一种多模式梯度超声酶法制备低致敏克氏原螯虾肽的方法与流程

1.本发明涉及一种多模式梯度超声酶法制备低致敏克氏原螯虾肽的方法，属于食品加工技术领域。


背景技术：

2.克氏原螯虾(procambarus clarkii)，俗称小龙虾、淡水龙虾、隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、螯虾科、原螯虾属。克氏原螯虾肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱。2021年，我国克氏原螯虾产业总产值为4221亿元，同比增长22％。克氏原螯虾主要产业为餐饮业，此外，克氏原螯虾也适宜加工成肽液或肽粉。然而，克氏原螯虾属于甲壳类动物，甲壳动物在联合国粮农组织提出的八大类致敏食物中的一类。甲壳动物过敏后临床症状常见的是皮肤反应和消化道反应，严重的过敏可至休克甚至死亡。
3.虾蟹等甲壳类水产品中主要的过敏原为原肌球蛋白(tm)，tm是一种存在于肌肉中的调节性结构蛋白，易溶于水，其蛋白分子量约为32～40kda，其结构由2个亚甲基组成，每个亚甲基呈α-螺旋结构，并与另一个亚甲基缠绕形成超螺旋结构，因此tm热稳定性好，常规加热方法很难将其结构破坏，无法降低其致敏性。cn109363108 a公开的技术方案中，针对凡纳滨对虾致敏性问题，采用超声辅助两次乳酸菌发酵技术，一定程度上降低了虾肉的致敏性，保持了虾肉良好的口感和风味。cn 114287584 a公开的技术方案中，采用冷等离子体对虾浆液进行放电预处理，加入还原糖进行糖基化反应，其中，冷等离子体放电会破坏虾过敏原的蛋白结构，使得结构展开，为糖基化提供更多的反应位点，降低其致敏性，且改善产品风味。cn 114287583 a进一步公开的技术方案中，采用介质阻隔等离子体加工技术对海藻糖溶液进行处理，制备消敏液，再将虾仁加入到致敏液中，采用超声处理，加入定型液进行绞碎，得到虾滑，能够有效降低蛋白致敏性，并增强了虾蛋白的凝胶特性，使之更具弹爽的口感。


