用于检测SARS-CoV-2核酸的方法和组合物与流程

用于检测sars-cov-2核酸的方法和组合物
1.描述
技术领域
2.本技术涉及covid-19诊断医学领域，并且特别地涉及用于检测样品中的sars-cov-2核酸的方法。本技术还涉及用于确定样品中存在或不存在sars-cov-2的寡聚体组合。
3.背景
4.冠状病毒是一大家族的正义单链rna病毒，可能导致动物或人类疾病。在人类中，已知若干种冠状病毒会导致呼吸道感染，从普通感冒到更严重的疾病，如中东呼吸综合征(mers)和严重急性呼吸综合征(sars)。最近发现的冠状病毒sars-cov-2引起相关的冠状病毒疾病covid-19。
5.covid-19最常见的症状是发烧、疲倦和干咳。有些患者可能会出现疼痛(aches and pains)、鼻塞、流涕、喉咙痛或腹泻。这些症状通常是轻微的，并逐渐开始。有些人被感染，但没有出现任何症状，也没有感到不适。这种疾病可以通过感染者咳嗽或打喷嚏时产生的呼吸道飞沫传播。这些飞沫落在人周围的物体和表面上。其他人可能通过触摸这些物体或表面，然后触摸他们的眼睛、鼻子或嘴而获得sars-cov-2。
6.随后在世界范围内报告了人与人之间的传播。世界卫生组织(who)已将covid-19大流行定为国际关注的突发公共卫生事件。
7.因此，对于以高特异性和灵敏度检测样品中存在或不存在sars-cov-2的方法、试剂盒和组合物存在需求。这样的组合物、试剂盒和方法对于covid-19的诊断、筛选和/或监测样品中sars-cov-2的存在、或用于监测患者对治疗的响应将特别有用。
8.描述
9.除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与所描述的方法和组合物所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。如本文使用，以下术语和短语具有归于它们的含义，除非另有说明。
10.除非上下文另有明确指示，否则术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。
11.术语“样品”包括可能含有或怀疑含有sars-cov-2核酸或其组分(如sars-cov-2核酸的核酸或片段)的任何样本。样品可以是分离的样品。样品包括“生物样品”，其包括来源于活人或死人的任何组织或材料，这些组织或材料可能含有sars-cov-2或其组分(例如，从其衍生的靶核酸)。样品还包括“环境样品”和与生物或环境样品接触的取样装置(例如，拭子)。
[0012]“生物样品”包括体液，如尿液、血液、血浆、血清、外周血、红细胞、淋巴结、胃肠组织、粪便、脑脊液(csf)、精液、痰液、唾液或其他体液或材料以及固体组织。生物样品还包括细胞(如细胞系，从组织分离的细胞(无论所分离的细胞在从组织分离后是否培养)，固定的细胞(如为了组织学和/或免疫组织化学分析而固定的细胞))，组织(如活检材料)，或从哺乳动物获得的流体，包括从上呼吸道组织获得的流体(如鼻咽冲洗液、鼻咽抽吸液、鼻咽拭
子和口咽拭子)，从下呼吸道组织获得的流体(如细支气管灌洗液、气管抽吸液、胸膜抽吸液、痰液)，以及来自任何器官(例如但不限于肺、心、脾、肝、脑、肾和肾上腺)的组织。还包括从细胞和/或组织分离的核酸(例如，dna和rna)等。
[0013]“环境样品”包括环境材料，如表面物质、土壤、水和工业材料，以及从食品和乳制品加工仪器、器具、设备、一次性和非一次性物品获得的材料。
[0014]
可以处理样品以物理或机械地破坏组织或细胞结构，从而将细胞内组分释放到溶液中，该溶液可以进一步含有酶、缓冲液、盐、去垢剂等，用于使用标准方法制备用于分析的生物样品。此外，样品可以包括处理过的样品，例如通过将样品通过或穿过过滤装置，或离心后，或通过粘附于介质、基质或支持物而获得的那些处理过的样品。
[0015]
术语“核酸”是指包含两个或更多个具有含氮杂环碱基或碱基类似物的共价键合的核苷或核苷类似物的多聚化合物，其中核苷通过磷酸二酯键或其他连接(linkage)连接在一起以形成多核苷酸。核酸包括rna、dna、或嵌合dna-rna聚合物或寡核苷酸及其类似物。核酸“主链”可以由多种连接组成，包括糖-磷酸二酯连接、肽-核酸键(在“肽核酸”或pna中，参见wo95/32305)、硫代磷酸酯连接、甲基膦酸酯连接或其组合中的一种或更多种。核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或具有已知取代例如2’甲氧基取代和2’卤化物取代(例如2
’‑
