细胞凝集块的制造方法与流程

1.本发明涉及细胞凝集块制造用基板、其制造方法、细胞凝集块的制造方法、及使制造细胞凝集块时的细胞利用效率提高的方法。


背景技术：

2.细胞凝集块(也称为球状体或细胞块等)是被三维地培养、细胞彼此自组装
·
凝集化而成的细胞集合体，由于构建了生物体样结构，因此报道了能够长期维持细胞的功能，生理功能提高。因此，对于细胞凝集块在创新药物研究中或者在细胞治疗、再生治疗中的应用的期待正在高涨。
3.与此相伴，开发能够简便且迅速、均匀且大量地制作细胞凝集块的组织工程技术被认为是用于实现再生医疗的实用化、创新药物试验的高效化的重要课题，然而在利用使用了以往的细胞低粘附性培养皿(例如，多孔板)的浮游细胞的随机凝集化现象的方法中，在1孔中仅形成1个球状体，因此存在操作性及量产性不优异这样的课题。
4.目前为止，作为涉及细胞培养的技术，本技术的发明人报道了，包含含有特定的阴离子性基团和阳离子性基团的共聚物的涂覆剂能够与基体种类无关地牢固地固着，另外，固着后成为对水系溶剂的耐受性优异的涂覆膜，并且显示出优异的抑制生物材料(例如，血小板、纤维蛋白原等)附着的能力(例如，参见专利文献1、2)。另外报道了，以被该涂覆剂涂覆为特征的细胞培养容器的抑制细胞附着的能力优异，并且对溶剂、放射线的耐受性也优异，进而能够用于长期(例如14天以上，例如21天以上)的非粘附培养，适于球状体的制作(例如，参见专利文献3、4)。此外，本技术的发明人还报道了：诱导粘附细胞的自发集合(自集合化)的涂覆剂；和使用以用该涂覆剂进行涂覆为特征的细胞培养容器的球状体的制作(例如，参见pct/jp2019/32785)。然而，它们均无法在球状体的制作的操作性及量产性方面令人满意。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：国际公开第2014/196650号
8.专利文献2：国际公开第2016/093293号
9.专利文献3：国际公开第2014/196652号
10.专利文献4：国际公开第2019/107503号


技术实现要素：

11.发明所要解决的课题
12.本发明的目的在于提供球状体制作的操作性及量产性优异的、细胞凝集块制造用基板及其制造方法。
13.用于解决课题的手段
14.本技术的发明人发现，通过将诱导粘附细胞的自发集合(自集合化)的涂覆剂与例
如喷墨装置组合以点状高密度地涂布于具有抑制细胞附着的能力的基板(例如，细胞低粘附培养皿)上，从而能够使接种细胞几乎全部粘附于涂布膜(斑点)而凝集化，由此完成了本发明。
15.即，本发明如下所述：
16.[1]细胞凝集块制造用基板，其在具有抑制细胞附着的能力的基板上具备由下述聚合物形成的多个斑点，斑点的总面积相对于基板的表面积的比例为30％以上，且各斑点的直径为50～5000μm，斑点间的间隔为30～1000μm，
[0017]
所述聚合物包含由下述式(i)表示的单体衍生的重复单元，
[0018]
[化学式1]
[0019][0020]
[式中，
[0021]ua1
及u
a2
各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a1
表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a2
表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
[0022]
[2]如[1]所述的细胞凝集块制造用基板，其细胞利用效率为90％以上。
[0023]
[3]如[1]或[2]所述的细胞凝集块制造用基板，其中，上述细胞为干细胞。
[0024]
[4]如[1]～[3]中任一项所述的细胞凝集块制造用基板，其中，上述聚合物还包含由式(ii)表示的单体衍生的重复单元，
[0025]
[化学式2]
[0026][0027]
[式中，
[0028]
rb表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基]。
[0029]
[5]如[1]～[4]中任一项所述的细胞凝集块制造用基板，其中，上述聚合物还包含由下述式(iii)表示的单体衍生的结构单元，
[0030]
[化学式3]
[0031]
[0032]
[式中，
[0033]
rc及rd各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，re表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基，n表示1～50的数字]。
[0034]
[6]如[1]～[5]中任一项所述的细胞凝集块制造用基板，其中，上述具有抑制细胞附着的能力的基板在前述基板表面的至少一部分上含有包含下述共聚物(p)的涂覆膜，所述共聚物(p)包含含有下述式(a)表示的基团的重复单元、和含有下述式(b)表示的基团的重复单元，
[0035]
[化学式4]
[0036][0037]
[式中，
[0038]ua11
、u
a12
、u
b11
、u
b12
及u
b13
各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，an-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子]。
[0039]
[7]细胞凝集块制造用基板的制造方法，其包括将下述聚合物以多个点状涂布于具有抑制细胞附着的能力的基板上且接着进行干燥的工序，此处斑点的总面积相对于基板的表面积为30％以上，且各斑点的直径为50～5000μm，斑点间的间隔为30～1000μm，
[0040]
所述聚合物包含由下述式(i)表示的单体衍生的重复单元，
[0041]
[化学式5]
[0042][0043]
[式中，
[0044]ua1
及u
a2
各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a1
表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a2
表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
[0045]
[8]如[7]所述的细胞凝集块制造用基板的制造方法，其细胞利用效率为90％以上。
[0046]
[9]如[7]或[8]所述的细胞凝集块制造用基板的制造方法，其中，利用喷墨方式进行上述涂布工序。
[0047]
[10]细胞凝集块的制造方法，其包括：将下述聚合物以多个点状涂布于具有抑制
细胞附着的能力的基板上的工序；
[0048]
接着接种细胞的工序，
[0049]
此处斑点的总面积相对于基板的表面积为30％以上，且各斑点的直径为50～5000μm，斑点间的间隔为30～1000μm，
[0050]
所述聚合物包含由下述式(i)表示的单体衍生的重复单元，
[0051]
[化学式6]
[0052][0053]
[式中，
[0054]ua1
及u
a2
各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a1
表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a2
表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
[0055]
[11]如[10]所述的细胞凝集块的制造方法，其细胞利用效率为90％以上。
[0056]
[12]方法，其是通过将下述聚合物以多个点状涂布于具有抑制细胞附着的能力的基板上从而使制造细胞凝集块时的细胞利用效率提高的方法，此处斑点的总面积相对于基板的表面积为30％以上，且各斑点的直径为50～5000μm，斑点间的间隔为30～1000μm，
[0057]
所述聚合物包含由下述式(i)表示的单体衍生的重复单元，
[0058]
[化学式7]
[0059][0060]
[式中，
[0061]ua1
及u
a2
各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a1