技术实现要素：

4.为了进一步提高克氏原螯虾肽的酶解制备得率，降低其致敏性，改善肽粉的感官特性，本发明提供了一种多模式梯度超声酶法制备低致敏克氏原螯虾肽的方法，按照下述步骤进行：
5.(1)将克氏原螯虾清洗去壳后，所得虾肉进行两步粉碎，制成虾浆液；将虾浆液进行第一步多模式超声处理；加入适量酶，进行第二步多模式梯度超声联合酶解反应；
6.(2)将所得酶解液进行离心去渣和过滤处理，过滤后的截留液再返回到酶解工序，进行二次酶解；滤过液进行灭酶、真空浓缩、复配、均质、喷雾干燥等工艺，制得高活性低致敏性克氏原螯虾肽粉。
7.步骤(1)所述的第一步多模式超声梯度式预处理，其条件为：超声频率20/23khz、25/28khz和33/40khz，超声功率密度100～500w/l，超声时间15～30min，间歇比10s/4s，温度20～40℃，双频超声的工作模式为同步模式，或者顺序模式；其超声处理顺序从高频超声
依次到低频超声，或者从低频依次到高频超声。
8.步骤(1)所述的酶为碱性蛋白酶。
9.步骤(1)所述的第二步多模式梯度超声联合酶解反应，其条件为：超声频率20/23khz、25/28khz和33/40khz，超声功率密度20～100w/l，间歇比5s/5s，温度20～50℃，其双频超声的工作模式为同步模式，或者顺序模式；其超声处理顺序从高频超声依次到低频超声，或者从低频依次到高频超声；碱性蛋白酶加入量为2000～8000u/ml虾浆液酶，解时间为2～4h，ph值为7～9。反应结束后，90℃加热5min，灭酶，并进行离心去除沉淀，得到克氏原螯虾酶解液。
10.步骤(2)所述的过滤方式为超滤技术。
11.本发明的有益效果：
12.(1)采用梯度多模式超声(高强度)对克氏原螯虾浆液进行处理，梯度多模式超声可以产生更多的空化气泡，组合共振现象更明显，并产生更高的声化学能，这些效应所产生的高剪切力大幅破坏了克氏原螯虾蛋白结构，包括其中的过敏原蛋白，不仅促进了后续克氏原螯虾蛋白的酶解效率，而且显著降低其致敏性。
13.(2)进一步采用梯度多模式超声(低强度)促进克氏原螯虾蛋白酶解过程，多模式超声通过强化传质增加酶和底物的接触几率以及对酶和底物构象的影响促进二者有效结合的方式，提高了克氏原螯虾蛋白酶解效率，并降低其致敏性。
14.(3)再采用超滤技术，将前二步残留的过敏原蛋白去除。
15.(4)采用两步梯度式超声作用，最大限度地使克氏原螯虾蛋白酶解成小分子肽，不仅增加了产品的溶解性，而且提升了产品的风味。
16.综合而论，本发明利用梯度多模式超声、酶解和超滤组合技术制备脱敏克氏原螯虾肽，有效地破坏克氏原螯虾各种致密蛋白质结构，促使不同结构蛋白质到得充分降解，进一步采用酶解反应，使得少量残留过敏原物质失去活性，在采用超滤技术去除最终的过敏源，最终获得一种高品质脱敏克氏原螯虾肽。
附图说明
17.图1为克氏原螯虾蛋白水解度，以及肽粉溶解度和致敏性变化情况，记原始致敏性为100％。
具体实施方式
18.为了更好地理解本发明，下面结合对比例和实施例进一步阐明本发明的内容和宗旨，以便更好地将本发明推广应用。
19.实施例1
20.将克氏原螯虾清洗去壳后，按照虾肉:水＝1:5的比例进行两步粉碎，制成虾浆液；将虾浆液进行第一步多模式梯度超声处理，超声频率20/23khz、25/28khz和33/40khz，超声功率密度150w/l，超声时间20min，间歇比10s/4s，三个双频超声的工作模式为顺序模式，超声处理顺序从低频依次到高频超声，反应体系温度为30℃。然后，将虾浆液的ph值调至8，再向体系按4000u/ml虾浆液加入碱性蛋白酶，超声频率20/23khz、25/28khz和33/40khz，超声功率密度40w/l，间歇比5s/5s，反应温度60℃，酶解时间3h；酶解反应完成后，95℃条件下灭
酶10min，并5000r/min离心10min，取克氏原螯虾酶解液的上清液进行超滤处理，截留液再返回到酶解工序，进行二次酶解；滤液进行真空浓缩至原体积的40％，加入其固形物质量10％的助干剂(麦芽糊精:β-环糊精＝2:1)，均质后进行喷雾干燥(进口温度130℃，出口温度80℃)，最后，将制备好的克氏原螯虾肽粉进行真空包装。经测定，所得克氏原螯虾肽粉致敏性降低至11％，蛋白的水解度达到42％，经模糊数学分析，所得肽粉感官综合评价得分为76.12。表1为克氏原螯虾肽粉模糊数学感官综合评价总分表。