f)的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(a、g、c、t、u)、其类似物(例如肌苷、5-甲基异胞嘧啶、异鸟嘌呤；the biochemistry of the nucleic acids 5-36,adams等人编著,第11版,1992,biotechniques(2007)43:617-24)，其包括嘌呤或嘧啶碱基的衍生物(例如，n4-甲基脱氧鸟苷、脱氮-或氮杂-嘌呤、脱氮-或氮杂-嘧啶、在5或6位具有取代基基团的嘧啶碱基、在2、6和/或8位具有改变或替代取代基的嘌呤碱基，如2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、o6-甲基鸟嘌呤、4-硫代嘧啶、4-氨基嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和o4-烷基嘧啶，以及吡唑化合物，如未取代或3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶；美国专利第5,378,825、6,949,367号和pct第wo 93/13121号)。核酸可以包括“无碱基”残基，其中对于一个或更多个残基，主链不包括含氮碱基(美国专利第5,585,481号)。核酸可以仅包含rna和dna中发现的常规糖、碱基和连接，或者可以包括常规组分和取代(例如，通过2’甲氧基主链连接的常规碱基，或者包括常规碱基和一种或更多种碱基类似物的混合物的核酸)。核酸可以包括“锁核酸”(lna)，其中一个或更多个核苷酸单体具有锁在rna中的双环呋喃糖单元，模拟糖构象，这增强了对单链rna(ssrna)、单链dna(ssdna)或双链dna(dsdna)中互补序列的杂交亲和力(biochemistry(2004)43:13233-41)。核酸可包括修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如，添加3
’‑
末端双脱氧核苷酸以阻止额外的核苷酸添加到核酸中。在体外制备核酸的合成方法是本领域熟知的，尽管核酸可以使用常规技术从天然来源纯化。
[0016]
如本文所用的术语“多核苷酸”表示核酸链。遍及本技术，核酸由5
’‑
末端到3
’‑
末端命名。合成的核酸，例如dna、rna、dna/rna嵌合体(包括当其中包含非天然核苷酸或类似物时)通常是“3’至5
’”
合成的，即通过在生长的核酸的5
’‑
末端添加核苷酸。
[0017]
如本文所用的“核苷酸”是由磷酸基团、5-碳糖和含氮碱基组成的核酸亚基。在rna中发现的5-碳糖是核糖。在dna中，5-碳糖是2
’‑
脱氧核糖。该术语还包括此类亚基的类似物，如核糖2’位是甲氧基基团(2
’‑
o-me)。
[0018]
如本文所用的“基于核酸的检测测定”是利用与靶序列特异性杂交的一种或更多种寡核苷酸检测靶核酸内的靶序列的测定。
[0019]
在某些实施方案中，基于核酸的检测测定是“基于扩增的测定”，即，利用一个或更多个步骤来扩增核酸靶序列的测定。用于检测测定的各种扩增方法是本领域已知的，在本文进一步概述其中的若干种。为了清楚起见，基于扩增的测定可以包括不扩增靶序列的一个或更多个步骤，诸如，例如，在非基于扩增的测定(non-amplification-based assay)方法(例如，杂交测定或基于裂解的测定)中使用的步骤。
[0020]
在其他实施方案中，基于核酸的检测测定是“非基于扩增的测定”，即不依赖于用于扩增核酸靶序列的任何步骤的测定。为了清楚起见，包括在不存在任何相应的下游扩增寡聚体的情况下延伸引物的反应(例如，通过逆转录酶延伸引物以产生rna:dna双链体，随后rna酶消化rna，产生与rna靶互补的单链cdna，但不产生cdna的拷贝)的基于核酸的检测测定被理解为非基于扩增的测定。
[0021]
如本文所用的“靶核酸”是包含待检测的靶序列的核酸。靶核酸可以是如本文所述的dna或rna，并且可以是单链或双链的。靶核酸可以包括除靶序列之外的其他序列。
[0022]“分离的”是指含有从其天然环境获取的靶核酸的样品，但这一术语并不意味着任何程度的纯化。
[0023]
如本文所用的术语“靶序列”是指待检测的靶核酸的特定核苷酸序列。“靶序列”包括在检测过程(例如基于扩增的检测测定，诸如例如tma或pcr，或者非基于扩增的检测测定，诸如例如基于裂解的测定)期间寡核苷酸(例如探针寡核苷酸、引发寡核苷酸和/或启动子寡核苷酸)与之复合(complex)的复合序列(complexing sequence)。在靶核酸最初是单链的情况下，术语“靶序列”也将指与存在于靶核酸中的“靶序列”互补的序列。在靶核酸最初是双链的情况下，术语“靶序列”是指有义链(+)和反义链(-)二者。在选择靶序列时，本领域技术人员将理解，应选择“独特”序列，以便区分无关或密切相关的靶核酸。