表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a2
表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
[0062]
发明的效果
[0063]
根据本发明，通过使用本发明的细胞凝集块制造用基板(其在培养皿或皿(dish)的底面、板表面等具有抑制细胞附着的能力的基板上高密度地具备诱导粘附细胞的自发集合(自集合化)的、由本发明涉及的特定聚合物形成的多个点状的涂布膜)而不使用以往的球状体制作用的多孔板等，从而仅通过在具有涂布膜(斑点)的基板平面上接种细胞即能够利用一个基板(容器)形成多个均匀尺寸的球状体，因此操作性及量产性优异。另外，通过使用本发明的细胞凝集块制造用基板，制造球状体时接种的细胞的利用效率也提高。因此根据本发明，能够简便且高效、均匀且大量地制作球状体。
附图说明
[0064]
[图1](a)为实施例1中得到的细胞凝集块形成用培养皿的荧光显微镜图像，涂布有本发明涉及的聚合物的部分呈圆形发光，表明通过喷墨能够形成涂布膜(斑点)。(b)是表示在实施例1的细胞凝集块形成用培养皿的制造中，喷墨的液滴量(涂布量)与所形成的涂布膜的面积的关系的坐标图，表明斑点的面积随着液滴量的增加而增加，即通过液滴量能够控制斑点的尺寸。
[0065]
[图2](a)为实施例2中得到的细胞凝集块形成用培养皿的荧光显微镜图像，(b)为比较例1中得到的细胞凝集块形成用培养皿的荧光显微镜图像。就斑点的总面积相对于培养皿的底面积的比例而言，前者为44％，后者为15％。
[0066]
[图3](a)的上列是在实施例3的细胞凝集块制造试验中，细胞粘附于细胞凝集块形成用培养皿的各斑点而成的形态(4小时后)的显微镜图像，(a)的下列是粘附的细胞剥离而形成的球状体的形态(44小时后)的显微镜图像。(b)为示出斑点的面积与球状体的直径的关系的坐标图，表明球状体的直径随着斑点的面积的增加而增加，即通过液滴量能够控制球状体的尺寸。
[0067]
[图4](a)是在实施例4的细胞粘附确认试验中，细胞粘附于高密度地具备斑点的细胞凝集块形成用培养皿的各斑点而成的形态的显微镜图像，(b)是在比较例2的细胞粘附确认试验中，细胞粘附于低密度地具备斑点的细胞凝集块形成用培养皿的各斑点而成的形态的显微镜图像。就斑点的总面积相对于培养皿的底面积的比例而言，前者为52％，后者为15％。
[0068]
[图5]是在实施例5的细胞凝集块制造试验中，对接种于细胞凝集块形成用培养皿中的细胞(刚接种后)经时地粘附于培养皿的各斑点(2小时后)形成细胞凝集块(8小时后)的形态进行延时拍摄而得的显微镜图像的一部分。
具体实施方式
[0069]
[细胞凝集块制造用基板及其制造方法]
[0070]
(聚合物)
[0071]
本发明的细胞凝集块制造用基板在具有抑制细胞附着的能力的基板上具备由聚合物形成的多个斑点。本发明中，所谓“斑点”，是指在基板上由聚合物形成的直径50～5000μm的大致圆形的涂布膜。构成斑点部分的聚合物包含由下述式(i)表示的阳离子性单体衍生的重复单元。
[0072]
[化学式8]
[0073][0074]
[式中，
[0075]ua1
、u
a2
各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a1
表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a2
表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
[0076]
上述聚合物优选为包含由上述式(i)表示的阳离子性单体衍生的重复单元以及由下述式(ii)表示的阴离子性单体衍生的重复单元的共聚物。
[0077]
[化学式9]
[0078][0079]
[式中，
[0080]
rb表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基]。
[0081]
本说明书中，只要没有其他定义，作为“碳原子数1至5的直链或支链烷基”，例如可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基或1-乙基丙基。
[0082]ra1
及rb各自独立地优选选自氢原子及甲基。
[0083]ua1
及u
a2
各自独立地优选选自氢原子、甲基、乙基、正丙基、异丙基及正丁基，优选为甲基或乙基，最优选为甲基。
[0084]
本说明书中，只要没有其他定义，作为“碳原子数1至5的直链或支链亚烷基”，例如可举出亚甲基、亚乙基、亚丙基、三亚甲基、四亚甲基、1-甲基亚丙基、2-甲基亚丙基、二甲基亚乙基、乙基亚乙基、五亚甲基、1-甲基-四亚甲基、2-甲基-四亚甲基、1,1-二甲基-三亚甲基、1,2-二甲基-三亚甲基、2,2-二甲基-三亚甲基、1-乙基-三亚甲基等。这些之中，作为r
a2
，优选选自亚乙基及亚丙基。
[0085]
因此，作为上述式(i)表示的阳离子性单体，可举出甲基丙烯酸2-n,n-二甲基氨基乙酯、n-异丙基丙烯酰胺等，优选甲基丙烯酸2-n,n-二甲基氨基乙酯。作为上述式(ii)表示的阴离子性单体，可举出丙烯酸、甲基丙烯酸等，优选为甲基丙烯酸。
[0086]
上述聚合物中的来自式(i)表示的单体的单元/来自式(ii)表示的单体的单元的摩尔比为100/0～50/50。优选为98/2～50/50。更优选为98/2～60/40，尤其优选为98/2～70/30。
[0087]
其原因在于，若式(ii)的摩尔比为51以上，则聚合物的阴离子性过度，细胞的粘附力下降。
[0088]
上述聚合物优选在包含由式(i)/式(ii)表示的单体衍生的结构单元的同时还包含由具有2个以上的碳-碳不饱和键的单体衍生的结构单元。所谓具有2个以上的碳-碳不饱和键的单体，具体而言，是指具有2个以上的碳-碳双键的单体，例如可举出多官能丙烯酸酯化合物、多官能丙烯酰胺化合物、多官能聚酯、或异戊二烯化合物等。由这些单体衍生的结构单元可作为聚合物间的交联结构存在。
[0089]
通过导入上述具有2个以上的碳-碳不饱和键的单体，聚合物的高分子量化及分子量分布拓宽，由此能够改善膜对基板的固着性、涂布性。
[0090]
作为优选的具体例，可举出下述式(iii)～(v)表示的单体。
[0091]
[化学式10]
[0092][0093]
[化学式11]
[0094][0095]
[化学式12]
[0096][0097]
式中，rc及rd各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，re表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基，n表示1～50的数字。这些之中，优选为式(iii)表示的单体。
[0098]
式(iii)～(v)表示的单体相对于上述聚合物整体而言的摩尔比优选为0～5％。进一步优选为0～3％。
[0099]
其原因在于，若式(iii)～(v)的摩尔比为5％以上，则存在因由过度交联引起的高分子量化而导致在制造中发生凝胶化从而使制造变得困难的可能性。
[0100]
rc及rd各自独立地优选选自氢原子及甲基。
[0101]
re优选选自亚甲基、亚乙基及亚丙基，最优选为亚乙基。
[0102]
n为1～50的数字，n优选为1～30的数字，n优选为1～10的数字。
[0103]
式(ii)表示的单体相对于上述聚合物整体所占的摩尔％的值、与式(ii)表示的单体相对于制备工序时的单体装料量整体所占的摩尔％的值之差为0～10摩尔％。就本发明涉及的聚合物而言，利用后述的制造方法，单体装料比与制得的聚合物的实测值之差小，为0～10摩尔％。进一步优选为0～8摩尔％。
[0104]
上述聚合物的数均分子量(mn)为20,000～2,000,000，进一步优选为50,000～1,000,000。
[0105]
上述聚合物的重均分子量(mw)与前述数均分子量(mn)之比(mw/mn)为1.01～10.00，优选为1.2～8.0，更优选为2.0～7.0，尤其优选为3.0～6.0。
[0106]
重均分子量(mw)和数均分子量(mn)例如可通过实施例中记载的凝胶过滤色谱法(gel filtration chromatography)求出。