21.实施例2
22.将克氏原螯虾清洗去壳后，按照虾肉:水＝1:5的比例进行两步粉碎，制成虾浆液；将虾浆液进行第一步多模式梯度超声处理，超声频率20/23khz、25/28khz和33/40khz，超声功率密度300w/l，超声时间20min，间歇比10s/4s，三个双频超声的工作模式为顺序模式，超声处理顺序从低频依次到高频超声，反应体系温度为30℃。然后，将虾浆液的ph值调至8，再向体系按6000u/ml虾浆液加入碱性蛋白酶，超声频率20/23khz、25/28khz和33/40khz，超声功率密度60w/l，间歇比5s/5s，反应温度60℃，酶解时间3h；酶解反应完成后，95℃条件下灭酶10min，并5000r/min离心10min，取克氏原螯虾酶解液的上清液进行超滤处理，截留液再返回到酶解工序，进行二次酶解；滤液进行真空浓缩至原体积的40％，加入其固形物质量10％的助干剂(麦芽糊精:β-环糊精＝2:1)，均质后进行喷雾干燥(进口温度130℃，出口温度80℃)，最后，将制备好的克氏原螯虾肽粉进行真空包装。经测定，所得克氏原螯虾肽粉致敏性降低至8％，蛋白的水解度达到48％，经模糊数学分析，所得肽粉感官综合评价得分为81.34(见表1)。
23.对比例1
24.将克氏原螯虾清洗去壳后，按照虾肉:水＝1:5的比例进行两步粉碎，制成虾浆液；将虾浆液的ph值调至8，再向体系按6000u/ml虾浆液加入碱性蛋白酶，超声频率20/23khz、25/28khz和33/40khz，超声功率密度60w/l，间歇比5s/5s，反应温度60℃，酶解时间3h；酶解反应完成后，95℃条件下灭酶10min，并5000r/min离心10min，取克氏原螯虾酶解液的上清液进行超滤处理，截留液再返回到酶解工序，进行二次酶解；滤液进行真空浓缩至原体积的40％，加入其固形物质量10％的助干剂(麦芽糊精:β-环糊精＝2:1)，均质后进行喷雾干燥(进口温度130℃，出口温度80℃)，最后，将制备好的克氏原螯虾肽粉进行真空包装。经测定，所得克氏原螯虾肽粉致敏性降低至32％，蛋白的水解度达到31％，经模糊数学分析，所得肽粉感官综合评价得分为71.13(见表1)。
25.对比例2
26.将克氏原螯虾清洗去壳后，按照虾肉:水＝1:5的比例进行两步粉碎，制成虾浆液；将虾浆液进行第一步多模式梯度超声处理，超声频率20/23khz、25/28khz和33/40khz，超声功率密度300w/l，超声时间20min，间歇比10s/4s，三个双频超声的工作模式为顺序模式，超声处理顺序从低频依次到高频超声，反应体系温度为30℃。然后，将虾浆液的ph值调至8，再向体系按6000u/ml虾浆液加入碱性蛋白酶，反应温度60℃，酶解时间3h；酶解反应完成后，95℃条件下灭酶10min，并5000r/min离心10min，取克氏原螯虾酶解液的上清液进行超滤处理，截留液再返回到酶解工序，进行二次酶解；滤液进行真空浓缩至原体积的40％，加入其固形物质量10％的助干剂(麦芽糊精:β-环糊精＝2:1)，均质后进行喷雾干燥(进口温度130℃，出口温度80℃)，最后，将制备好的克氏原螯虾肽粉进行真空包装。经测定，所得克氏原
螯虾肽粉致敏性降低至58％，蛋白的水解度达到25％，经模糊数学分析，所得肽粉感官综合评价得分为65.17(见表1)。
27.对比例3
28.将克氏原螯虾清洗去壳后，按照虾肉:水＝1:5的比例进行两步粉碎，制成虾浆液；将虾浆液的ph值调至8，再向体系按6000u/ml虾浆液加入碱性蛋白酶，反应温度60℃，酶解时间3h；酶解反应完成后，95℃条件下灭酶10min，并05000r/min离心10min，取克氏原螯虾酶解液的上清液进行超滤处理，截留液再返回到酶解工序，进行二次酶解；滤液进行真空浓缩至原体积的40％，加入其固形物质量10％的助干剂(麦芽糊精:β-环糊精＝2:1)，均质后进行喷雾干燥(进口温度130℃，出口温度80℃)，最后，将制备好的克氏原螯虾肽粉进行真空包装。经测定，所得克氏原螯虾肽粉致敏性降低至73％，蛋白的水解度达到22％，经模糊数学分析，所得肽粉感官综合评价得分为61.35(见表1)。
29.表1克氏原螯虾肽粉模糊数学感官综合评价总分表
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