[0024]“靶杂交序列”在本文用于指寡聚体中被配置为与靶核酸序列杂交的部分。优选地，靶杂交序列被配置为与靶核酸序列特异性杂交。靶杂交序列可以但不一定与它们被配置为杂交的靶序列的部分100％互补。靶杂交序列还可以包括相对于靶序列插入、缺失和/或取代的核苷酸残基。例如，当靶核酸是物种内的多于一个毒株时，靶杂交序列与靶序列的互补性可能低于100％，例如配置成与sars-cov-2的多种基因型杂交的寡聚体的情况。应理解，还存在其他原因，使得将靶杂交序列配置为与靶核酸的互补性小于100％。
[0025]
如本文所用，关于sars-cov-2核酸的区域的术语“靶向某个序列(targets a sequence)”是指寡核苷酸以允许如本文所述的检测的方式与靶序列杂交的过程。在一些实施方案中，寡核苷酸与被靶向的sars-cov-2核酸序列互补并且不含错配。在其他实施方案中，寡核苷酸是互补的，但含有与被靶向的sars-cov-2核酸序列的1、2、3、4或5个错配。优选地，与靶核酸序列杂交的寡核苷酸包含与靶序列互补的至少10个至多达50个核苷酸。应当理解，至少10和多达50是包括性范围(inclusive range)，从而包括10、50和它们之间的每个整数。优选地，寡聚体与靶序列特异性杂交。
[0026]
术语“被配置成”表示提及的寡核苷酸靶杂交序列的多核苷酸序列配置的实际排列。例如，被配置成与靶序列特异性杂交的寡核苷酸具有在严格杂交条件下与提及的序列特异性杂交的多核苷酸序列。
[0027]
如本文所用的术语“被配置成与
……
特异性杂交”是指寡核苷酸的靶杂交区被设计为具有可靶向提及的sars-cov-2靶区的序列的多核苷酸序列。这样的寡核苷酸不限于仅
靶向该序列，而是作为靶向sars-cov-2靶核酸的组合物、在试剂盒中或在方法中相当有用。寡核苷酸被设计成用作从样品中检测sars-cov-2的测定的组分，并且因此被设计成在测试样品中存在常见的其他核酸的情况下靶向sars-cov-2。如本领域所理解的，“与
……
特异性杂交”并不意味着与其排他性杂交，因为可能会发生与非靶核酸的一些小水平的杂交。而是，“与
……
特异性杂交”意味着寡核苷酸被配置成在测定中起作用以主要与靶杂交，从而可以确定样品中靶核酸的准确检测。术语“被配置成”表示寡核苷酸靶杂交序列的多核苷酸序列配置的实际排列。
[0028]
如本文所用，关于被靶向的sars-cov-2核酸的术语“片段”是指一段连续的核酸。
[0029]
如本文所用的术语“区域”是指核酸的一部分，其中所述部分小于整个核酸。例如，当参考核酸是寡核苷酸启动子引物时，术语“区域”可用于指整个寡核苷酸的较小启动子部分。作为非限制性示例，当提及的核酸是扩增子时，术语区域可用于指由探针的靶杂交序列识别用于杂交的较小核苷酸序列。
[0030]
可互换的术语“寡聚体(oligomer)”、“寡聚物(oligo)”和“寡核苷酸(oligonucleotide)”是指通常具有少于1,000个核苷酸(nt)残基的核酸(包括rna、dna或嵌合dna-rna聚合物或寡核苷酸及其类似物)，包括在具有约5nt残基的下限和约500nt至900nt残基的上限范围中的聚合物。在一些实施方案中，寡核苷酸在具有约12nt至15nt的下限和约50nt至600nt的上限的大小范围中，而其他实施方案在具有约15nt至20nt的下限和约22nt至100nt的上限的大小范围中。寡核苷酸可以从天然存在的来源纯化，或者可以使用各种熟知的酶法或化学方法中的任何一种来合成。术语寡核苷酸并不表示试剂的任何特定功能；而是，它通常用于覆盖本文所述的所有此类试剂。寡核苷酸可以发挥多种不同的功能。例如，如果它对互补链是特异性的并且能够与互补链杂交，并且可以在存在核酸聚合酶的情况下进一步延伸，则它可以作为引物发挥作用；如果它包含被rna聚合酶识别并允许转录的序列(例如，t7引物)，则它可以作为引物发挥作用并提供启动子；并且如果它能够与靶核酸或其扩增子杂交，并且进一步提供可检测的部分(例如吖啶酯化合物)，则它可以用于检测靶核酸。
[0031]