[0107]
通过利用在具有抑制细胞附着的能力的基板上具备由上述聚合物形成的多个斑点的本发明的细胞凝集块制造用基板，能够在使细胞粘附于多个斑点部分后进行剥离，能够利用一个容器一次制作多个细胞凝集块。需要说明的是，所谓细胞凝集块，是指由于细胞凝集而形成的结构体，形状不限于球状、环状等。与以往在细胞低粘附板上通过非粘附培养而制作的细胞凝集块相比，本发明在能够通过规定粘附面积来调节细胞凝集块的尺寸(能够制造任意大小的细胞凝集块)等方面具有优点。
[0108]
(聚合物的制造方法)
[0109]
本发明涉及的聚合物可利用热聚合法制造。例如可通过下述方式得到聚合物：将上述式(i)的单体溶解于有机溶剂，添加自由基聚合引发剂，根据需要接着添加上述式(ii)、进而根据需要加入具有2个以上的碳-碳不饱和键的单体(式(iii)～(v)表示的单体等)而制成混合物，然后充分地搅拌使其均匀，然后在氮气气流下升温至例如51℃以上、例如51～180℃、51～150℃、51～130℃、51～100℃、例如溶剂的回流温度(例如四氢呋喃时为66～85℃)，搅拌例如1～48小时。可以利用再沉淀、透析将得到的聚合物纯化。
[0110]
一个实施方式中，可以利用包括下述工序的制造方法来制备：将上述式(i)的单体溶解于溶剂，添加聚合引发剂，根据需要接着使上述式(ii)的单体在溶剂中以两化合物的合计浓度0.01质量％至40质量％进行反应(聚合)。
[0111]
作为上述聚合中使用的有机溶剂，例如可举出四氢呋喃、1,4-二氧杂环己烷等醚溶剂、甲醇、乙醇、异丙醇等碳原子数1至4的脂肪族醇溶剂、甲苯等芳香族烃溶剂或其混合溶剂。
[0112]
为了使聚合反应高效地进行，优选使用自由基聚合引发剂。作为自由基聚合引发剂的例子，可举出1,1
’‑
偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(ve-073，fujifilm wako pure chemical corporation(株)制)、2,2
’‑
偶氮双(2,4-二甲基戊腈)(v-65，fujifilm wako pure chemical corporation(株)制)、2,2
’‑
偶氮双(异丁腈)(aibn，fujifilm wako pure chemical corporation(株)制)、2,2
’‑
偶氮双[n-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒]n水合物(va-057，fujifilm wako pure chemical corporation(株)制)、2,2
’‑
(n-丁基-2-甲基丙酰胺)(vam-110，fujifilm wako pure chemical corporation(株)制)等偶氮聚合引发剂。
[0113]
作为聚合引发剂的添加量，相对于聚合中使用的单体的总重量而言，为0.05质量％～5质量％。
[0114]
聚合引发剂的使用不仅能够实现聚合反应的高效化，还能通过末端官能团的修饰来调节聚合物物性。
[0115]
例如，本发明涉及的聚合物可以在不损害其目的的范围内通过末端官能团的修饰而导入功能性分子。功能性分子的典型例为荧光标记分子，用于导入这样的分子的试剂例如以alexa fluor(商标)等名称被市售。
[0116]
(斑点)
[0117]
本发明的细胞凝集块制造用基板所具备的、由上述聚合物形成的多个斑点(涂布膜)的特征在于，斑点的总面积相对于基板的表面积的比例为30％以上，且各斑点的直径为50～5000μm，斑点间的间隔为30～1000μm。斑点的总面积相对于基板的表面积的比例、各斑点的直径、斑点间的间隔可以根据使用的细胞、基板的种类、细胞凝集块的所期望的尺寸等从规定的范围进行适当选择，斑点的总面积相对于基板的表面积的比例优选为30％以上、
40％以上、50％以上，并且优选为99％以下，各斑点的直径为50～5000μm，优选为300～3000μm，斑点间的间隔为30～1000μm，优选为100～500μm。本发明通过将细胞能够粘附的独立的微尺寸的区域(斑点)以这样的高密度、优选规则地配置于具有抑制细胞附着的能力的基板上，从而能够利用一个基板(容器)一次形成多个均匀尺寸的球状体。
[0118]
另外，就本发明的细胞凝集块制造用基板而言，能够使接种细胞几乎全部粘附于斑点而凝集化。具体而言，对于本发明的细胞凝集块制造用基板，细胞利用效率达到90％以上，优选为95％以上，更优选为99％以上。需要说明的是，细胞利用效率为下述值：将细胞接种于本发明的细胞凝集块制造用基板，在规定的培养操作之后，以百分率对粘附细胞数(例如，从接种细胞数中减去在培养操作后自基板除去的培养基所包含的非粘附细胞数而得的值)除以接种细胞数而得的值进行表示的值。
[0119]
本发明的细胞凝集块制造用基板所具备的、由上述聚合物形成的多个斑点(涂布膜)是通过将上述聚合物以点状涂布于具有抑制细胞附着的能力的基板上且接着进行干燥的工序而形成的。
[0120]
将上述聚合物涂布于基板上的工序可以使用包含上述聚合物的涂布膜形成剂来实施。就涂布膜形成剂而言，可以通过利用本身已知的方法在上述聚合物中混合含水溶液来制造上述涂布膜形成剂。
[0121]
含水溶液可举出水、生理盐水或磷酸缓冲溶液等含盐的水溶液、或者将水或含盐的水溶液与醇组合而得的混合溶剂。作为醇，可举出碳原子数2至6的醇，例如乙醇、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-庚醇、2-庚醇、2,2-二甲基-1-丙醇(＝新戊醇)、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇(＝叔戊醇)、3-甲基-1-丁醇、3-甲基-3-戊醇、环戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、2,3-二甲基-2-丁醇、3,3-二甲基-1-丁醇、3,3-二甲基-2-丁醇、2-乙基-1-丁醇、2-甲基-1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、3-甲基-1-戊醇、3-甲基-2-戊醇、3-甲基-3-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、4-甲基-3-戊醇及环己醇，可以单独使用或者使用它们的组合的混合溶剂。
[0122]
此外，就涂布膜形成剂而言，除了上述聚合物和溶剂以外，也可以根据需要在不损害所得涂布膜的性能的范围内添加其他物质。作为其他物质，可举出ph调节剂、交联剂、防腐剂、表面活性剂、提高与基板的密合性的底涂层剂、防霉剂及糖类等。
[0123]
(基板)
[0124]
作为涂布上述涂布膜形成剂的基板，例如，可举出细胞的培养中通常使用的培养皿或皿、板、托盘，“基板上”是指它们中与细胞或细胞培养液等相接的面，例如为培养皿或皿时，是指其底面。
[0125]
另外，基板的材质例如可举出玻璃、金属、含有金属的化合物或含有半金属的化合物、活性炭或树脂。金属可举出典型金属：(碱金属：li、na、k、rb、cs；碱土金属：ca、sr、ba、ra)、镁族元素：be、mg、zn、cd、hg；铝族元素：al、ga、in；稀土类元素：y、la、ce、pr、nd、sm、eu；锡族元素：ti、zr、sn、hf、pb、th；铁族元素：fe、co、ni；酸土元素：v、nb、ta、铬族元素：cr、mo、w、u；锰族元素：mn、re；贵金属：cu、ag、au；铂族元素：ru、rh、pd、os、ir、pt等。含有金属的化合物或含有半金属的化合物可举出例如基本成分为金属氧化物且通过高温热处理而烧结成的烧结体即陶瓷、硅这样的半导体、金属氧化物或半金属氧化物(硅氧化物、氧化铝等)、金属碳化物或半金属碳化物、金属氮化物或半金属氮化物(硅氮化物等)、金属硼化物或半
金属硼化物等无机化合物的成型体等无机固体材料、铝、镍钛、不锈钢(sus304、sus316、sus316l等)。
[0126]
