贵一次性耗材和支架材料使用，可明显降低大规模细胞培养的成本。
59.在本发明一个实施例中，间隔栅板3为聚四氟乙烯材质，用于减少培养基表面张力，调节培养基流动方向；间隔栅板3为倒“l”形结构；间隔栅板3一端固定安装在培养单层2侧壁；任意相邻的两间隔栅板3分别安装于培养单层2的两相对侧壁；培养单层2两端分别开设有进液口和出液口；间隔栅板3与进液口3和出液口形成一完整流道。
60.在本发明一个实施例中，液面调节口用于判断培养单层2是否完全被浸润。
61.在本发明一个实施例中，溢流管1将多出的培养基导出收集。
62.在本发明一个实施例中，下方表格为本技术与现有的三种培养方式的直观对比；可以得到本技术的单层培养面积增大数倍，单层细胞培养数量也相对增大；且本技术中可设置若干个培养单层2。
[0063][0064][0065]
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
[0066]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。