如本文所用的，寡核苷酸可以“基本上对应于”指定的参考核酸序列，这意味着寡核苷酸与参考核酸序列足够相似，使得寡核苷酸具有与参考核酸序列相似的杂交特性，因为它将在严格的杂交条件下与相同的靶核酸序列杂交。本领域技术人员将理解，“基本上对应的寡核苷酸”可以不同于参考序列，但仍然与相同的靶核酸序列杂交。还应理解，与第二核酸对应的第一核酸包括其rna或dna等同物以及其dna/rna嵌合体，并包括其互补物，除非上下文另有明确规定。这种与核酸的变异可以用序列内相同碱基的百分比或者探针或引物与其靶序列之间完全互补碱基的百分比来表示。因此，在某些实施方案中，如果碱基同一性或互补性的这些百分比为100％到约80％，则寡核苷酸“基本上对应”于参考核酸序列。在优选实施方案中，百分比为100％至约85％。在更优选的实施方案中，该百分比为100％至约90％；在其他优选实施方案中，该百分比为100％至约95％。类似地，在本文中，核酸或扩增的核酸的区域可被称为对应于参考核酸序列。本领域技术人员将理解不同的互补性百分比可能需要对杂交条件的各种修改，以允许与特定靶序列杂交而不引起不可接受的水平的非特异性杂交。
[0032]
如本文所用的，提及dna序列的短语“其rna等同物、互补物、互补物的rna等同物或
dna/rna嵌合体”包括(除了提及的dna序列之外)所提及的dna序列的rna等同物、dna序列的互补物、所提及的dna序列的互补物的rna等同物、所提及的dna序列的dna/rna嵌合体和所提及的dna序列的互补物的dna/rna嵌合体。类似地，提及rna序列的短语“其dna等同物、互补物、互补物的dna等同物或dna/rna嵌合体”包括(除了参考rna序列之外)所提及的rna序列的dna等同物、rna序列的互补物、所提及的rna序列的互补物的dna等同物、所提及的rna序列的dna/rna嵌合体和所提及的rna序列的互补物的dna/rna嵌合体。
[0033]
如本文所用的，“封闭部分(blocking moiety)”是用于“封闭”寡核苷酸或其他核酸的3
’‑
末端以使其不能被核酸聚合酶有效延伸的物质。不意图由核酸聚合酶延伸的寡聚体可以包括代替3’oh的封闭基团，以防止在扩增反应中寡聚体的酶介导的延伸。例如，在扩增期间存在的封闭的扩增寡聚体和/或检测探针可以不具有功能性3’oh，而是包括位于3’末端处或3’末端附近的一个或更多个封闭基团。在一些实施方案中，封闭基团在3’末端附近并且可以在3’末端的五个残基内，并且足够大以限制聚合酶与寡聚体的结合。在其他实施方案中，封闭基团共价附接到3’末端。许多不同的化学基团可以用来封闭3’末端，如烷基基团、非核苷酸接头、烷烃-二醇双脱氧核苷酸残基和虫草素(cordycepin)。
[0034]“扩增寡聚体”是至少其3’末端与靶核酸互补，并且与靶核酸或其互补物杂交并参与核酸扩增反应的寡聚体。扩增寡聚体的一个实例是“引物”，其与靶核酸杂交，并包含在扩增过程中由聚合酶延伸的3’oh末端。扩增寡聚体的另一个实例是不被聚合酶延伸(例如，因为它具有3’封闭末端)但参与或促进扩增的寡聚体。例如，扩增寡核苷酸的5’区—例如本文所述的第一扩增寡聚体—可包含与靶核酸不互补的启动子序列(可称为“启动子引物”或“启动子提供者”)。本领域技术人员将理解，用作引物的扩增寡聚体可以被修饰为包括5’启动子序列，并从而用作启动子引物。掺入3’封闭的末端进一步修饰启动子引物，该启动子引物现在能够与靶核酸杂交并提供用于启动转录的上游启动子序列，但不提供用于寡聚物延伸的引物。这样的修饰的寡聚物在本文中称为“启动子提供者”寡聚体。扩增寡核苷酸的大小范围包括长约10nt至约70nt(不包括任何启动子序列或多a尾)的那些并包含与靶核酸序列(或其互补链)的一个区域互补的至少约10个连续碱基，或甚至至少12个连续碱基。连续碱基与扩增寡聚体结合的靶序列至少80％，或至少90％，或完全互补。扩增寡聚体可任选地包含修饰的核苷酸或类似物，或参与扩增反应但不与靶核酸或模板序列互补或不包含在靶核酸或模板序列中的另外的核苷酸。应理解，当提及寡核苷酸、扩增子或其他核酸的长度范围时，该范围包括所有整数(例如，长度为19-25个连续核苷酸包括19、20、21、22、23、24&25个连续核苷酸)。
[0035]
如本文所用，“启动子”是由dna依赖性rna聚合酶(“转录酶”)识别为结合核酸并在特定位点开始rna转录的信号的特定核酸序列。
[0036]
如本文所用，“启动子提供者”或“提供者”是指包含第一区域和第二区域的寡核苷酸，并且其被修饰以防止从其3’末端开始dna合成。启动子提供者寡核苷酸的“第一区域”包含与dna模板杂交的碱基序列，其中杂交序列位于启动子区3’侧，但不必邻近启动子区。启动子寡核苷酸的杂交部分通常长度为至少10个核苷酸，并且可以延伸到长度为50个或更多的核苷酸。“第二区域”包含rna聚合酶的启动子序列。将启动子寡核苷酸工程化，使其不能被rna或dna依赖性dna聚合酶(例如逆转录酶)延伸，优选地在其3’末端包含如上所述的封闭部分。如本文所述，“t7提供者”是提供被t7 rna聚合酶识别的寡核苷酸序列的封闭的启