作为树脂，可以为天然树脂或其衍生物、或合成树脂中的任意，作为天然树脂或其衍生物，可优选使用纤维素、三乙酸纤维素(cta)、硝基纤维素(nc)、固定了硫酸葡聚糖的纤维素等，作为合成树脂，可优选使用聚丙烯腈(pan)、聚酯系聚合物合金(pepa)、聚苯乙烯(ps)、聚砜(psf)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚乙烯醇(pva)、聚氨酯(pu)、乙烯乙烯醇(eval)、聚乙烯(pe)、聚酯、聚丙烯(pp)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚醚砜(pes)、聚碳酸酯(pc)、聚氯乙烯(pvc)、聚四氟乙烯(ptfe)、超高分子量聚乙烯(uhpe)、聚二甲基硅氧烷(pdms)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂(abs)或teflon(注册商标)。本发明的细胞凝集块制造用基板的制造中，在将聚合物涂布于基板上时，无需高温处理，因此也可应用耐热性低的树脂等。
[0127]
基板的材质可以为1种，也可以为2种以上的组合。这些材质中，优选为玻璃、硅、硅氧化物、聚苯乙烯(ps)、聚丙烯(pp)、聚醚砜(pes)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚碳酸酯(pc)、聚氯乙烯(pvc)、teflon(注册商标)、环烯烃聚合物(cop)、聚二甲基硅氧烷(pdms)或不锈钢(sus304、sus316、sus316l等)单独、或选自它们中的组合，尤其优选为玻璃、聚苯乙烯(ps)、聚丙烯(pp)、不锈钢(sus304、sus316、sus316l等)、聚二甲基硅氧烷(pdms)。
[0128]
涂布工序以就所形成的多个斑点而言斑点的总面积相对于基板的表面积的比例为30％以上、且各斑点的直径为50～5000μm、斑点间的间隔成为30～1000μm的方式实施，作为涂布的方式，例如可以利用喷墨法、丝网印刷法、狭缝涂布法、卷对卷法等，优选使用喷墨法的印刷技术进行。喷墨法中使用的喷墨装置及喷墨头等没有特别限定，可以根据上述聚合物或涂布膜形成剂的物性、液滴量等从市售的制品适当选择。
[0129]
另外，由上述方法得到的基板上的涂布膜可以在涂布工序后不经由干燥工序而直接作为细胞凝集块制造用基板使用，或者在使用水或供于细胞培养的试样的介质(例如，水、缓冲液、培养基等)进行清洗后作为细胞凝集块制造用基板使用。
[0130]
基板可供于干燥工序。干燥工序在大气下或真空下优选于温度-200℃至200℃的范围内进行。通过干燥工序，将上述涂布膜形成剂中的溶剂去除，由此完全固着于基板。
[0131]
涂布膜也可以通过例如室温(10℃至35℃，优选20℃至30℃，例如25℃)的干燥而形成，为了更迅速地形成涂布膜，可以于例如40℃至50℃进行干燥。干燥温度低于-200℃时，必须使用非常规的制冷剂，缺乏通用性，并且，为了使溶剂升华，干燥需要较长时间，效率差。干燥温度超过200℃时，会发生聚合物的热分解。更优选的干燥温度为10℃至180℃，更优选的干燥温度为20℃至150℃。
[0132]
本发明的细胞凝集块制造用基板的涂布膜(斑点)经由以上的简便工序而制造。
[0133]
此外，为了使残留于涂布膜的杂质、未反应单体等消失，可以实施利用选自水及包含电解质的水溶液中的至少1种溶剂进行清洗的工序。清洗优选为流水清洗或超声波清洗等。上述水及包含电解质的水溶液可以是在例如40℃至95℃的范围内经加热的水及包含电解质的水溶液。包含电解质的水溶液优选为pbs、生理盐水(仅含有氯化钠的水溶液)、杜氏磷酸缓冲生理盐水、tris缓冲生理盐水、hepes缓冲生理盐水及veronal缓冲生理盐水，特别优选为pbs。固着后，即使利用水、pbs及醇等进行清洗，涂布膜也不会溶出，牢固地固着于基板。
[0134]
就本发明的细胞凝集块制造用基板的涂布膜的膜厚而言，最大膜厚和最小膜厚在1～1000nm的范围内，优选在5～500nm的范围内。
[0135]
在上述涂布膜的涂布
·
干燥工序前，基板被实施抑制细胞附着的处理。具有抑制细胞附着的能力的基板可以经由例如涂布已知的具有抑制细胞附着的能力的涂覆膜形成用组合物(例如记载于wo2014/196650、wo2016/093293)的工序来制造。优选包括将包含共聚物(p)和溶剂的涂覆膜形成用组合物作为具有抑制细胞附着的能力的涂覆膜形成组合物涂布于容器或基板的表面并进行干燥的工序，所述共聚物(p)包含含有下述式(a)表示的基团的重复单元、和含有下述式(b)表示的基团的重复单元。
[0136]
[化学式13]
[0137][0138]
[式中，
[0139]ua11
、u
a12
、u
b11
、u
b12
及u
b13
各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，an-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子]。
[0140]
本发明涉及的共聚物(p)可以进一步共聚有乙烯性不饱和单体、或者多糖类或其衍生物作为任选的第3成分。作为乙烯性不饱和单体的例子，可举出选自由(甲基)丙烯酸及其酯；乙酸乙烯酯；乙烯基吡咯烷酮；乙烯；乙烯醇；以及它们的亲水性的官能性衍生物组成的组中的1种或2种以上的乙烯性不饱和单体。作为多糖类或其衍生物的例子，可举出羟基烷基纤维素(例如，羟基乙基纤维素或羟基丙基纤维素)等纤维素系高分子、淀粉、葡聚糖、凝胶多糖。
[0141]
亲水性的官能性衍生物是指具有亲水性的官能团或结构的乙烯性不饱和单体。作为亲水性的官能性基团或结构的例子，可举出：甜菜碱结构；酰胺结构；亚烷基二醇残基；氨基；以及亚磺酰基等。
[0142]
甜菜碱结构是指具有季铵型的阳离子结构和酸性的阴离子结构这样的两性中心的化合物的一价或二价的基团，例如，可举出磷酰胆碱基：
[0143]
[化学式14]
[0144][0145]
作为具有这样结构的乙烯性不饱和单体的例子，可举出2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酰胆碱(mpc)等。
[0146]
酰胺结构是指下述式表示的基团。
[0147]
[化学式15]
[0148][0149]
[此处，r
16
、r
17
及r
18
彼此独立地为氢原子或有机基团(例如，甲基、羟基甲基或羟基乙基等)]。
[0150]
作为具有这样结构的乙烯性不饱和单体的例子，可举出(甲基)丙烯酰胺、n-(羟基甲基)(甲基)丙烯酰胺等。此外，具有这样的结构的单体或聚合物例如公开于日本特开2010-169604号公报等中。
[0151]
亚烷基二醇残基是指亚烷基二醇(ho-alk-oh；此处alk为碳原子数1至10的亚烷基)的一侧末端或两末端的羟基与其他化合物进行缩合反应后残留的亚烷基氧基(-alk-o-)，也包含亚烷基氧基单元重复的聚(亚烷基氧基)基。作为具有这样结构的乙烯性不饱和单体的例子，可举出(甲基)丙烯酸2-羟基乙酯、甲氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯等。此外，具有这样的结构的单体或聚合物例如公开于日本特开2008-533489号公报等中。
[0152]
氨基是指由式：-nh2、-nhr
19
或-nr
20r21
[此处，r
19
、r
20
及r
21
彼此独立地为有机基团(例如，碳原子数1至5的直链或支链烷基等)]表示的基团。本发明中的氨基包含经季化或氯化的氨基。作为具有这样结构的乙烯性不饱和单体的例子，可举出(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯、甲基丙烯酰基胆碱氯化物等。
[0153]
亚磺酰基是指下述式表示的基团：
[0154]
[化学式16]
[0155][0156]
[此处，r
22
为有机基团(例如，碳原子数1至10的有机基团，优选为具有1个以上羟基的碳原子数1至10的烷基等)]。
[0157]
作为具有这样结构的聚合物，可举出日本特开2014-48278号公报等中公开的共聚物。
[0158]
碳原子数1至5的直链或支链烷基与上述的烷基相同。
[0159]
上述涂覆膜形成用组合物例如可以使用wo2014/196650中记载的涂覆膜形成用组合物。