动子提供者寡核苷酸。
[0037]“扩增”是指获得靶核酸序列或其互补物或片段的多于一个拷贝的任何已知程序。多于一个拷贝可称为扩增子或扩增产物。已知的扩增方法包括热循环和等温扩增方法二者。在一些实施方案中，等温扩增方法是优选的。复制酶介导的扩增、聚合酶链式反应(pcr)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和转录介导或转录相关的扩增是核酸扩增方法的非限制性实例。复制酶介导的扩增使用自复制rna分子和复制酶如qb-复制酶(例如，美国专利第4,786,600号)。pcr扩增使用dna聚合酶、引物对和热循环来合成dsdna的两条互补链的多于一个拷贝或从cdna合成多于一个拷贝(例如，美国专利第4,683,195号、第4,683,202号和第4,800,159号)。lcr扩增使用四种或更多种不同的寡核苷酸，通过使用杂交、连接和变性的多于一个循环来扩增靶及其互补链(例如，美国专利第5,427,930号和美国专利第5,516,663号)。sda使用包含限制性内切酶识别位点的引物和切割包含靶序列的半修饰的dna双链体的一条链的内切酶，由此在一系列引物延伸和链置换步骤中发生扩增(例如，美国专利第5,422,252号；美国专利第5,547,861号；和美国专利第5,648,211号)。优选的实施方案使用适合于扩增rna靶核酸的扩增方法，例如转录介导的扩增(tma)或nasba，但对本领域普通技术人员来说明显的是，本文公开的寡聚体可以容易地用作其他扩增方法中的引物。
[0038]“转录相关的扩增”，在本文也称为“转录介导的扩增”(tma)，是指使用rna聚合酶从核酸模板产生多于一个rna转录物的核酸扩增。这些方法通常使用rna聚合酶、dna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸和包含启动子序列的模板互补寡核苷酸，并且任选地可以包括一种或更多种其他寡核苷酸。如本文所述，tma方法是用于扩增和检测靶序列的扩增方法的实施方案。如先前详细公开的(例如，美国专利第4,868,105号；第5,124,246号；第5,130,238号；第5,437,990号；第5,554,516号；和第7,374,885号；和pct公布第wo 88/01302号、第wo 88/10315号及第wo 95/03430号)，转录相关扩增的变型是本领域熟知的。本领域普通技术人员将理解，所公开的组合物可用于基于聚合酶延伸寡聚体序列的扩增方法。
[0039]
如本文所用，术语“实时tma”是指由实时检测装置监测的靶核酸的单引物转录介导的扩增(“tma”)。
[0040]
与“扩增产物”可互换使用的术语“扩增子”是指在扩增程序期间产生的与靶序列中包含的序列互补或同源的核酸分子。这些术语可用于指单链扩增产物、双链扩增产物或双链扩增产物的一条链。扩增子的互补或同源序列在本文有时被称为“靶特异性序列”。使用本发明的扩增寡聚体产生的扩增子可以包括非靶特异性序列。扩增子可以是双链或单链的，并且可以包括dna、rna或二者。例如，dna依赖性rna聚合酶在转录介导的扩增程序期间从双链dna转录单链扩增子。这些单链扩增子是rna扩增子，并且可以是双链复合物的任一链，这取决于扩增寡聚体是如何配置的。因此，扩增子可以是单链rna。rna依赖性dna聚合酶合成与rna模板互补的dna链。因此，扩增子可以是双链的dna和rna的杂合体。rna依赖性dna聚合酶通常包括rna酶活性，或者与降解rna链的rna酶联合使用。因此，扩增子可以是单链dna。rna依赖性dna聚合酶和dna依赖性dna聚合酶从dna模板合成互补的dna链。因此，扩增子可以是双链dna。rna依赖性rna聚合酶从rna模板合成rna。因此，扩增子可以是双链rna。dna依赖性rna聚合酶从双链dna模板合成rna，也称为转录。因此，扩增子可以是单链rna。扩
增子和用于产生扩增子的方法是本领域技术人员已知的。本文为了方便起见，单链rna或单链dna可以代表由本发明的扩增寡聚体组合产生的扩增子。这样的代表并不意味着将扩增子限制为所示的代表。拥有本公开内容的技术人员将使用扩增寡聚体和聚合酶来产生多种类型的扩增子中的任何一种，所有这些扩增子都在本发明的精神和范围内。
[0041]
如本文所用，“dna依赖性dna聚合酶”是从dna模板合成互补的dna拷贝的酶。实例是来自大肠杆菌(e.coli)的dna聚合酶i、噬菌体t7dna聚合酶、或来自噬菌体t4、phi-29、m2或t5的dna聚合酶。dna依赖性的dna聚合酶可以是从细菌或噬菌体分离或重组表达的天然存在的酶，或者可以是修饰或“演化”的形式，这些形式已经被工程化以具有某些期望的特性，例如，热稳定性，或从多种修饰的模板识别或合成dna链的能力。所有已知的dna依赖性dna聚合酶要求互补的引物来启动合成。已知在适当的条件下，dna依赖性dna聚合酶可以从rna模板合成互补的dna拷贝。rna依赖性dna聚合酶通常也具有dna依赖性dna聚合酶活性。