[0160]
作为上述涂覆膜形成用组合物的涂布方法，没有特别限制，可使用通常的旋涂、浸涂、溶剂流延法等涂布法。
[0161]
上述涂覆膜的干燥工序在大气下或真空下于温度-200℃至180℃的范围内进行。通过干燥工序，将上述涂覆膜形成用组合物中的溶剂去除，并且上述共聚物的式(a)及式(b)彼此形成离子键，完全地固着于基体。
[0162]
上述涂覆膜也可以通过例如室温(10℃至35℃，例如25℃)的干燥而形成，为了更迅速地形成涂覆膜，例如可以于40℃至50℃进行干燥。另外，可以利用基于冷冻干燥法的极低温～低温(-200℃至-30℃左右)的干燥工序。冷冻干燥被称为真空冷冻干燥，通常是将想要干燥的物质用制冷剂进行冷却，在真空状态下利用升华将溶剂除去的方法。冷冻干燥中使用的通常的制冷剂可举出干冰与甲醇的混合介质(-78℃)、液氮(-196℃)等。
[0163]
干燥温度为-200℃以下时，必须使用非常规的制冷剂，缺乏通用性，并且，为了使
溶剂升华，干燥需要较长时间，效率差。干燥温度为200℃以上时，涂覆膜表面的离子键合反应过度进行，该表面丧失亲水性，无法发挥抑制生物材料附着的能力。更优选的干燥温度为10℃至180℃，更优选的干燥温度为25℃至150℃。
[0164]
干燥后，为了使残留于该涂覆膜上的杂质、未反应单体等消失、进而为了调节膜中的共聚物的离子平衡，优选利用选自水及包含电解质的水溶液中的1种以上溶剂、借助流水清洗或超声波清洗等进行清洗。上述水及包含电解质的水溶液可以是在例如40℃至95℃的范围内经加热的水及包含电解质的水溶液。包含电解质的水溶液优选为pbs、生理盐水(仅含有氯化钠的水溶液)、杜氏磷酸缓冲生理盐水、tris缓冲生理盐水、hepes缓冲生理盐水及veronal缓冲生理盐水，特别优选为pbs。固着后，即使利用水、pbs及醇等进行清洗，涂覆膜也不溶出，牢固地固着于基体。所形成的涂覆膜即使附着有生物材料，也能够通过之后的水洗等容易地除去，形成有上述涂覆膜的基体表面具有抑制生物材料附着的能力。
[0165]
上述涂覆膜的膜厚优选为5～1000nm，进一步优选为5～500nm。
[0166]
另外，作为上述基板，也可以使用市售的经细胞低粘附处理的细胞培养皿、具有抑制细胞附着的能力的细胞培养器，例如可以使用日本特开2008-61609号公报中记载的细胞培养容器，但不限于此。
[0167]
所谓具有抑制细胞附着的能力，是指通过例如wo2016/093293的实施例中记载的方法进行的基于荧光显微镜的与无涂覆膜、或无细胞低吸附处理进行比较的情况下的相对吸光度(wst o.d.450nm)(％)((实施例的吸光度(wst o.d.450nm))/(比较例的吸光度(wst o.d.450nm)))为50％以下，优选为30％以下，进一步优选为20％以下。
[0168]
(细胞)
[0169]
本发明中的细胞，是指构成动物或植物的最基本的单元，其具有作为其要素的处于细胞膜内部的细胞质和各种细胞器。此时，细胞内部可以含有或不含有包含dna的细胞核。例如，本发明的动物来源的细胞包括：精子、卵子等生殖细胞，构成生物体的体细胞，干细胞(多能干细胞等)，祖细胞，从生物体分离的癌细胞，从生物体分离的获得了永生能力且能够在体外稳定维持的细胞(细胞株)，从生物体分离的进行了人工基因改造的细胞，从生物体分离的进行了人工细胞核交换的细胞等。作为构成生物体的体细胞的实例，包括但不限于：成纤维细胞、骨髓细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞、嗜中性粒细胞、红血细胞、血小板、巨噬细胞、单核球、骨细胞、骨髓细胞、周皮细胞、树突细胞、角质细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经系统细胞、胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如，平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、胰脏β细胞、黑色素细胞、造血祖细胞(例如，来自脐带血的cd34阳性细胞)、及单核细胞等。所述体细胞包括例如从皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰脏、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液(包含脐带血)、骨髓、心脏、眼、脑或神经组织等任意组织采集的细胞。干细胞是指兼具复制自体自身的能力和分化为其他多种系统的细胞的能力的细胞，作为其例子，包括：胚胎干细胞(es细胞)、胚胎肿瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工多能干细胞(ips细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质系干细胞、肝干细胞、胰干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞等，但不限于这些。作为多能干细胞，可举出前述干细胞中的es细胞、胚胎生殖干细胞、ips细胞。祖细胞是处于由上述干细胞分化为
特定的体细胞、生殖细胞的中途阶段的细胞。癌细胞是源自体细胞的获得了无限增殖能力的细胞。细胞株是通过在生物体外的人工操作而获得了无限增殖能力的细胞。这些之中，优选通过粘附于支架而生存及增殖的粘附细胞，更优选干细胞。
[0170]
[细胞凝集块的制造方法]
[0171]
本发明的细胞凝集块的制造方法是包括将下述聚合物以多个点状涂布于具有抑制细胞附着的能力的基板上的工序、接着接种细胞的工序、并且此处斑点的总面积相对于基板的表面积为30％以上、且各斑点的直径为50～5000μm、斑点间的间隔为30～1000μm的方法，例如为利用实施例中记载的方法进行的细胞凝集块的制造方法，所述聚合物包含由下述式(i)表示的单体衍生的重复单元，
[0172]
[化学式17]
[0173][0174]
[式中，
[0175]ua1
及u
a2
各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a1
表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a2
表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
[0176]
上述聚合物优选为包含由式(i)表示的单体衍生的重复单元以及由下述式(ii)表示的单体衍生的重复单元的共聚物，
[0177]
[化学式18]
[0178][0179]
[式中，
[0180]
rb表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基]。
[0181]
由上述方法接种的细胞如上文所述，优选为粘附细胞，更优选为干细胞。此外，本发明的细胞凝集块的制造方法中使用的基板、聚合物等的详细情况、优选方式如上述的[细胞凝集块制造用基板及其制造方法]所述。
[0182]
[使制造细胞凝集块时的细胞利用效率提高的方法]
[0183]
使制造本发明的细胞凝集块时的细胞利用效率提高的方法为下述方法：将聚合物以多个点状涂布于具有抑制细胞附着的能力的基板上，斑点的总面积相对于基板的表面积为30％以上，且各斑点的直径为50～5000μm，斑点间的间隔为30～1000μm，所述聚合物包含由下述式(i)表示的单体衍生的重复单元，
[0184]
[化学式19]
[0185][0186]
[式中，
[0187]ua1
及u
a2
各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a1
表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，r
a2
表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
[0188]
本发明的使制造细胞凝集块时的细胞利用效率提高的方法中使用的基板、聚合物等的详细情况、优选方式如上述的[细胞凝集块制造用基板及其制造方法]所述。