[0042]
如本文所用，“dna依赖性rna聚合酶”或“转录酶”是从具有通常为双链的启动子序列的双链或部分双链dna分子合成多于一个rna拷贝的酶。rna分子(“转录物”)从启动子下游的一个特定位置开始，在5’至3’方向合成。转录酶的实例是来自大肠杆菌和噬菌体t7、t3和sp6的dna依赖性rna聚合酶。
[0043]
如本文所用，“rna依赖性dna聚合酶”或“逆转录酶”(“rt”)是从rna模板合成互补dna拷贝的酶。所有已知的逆转录酶也具有从dna模板产生互补dna拷贝的能力；因此，它们是rna和dna依赖性dna聚合酶。rt也可具有rna酶h活性。需要引物来启动rna和dna模板二者的合成。
[0044]
如本文所用，“选择性rna酶”是降解rna:dna双链体的rna部分但不降解单链rna、双链rna或dna的酶。示例性选择性rna酶是rna酶h。也可以使用具有与rna酶h相同或类似活性的酶。选择性rna酶可以是核酸内切酶或外切酶。大多数逆转录酶除了其聚合酶活性外，还含有rna酶h活性。然而，没有相关的聚合酶活性的rna酶h的其他来源是可得的。降解可能导致rna从rna:dna复合物分离。可选地，选择性rna酶可以简单地在不同位置切割rna，使得部分rna解链或允许酶解开部分rna。选择性地降解本发明的rna靶序列或rna产物的其他酶对于本领域普通技术人员来说将是明显的。
[0045]“探针”、“检测探针”、“检测寡核苷酸”和“检测探针寡聚体”在本文可互换地使用，以指在促进杂交以允许检测靶序列或扩增的核酸的条件下与核酸或扩增的核酸中的靶序列特异性杂交的核酸寡聚体。检测可以是直接的(例如，直接与其靶序列杂交的探针)或间接的(例如，通过中间分子结构连接到其靶的探针)。探针可以是dna、rna、其类似物或其组合(例如dna/rna嵌合体)，并且它们可以被标记或未标记。检测探针还可以包括替代的主链连接，例如2
’‑
o-甲基连接。探针的“靶序列”通常是指较大核酸序列中的较小核酸序列，该较小核酸序列通过标准碱基配对与探针寡聚体的至少一部分特异性杂交。探针可以包括靶特异性序列和有助于探针三维构象的其他序列(例如，美国专利第5,118,801号；第5,312,728号；第6,849,412号；第6,835,542号；第6,534,274号；和第6,361,945号；和美国公布第20060068417号)。在优选实施方案中，检测探针包括2’甲氧基主链，其可导致获得更高的信号。
[0046]
如本文所用，“标记物”是指直接或间接连接到探针的被检测或导致可检测信号的部分或化合物。直接标记可以通过连接标记物与探针的键或相互作用进行，包括共价键或
非共价相互作用，例如氢键、疏水和离子相互作用、或形成螯合物或配位络合物。间接标记可以通过使用桥接部分或“接头”来进行，例如结合对成员、抗体或另外的寡聚体，其被直接或间接标记，并且其可以扩增可检测的信号。标记物包括任何可检测的部分，例如放射性核素、配体(例如生物素、亲和素)、酶或酶底物、反应基团或生色团(例如赋予可检测颜色的染料、颗粒或珠)、发光化合物(例如生物发光、磷光或化学发光标记物)或荧光团。标记物可以在均质测定中可检测，其中混合物中结合的标记探针表现出与未结合的标记探针不同的可检测变化，例如不稳定性或差异降解特性。可以检测“均质可检测标记物”，而不物理地从未结合形式的标记物或标记探针移除结合形式(例如，美国专利第5,283,174号、第5,656,207号和第5,658,737号)。标记物包括化学发光化合物，例如，吖啶酯(“ae”)化合物，包括标准ae和衍生物(例如，美国专利第5,656,207号、第5,658,737号和第5,639,604号)。标记物的合成和将标记物附接到核酸和检测标记物的方法是熟知的(例如，sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual,第2版(cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny,1989)，第10章；美国专利第5,658,737号、第5,656,207号、第5,547,842号、第5,283,174号和第4,581,333号)。在特定探针上可以存在多于一种标记物和多于一种类型的标记物，或者检测可以使用探针的混合物，其中每个探针用产生可检测信号的化合物标记(例如，美国专利第6,180,340号和第6,350,579号)。