[0189]
实施例
[0190]
以下，举出实施例来更详细地说明本发明，但本发明不限于这些。
[0191]
＜分子量的测定方法＞
[0192]
下述合成例所示的重均分子量为基于凝胶过滤色谱法(gel filtration chromatography，以下简称为gfc)的结果。
[0193]
(测定条件)
[0194]
·
装置：hlc-8320gpc(东曹(株)制)
[0195]
·
gfc柱：tskgel g 6000+3000pwxl-cp
[0196]
·
流速：1.0ml/min
[0197]
·
洗脱液：含盐的水/有机混合溶剂
[0198]
·
柱温度：40℃
[0199]
·
检测器：ri
[0200]
·
进样浓度：聚合物固态成分为0.05质量％
[0201]
·
进样量：100μl
[0202]
·
标准曲线：三次拟合曲线
[0203]
·
标准试样：聚环氧乙烷(agilent公司制)
×
10种
[0204]
＜合成例1＞基于热聚合的作为细胞培养的涂布膜形成剂使用的聚合物的制造(1)
[0205]
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g中加入四氢呋喃41.94g，充分地溶解。接着，将1,1
’‑
偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(ve-073，fujifilm wako pure chemical corporation(株)制)0.01g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)0.48g、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(n≈4)(东京化成工业(株)制)0.21g一边保持为20℃以下，一边加入至上述四氢呋喃溶液中。将充分搅拌至均匀的加入有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。利用作为不良溶剂的己烷使反应产物再沉淀，通过过滤将析出物回收，进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管。进行72小时透析，将反应产物纯化。
[0206]
利用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(as one(株)制，型号：sygf0605mnxx104)，对包含
反应产物的溶液进行过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到聚合物。该聚合物基于gfc的重均分子量为660,000，多分散度为3.8(以下，称为“合成例聚合物1”)。
[0207]
＜合成例2＞基于热聚合的作为细胞培养的涂布膜形成剂使用的聚合物的制造(2)
[0208]
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g中加入乙醇31.46g，充分地溶解。接着，将1,1
’‑
偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(ve-073，fujifilm wako pure chemical corporation(株)制)0.01g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)0.48g、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(n≈4)(东京化成工业(株)制)0.21g一边保持为20℃以下，一边加热至上述乙醇溶液中。将充分搅拌至均匀的加入有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持4小时的状态下进行加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。利用作为不良溶剂的己烷使反应产物再沉淀，通过过滤将析出物回收，进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管。进行72小时透析，将反应产物纯化。
[0209]
利用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(as one(株)制，型号：sygf0605mnxx104)，对包含反应产物的溶液进行过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到聚合物。该聚合物基于gfc的重均分子量为770,000，多分散度为4.1(以下，称为“合成例聚合物2”)。
[0210]
＜合成例3＞基于热聚合的作为细胞培养的涂布膜形成剂使用的荧光标记聚合物的制造(3)
[0211]
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g中加入乙醇31.46g，充分地溶解。接着，将1,1
’‑
偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(ve-073，fujifilm wako pure chemical corporation(株)制)0.01g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)0.48g、丙烯酰胺(东京化成工业(株)制)0.26g、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(n≈4)(东京化成工业(株)制)0.21g一边保持为20℃以下，一边加入至上述乙醇溶液中。将充分搅拌至均匀的加入有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持4小时的状态下进行加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。利用作为不良溶剂的己烷使反应产物再沉淀，通过过滤将析出物回收，进行减压干燥。将得到的粉体0.1g溶解于纯水9.9ml中。将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(东京化成工业(株)制)0.003g溶解于纯水2.4ml中，并加入至上文所制备的溶液中，进行搅拌混合。将alexa fluor(商标)488三(三乙基铵)羧酸盐(carboxylic acid,tris(triethylammonium)salt)(thermo fisher scientific(株)制)0.005g加入至二甲基亚砜(纯正化学(株)制)0.6ml中并使其溶解，将得到的混合物滴加至上文所制备的溶液中。于室温搅拌12小时，使反应进行。将得到的反应溶液移至透析管。进行72小时透析，将反应产物纯化。
[0212]
利用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(as one(株)制，型号：sygf0605mnxx104)，对包含反应产物的溶液进行过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到聚合物。该聚合物基于gfc的重均分子量为900,000，多分散度为5.5(以下称为“合成例聚合物3”)。
[0213]
＜试验例1＞(聚合物的基于1h-nmr测定的组成分析)
[0214]
使用核磁共振装置(bruker公司制，型号：ascend500)，以重水(d2o)作为标准物质，对合成例聚合物1～3的核磁共振波谱(nmr)进行测定。下文中，示出合成例聚合物1～2
中共通的代表性峰。
[0215]1h-nmr(在d2o中)δ0.8-1.2(br,-ch
2-c(ch3)-),1.6-2.0(br,-ch
2-c(ch3)-),2.2-2.4(br,-n(ch3)2),2.5-2.7(br,-ch2-n(ch3)2),4.0-4.2(br,-o-ch
2-).
[0216]
此处，由主链的甲基-ch
2-c(ch3)-(δ0.8-1.2)的质子数(dmaema的均聚物的情况下，每1分子单体为3个)a、和侧链的-o-ch
2-基(δ4.0-4.2)的甲基质子数(dmaema的均聚物的情况下，每1分子单体为2个)b，算出侧链所具有的氨基的官能团数、与侧链的羧基的官能团数之比。
[0217]
结果，合成例1的情况下为89/11，合成例2的情况下为90/10，合成例3的情况下为84/16。将详细的结果示于表1。
[0218]
关于合成例1～3中合成的聚合物，将由gfc测得的重均分子量mw、分子量分布(pdi：mw/mn)示于表1。
[0219]
[表1]
[0220][0221]
＜实施例1：利用喷墨进行的涂布膜形成和直径的控制＞
[0222]
(1)细胞低粘附培养皿的制备
[0223]
按照wo2014/196650的实施例30中记载的制造方法，由含有共聚物的清漆制备涂覆溶液。将制备的涂覆溶液各500μl添加于为40mm的asnol培养皿(as one(株)制，#1-8549-01)中，于室温静置1小时后，将过量的涂覆溶液除去。然后，每1孔添加2ml灭菌水后除去，进行清洗。同样地进一步进行2次清洗，于室温干燥30分钟，得到细胞低粘附培养皿。
[0224]
(2)基于喷墨的涂布膜形成和直径的控制
[0225]
利用灭菌水使合成例聚合物3以成为100ng/μl的浓度的方式溶解，制造了细胞培养的涂布膜形成剂3。使用喷墨装置((株)microjet制，型号：labojet-600)及喷墨头(型号：500-s-c)，在上述中制备的细胞低粘附培养皿上，在控制为55nl、165nl、330nl、660nl、1320nl这样的液滴量(喷出次数)的同时将涂布膜形成剂3以点状涂布。以各涂布量涂布5个点以上。于室温干燥30分钟，形成膜。添加2ml纯水后除去，进行清洗。同样地进一步进行2次清洗，于室温干燥30分钟，得到细胞凝集块形成用培养皿。利用荧光显微镜(olympus(株)制：型号ix-83)对得到的培养皿进行荧光观察，确认是否能够形成膜。将结果示于图1(a)。
[0226]
如图1(a)所示，涂布有涂布膜形成剂的部分呈圆形发光，表明通过喷墨能够形成涂布膜(斑点)。另外，如图1(b)及表2所示，随着液滴量增加，涂布膜的圆的直径增加。表明通过使用喷墨装置来涂布细胞培养基底材料能够控制点状涂布膜的尺寸。
[0227]
[表2]
[0228]
涂布量(nl)直径(mm)面积(mm2)550.840.551651.030.833301.351.43
6601.772.4613202.223.87
[0229]
《实施例2：基于喷墨的高密度涂布膜的形成和斑点密度的定量》
[0230]
利用灭菌水使合成例聚合物3以成为100ng/μl的浓度的方式溶解，制造了细胞培养的涂布膜形成剂3。使用喷墨装置((株)microjet制，型号：labojet-600)及喷墨头(型号：ijhb-1000)，在实施例1(1)中制备的细胞低粘附培养皿上，以300μm的间隔以点状各涂布950pl的涂布膜形成剂3。于室温干燥30分钟，形成膜。添加2ml纯水后除去，进行清洗。同样地进一步进行2次清洗，于室温干燥30分钟，得到经高密度涂布的细胞凝集块形成用培养皿。利用荧光显微镜(olympus(株)制：型号ix-83)对得到的培养皿进行荧光观察。
[0231]
如图2(a)所示，涂布有涂布膜形成剂的部分呈圆形发光，表明通过喷墨能够以高密度形成涂布膜(斑点)。斑点的总面积相对于培养皿的底面积的比例为44％。
[0232]
＜比较例1：基于喷墨的低密度涂布膜的形成和斑点密度的定量＞
[0233]
利用灭菌水使合成例聚合物3以成为100ng/μl的浓度的方式溶解，制造了细胞培养的涂布膜形成剂3。使用喷墨装置((株)microjet制，型号：labojet-600)及喷墨头(型号：500-s-c)，在实施例1(1)中制备的细胞低粘附培养皿上，以2mm的间隔以点状各涂布55nl的涂布膜形成剂3。于室温干燥30分钟，形成膜。添加2ml纯水后除去，进行清洗。同样地进一步进行2次清洗，于室温干燥30分钟，得到细胞凝集块形成用培养皿。利用荧光显微镜(olympus(株)制：型号ix-83)对得到的培养皿进行荧光观察。
[0234]
如图2(b)所示，涂布有涂布膜形成剂3的部分呈圆形发光，表明通过喷墨能够形成涂布膜(斑点)。斑点的总面积相对于培养皿的底面积的比例为15％。
[0235]
＜实施例3：控制了尺寸的细胞凝集块制造试验＞
[0236]
(1)细胞凝集块形成用培养皿的制备
[0237]
利用灭菌水使合成例聚合物2以成为100ng/μl的浓度的方式溶解，制造了细胞培养的涂布膜形成剂2。使用喷墨装置((株)microjet制，型号：labojet-600)、及喷墨头(型号：500-s-c)，在实施例1
[0238]
(1)中制备的细胞低粘附培养皿上，在控制为55nl、165nl、330nl、660nl、1320nl这样的液滴量(喷出次数)的同时将涂布膜形成剂2以点状涂布。以各涂布量涂布5个点以上。于室温干燥30分钟，形成膜。添加2ml纯水后除去，进行清洗。同样地进一步进行2次清洗，于室温干燥30分钟，得到细胞凝集块形成用培养皿。
[0239]
(2)细胞的制备
[0240]
细胞使用小鼠胚胎成纤维细胞(c3h10t1/t2细胞：ds pharma biomedical(株)制)。细胞的培养中，使用向作为基础培养基的bme培养基(gibco公司制)中以成为10％的方式添加fbs(sigma-aldrich公司制)、以成为1％的方式添加glutamine/penicillin/streptomycin(gibco公司制)而得的培养基。使用直径为10cm的培养皿(10ml培养基)，在37℃/co2培养箱内，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，将细胞静置培养2天以上。接下来，用3ml的pbs溶液(fujifilm wako pure chemical corporation(株)制)清洗该细胞后，添加3ml的胰蛋白酶-edta溶液(promocell公司制)，于室温静置3分钟，将细胞剥离。添加7ml上述培养基，将细胞回收。将该悬浮液离心分离(tomy seiko co.,ltd.制，型号lc-230，200