[0047]“捕获探针”、“捕获寡核苷酸”、“靶捕获寡核苷酸”和“捕获探针寡聚体”在本文可互换地使用，以指通过标准碱基配对与靶核酸中的靶序列特异性杂交并与固定探针上的结合伴侣连接以将靶核酸捕获到支持物上的核酸寡聚体。捕获寡聚体的一个实例包括包含两个结合区的寡核苷酸：靶杂交序列和固定探针结合区。本实例的变型是，这两个区域可以存在于通过一个或更多个接头连接在一起的两个不同的寡聚体上。捕获寡聚体的另一实施方案靶杂交序列是包含随机或非随机多gu、多gt或多u序列的序列，以非特异性地结合靶核酸并将其连接到支持物上的固定探针(参见，例如wo 2008/016988)。捕获寡聚体的另一个实例包括两个区域，靶杂交序列和不是核酸序列的结合对成员。
[0048]
如本文所用，“固定寡核苷酸”、“固定探针”或“固定核酸”是指将捕获寡聚体直接或间接连接到支持物上的核酸结合伴侣。连接到支持物上的固定探针有助于样品中捕获探针结合的靶与未结合的物质分离。固定探针的一个实施方案是连接到支持物的寡聚体，该支持物有助于样品中结合的靶序列与未结合的物质分离。支持物可以包括已知的材料，例如基质和溶液中游离的颗粒，其可以由硝化纤维素、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷、聚丙烯、金属或其他组合物制成，其中一个实施方案是磁吸引颗粒。支持物可以是单分散的磁性球(例如，均匀大小+5％)，固定探针直接(通过共价连接、螯合或离子相互作用)或间接(通过一个或更多个接头)连接到其上，其中探针和支持物之间的连接或相互作用在杂交条件期间是稳定的。
[0049]
如本文所用，“探针保护”或“探针保护寡聚体”可互换地用于指与检测探针寡聚体大体上互补的核酸寡聚体。探针保护寡聚体可以与大体上互补的、标记的检测探针寡聚体(例如，用化学发光化合物标记的探针)杂交，以在储存期间稳定标记的探针。所述探针保护寡聚体也可用于调整测定灵敏度。
[0050]
如本文所用，术语“互补”是指两个单链核酸的相似区域或同一单链核酸的两个不同区域的核苷酸序列具有允许单链区在严格杂交或扩增条件下杂交在一起形成稳定的双
链氢键区的核苷酸碱基组成。彼此杂交的序列可以通过标准核酸碱基配对(例如，g:c、a:t或a:u配对)与预定靶序列完全互补或部分互补。“充分互补”是指能够通过一系列互补碱基之间的氢键与另一序列杂交的连续序列，这些碱基可以通过标准碱基配对在序列中的每个位置互补，或者可以包含一个或更多个不互补的残基，包括无碱基残基。充分互补的连续序列通常至少80％或至少90％与寡聚体意图特异性杂交的序列互补。“充分互补”的序列允许核酸寡聚体在适当的杂交条件下与其靶序列的稳定杂交，即使序列不完全互补。当一个单链区的连续核苷酸序列能够与另一个单链区的类似核苷酸序列形成一系列“规范的”氢键碱基对，使得a与u或t配对，并且c与g配对时，这些核苷酸序列是“完全”互补的(参见例如，sambrook等人，molecular cloning,a laboratory manual,第2版(cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,1989)于
§§
1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51和11.47-11.57，特别是
§§
9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47和11.55-11.57，通过引用并入本文)。应理解，同一性百分比的范围包括所有整数和部分数(partial number)(例如，至少90％包括90、91、93.5、97.687等)。
[0051]“优先杂交”或“特异性杂交”是指在严格的杂交测定条件下，探针与它们的靶序列或其复制物杂交，形成稳定的探针:靶杂合体，同时使稳定的探针:非靶杂合体的形成最小化。因此，探针与靶序列或其复制物的杂交程度比与非靶序列的杂交程度大得多，以使本领域普通技术人员能够准确地检测或定量扩增期间形成的靶序列的rna复制物或互补dna(cdna)。合适的杂交条件是本领域熟知的，可以根据序列组成预测，或者可以通过使用常规测试方法来确定(参见例如，sambrook等人，molecular cloning,a laboratory manual,第2版(cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,1989)于
§§