×
g/3分钟，室温)后，除去上清液，添加上述的培养基，制备细胞悬浮液。
[0241]
(3)细胞粘附实验
[0242]
针对上述(1)中制备的培养皿，添加各500μl细胞悬浮液，以成为3.0
×
105个细胞/cm2。然后，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，在37℃/co2培养箱内静置4小时。静置后，将非粘附细胞和培养基除去，用pbs进行清洗，由此使得仅粘附细胞残留于孔上。清洗后，添加500μl/孔的新培养基，使用倒置研究型显微镜ix83(olympus(株)制)对粘附细胞的形态进行观察、拍摄。结果，如图3(a)所示，确认到细胞向涂覆有细胞培养的涂布膜形成剂2的部位(斑点)粘附。还可知，液滴量变多时，细胞的粘附面积也变大。
[0243]
(4)细胞凝集块的观察
[0244]
将如上所述地进行了试验的培养皿在37℃/co2培养箱内进一步静置44小时。静置后，使用倒置研究型显微镜ix83(olympus(株)制)对细胞的形态进行观察。结果，如图3(a)所示，确认到粘附于细胞培养的涂布膜形成剂2的细胞从培养皿剥落而凝集，形成了细胞凝集块(球状体)。
[0245]
另外，将涂布量与涂布面积与球状体直径的关系示于图3(b)及表3。表明涂布量越大则涂布面积越大，得到的球状体尺寸越大。另外，以n＝5进行评价，结果尺寸误差为3.5～8.4％。由此表明，包含本发明的聚合物的涂布膜通过与喷墨装置组合来控制涂布量，作为以小的尺寸误差形成任意尺寸的球状体的涂布膜是有用的。
[0246]
[表3]
[0247][0248]
＜实施例4：基于高密度涂布的细胞粘附确认试验＞
[0249]
(1)细胞凝集块形成用培养皿的制备
[0250]
利用灭菌水使合成例聚合物2以成为100ng/μl的浓度的方式溶解，制造了细胞培养的涂布膜形成剂2。使用喷墨装置((株)microjet制，型号：labojet-600)、及喷墨头(型号：ijhb-1000)，在实施例1(1)中制备的细胞低粘附培养皿上，以300μm的间隔以点状各涂布900～950pl的涂布膜形成剂2。于室温干燥30分钟，形成膜。添加2ml纯水后除去，进行清洗。同样地进一步进行2次清洗，于室温干燥30分钟，得到经高密度涂布的细胞凝集块形成用培养皿。斑点的总面积相对于培养皿的底面积的比例为52％。
[0251]
(2)细胞粘附实验
[0252]
针对上述(1)中制备的培养皿，加入500μl的实施例3(1)中制备的细胞悬浮液，以成为3.0
×
105个细胞/cm2。然后，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，在37℃/co2培养箱内静置4小时。不经由清洗工序地使用倒置研究型显微镜ix83(olympus(株)制)，对粘附细胞的形态进行观察、拍摄。结果，如图4(a)所示，确认到细胞向涂覆有细胞培养的涂布膜形成剂2的部位(斑点)粘附。另外，不存在不粘附而浮游的细胞。
[0253]
＜比较例2：以低密度涂布膜进行的细胞粘附确认试验＞
[0254]
(2-1.细胞凝集块形成用培养皿的制备)
[0255]
利用灭菌水使合成例聚合物2以成为100ng/μl的浓度的方式溶解，制造了细胞培养的涂布膜形成剂2。使用喷墨装置((株)microjet制，型号：labojet-600)、及喷墨头(型号：500-s-c)，在实施例1
[0256]
(1)中制备的细胞低粘附培养皿上，以2mm的间隔以点状各涂布55nl的涂布膜形成剂2。于室温干燥30分钟，形成膜。添加2ml纯水后除去，进行清洗。同样地进一步进行2次清洗，于室温干燥30分钟，得到细胞凝集块形成用培养皿。斑点的总面积相对于培养皿的底面积的比例为15％。
[0257]
(2)细胞粘附实验
[0258]
针对上述(1)中制备的培养皿，添加500μl的实施例3(1)中制备的细胞悬浮液，以成为3.0
×
105个细胞/cm2。然后，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，在37℃/co2培养箱内静置2小时。在不经由清洗工序的情况下使用倒置研究型显微镜ix83(olympus(株)制)对粘附细胞的形态进行观察、拍摄。结果，如图4(b)所示，确认到细胞向涂覆有细胞培养的涂布膜形成剂2的部位(斑点)的粘附、及其他大量的浮游细胞。
[0259]
＜实施例5：基于高密度涂布的细胞凝集块制造试验＞
[0260]
(1)细胞凝集块形成用培养皿的制备
[0261]
利用灭菌水使合成例聚合物1以成为100ng/μl的浓度的方式溶解，制造了细胞培养的涂布膜形成剂1。使用喷墨装置((株)microjet制，型号：labojet-600)、及喷墨头(型号：ijhb-1000)，在实施例1(1)中制备的细胞低粘附培养皿上，以300μm的间隔以点状各涂布950pl的涂布膜形成剂1。于室温干燥30分钟，形成膜。添加2ml纯水后除去，进行清洗。同样地进一步进行2次清洗，于室温干燥30分钟，得到经高密度涂布的细胞凝集块形成用培养皿。
[0262]
(2)细胞粘附实验
[0263]
针对上述(1)中制备的培养皿，添加500μl的实施例3(1)中制备的细胞悬浮液，以成为3.0
×
105个细胞/cm2。然后，在保持37℃、5％二氧化碳浓度的状态下，利用倒置研究型显微镜ix83(olympus(株)制)，一边培养一边延时观察细胞粘附及凝集化的形态。结果，如图5所示，确认到刚接种后整面分散的细胞经时地向涂覆有细胞培养的涂布膜形成剂1的部位(斑点)粘附。在2小时后的时间点，不存在不粘附而浮游的细胞。此外确认到，在8小时后的时间点，已粘附的细胞从培养皿剥落而凝集，形成细胞凝集块(球状体)。
[0264]
产业上的可利用性
[0265]
由以上的内容表明，通过将包含本发明涉及的聚合物的涂布膜与喷墨装置组合、并以点状高密度地涂布于具有抑制细胞附着的能力的基板(例如，细胞低粘附培养皿)上，能够使接种细胞全部粘附于斑点而凝集化。即，表明通过使用本发明的细胞凝集块制造用基板(其在培养皿或皿的底面、板表面等具有抑制细胞附着的能力的基板上高密度地具备由本发明涉及的聚合物形成的多个斑点)而不使用球状体形成用的多孔板等，从而仅通过将细胞接种于具有涂布膜(斑点)的基板平面上即可形成均匀尺寸的球状体，不仅如此，制造球状体时接种的细胞的利用效率也提高。