1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51和11.47-11.57，特别是
§§
9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47和11.55-11.57，通过引用并入本文)。
[0052]“核酸杂合体”、“杂合体”或“双链体”是指含有双链氢键区的核酸结构，其中每条链彼此互补，并且其中该区域在严格的杂交条件下足够稳定，可以通过包括但不限于化学发光或荧光检测、放射自显影或凝胶电泳的手段检测。这样的杂合体可以包括rna:rna、rna:dna、或dna:dna双链体分子。
[0053]“样品制备”是指处理样品以便随后扩增和/或检测样品中存在的sars-cov-2核酸的任何步骤或方法。样品可以是组分的复杂混合物，其中靶核酸是少数组分。样品制备可包括从较大样品体积浓缩组分如微生物或核酸的任何已知方法，例如通过从较大体积样品过滤气载或水载颗粒或通过使用标准微生物学方法从样品分离微生物。样品制备可包括细胞组分的物理破碎和/或化学裂解，以将细胞内组分释放到大体上水相或有机相中，以及去除碎片，例如通过使用过滤、离心或吸附。样品制备可以包括使用核酸寡核苷酸，该核酸寡核苷酸选择性地或非特异性地捕获靶核酸并将其与其他样品组分分离(例如，如美国专利第6,110,678号和国际专利申请公布第wo 2008/016988号所述，每一项通过引用并入本文)。
[0054]“分离”或“纯化”是指将样品的一种或更多种组分从其他样品组分移除或分离。样品组分包括通常处于一般水性溶液相的靶核酸，也可能包括细胞碎片、蛋白质、碳水化合物、脂质和其他核酸。“分离”或“纯化”并不意味着任何程度的纯化。通常，分离或纯化从其他样品组分中取出至少70％、或至少80％、或至少95％的靶核酸。
[0055]
在扩增和/或检测系统的上下文中，术语“特异性”在本文用于指该系统的特性，该
特性描述了其根据序列和测定条件区分靶序列和非靶序列的能力。在核酸扩增方面，特异性一般是指产生的特定扩增子数与副产物数的比值(如信噪比)。在检测方面，特异性一般是指靶核酸产生的信号与非靶核酸产生的信号的比值。
[0056]
术语“灵敏度”在本文用于指核酸扩增反应可被检测或定量的精密度。扩增反应的灵敏度通常是在扩增系统中可以可靠地检测到的靶核酸的最小拷贝数的度量，并且将取决于例如所采用的检测测定和扩增反应的特异性，例如，特定扩增子与副产物的比值。
[0057]
如本文所用，术语“相对光单位”(“rlu”)是任意测量单位，指示样品在给定波长或波长带发射的光子的相对数量。rlu随用于测量的检测手段的特性而变化。
[0058]
本公开内容整体上涉及用于检测样品例如生物样品中存在或不存在sars-cov-2的方法和寡聚体组合。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于诊断受试者中的covid-19的方法和寡聚体组合。在其他非互斥实施方案中，本公开内容提供了用于检测样品中的sars-cov-2的方法，其中该方法包括对来自sars-cov-2的靶核酸进行基于扩增的检测。本公开内容还提供了包含用于检测样品中的sars-cov-2的寡聚体组合的组合物、反应混合物和试剂盒。寡聚体组合通常包括至少两种用于检测样品中的sars-cov-2的扩增寡聚体，并且还可以包括一种或更多种如本文所述的用于执行sars-cov-2的基于扩增的检测的另外的寡聚体，例如捕获探针和/或检测探针。
[0059]
诊断covid-19的方法通常包括检测来自受试者的样品中存在或不存在sars-cov-2。样品可以被怀疑感染或含有sars-cov-2。受试者可以被怀疑感染sars-cov-2或患有covid-19。特别地，在sars-cov-2核酸样品中进行特异性检测的测定。基于检测测定的结果，分配sars-cov-2的状态为阳性或阴性。受试者中存在或不存在covid-19可以基于sars-cov-2状态来确定。
[0060]
虽然可以使用任何合适的方法检测sars-cov-2核酸，优选使用基于核酸的检测测定来检测该病毒。基于核酸的检测测定通常利用与sars-cov-2的靶核酸特异性杂交但与样品中疑似存在的其他核酸的交叉反应性最小的寡核苷酸。因此，用于基于核酸的sars-cov-2检测的寡核苷酸将对其他核酸具有最小的交叉反应性，所述其他核酸包括例如sars冠状病毒和其他相关的沙贝病毒亚属病毒(sarbecovirus)。
[0061]
来自根据本公开内容的基于核酸的检测测定的阳性信号指示样品中存在sars-cov-2。
[0062]
在一些实施方案中，使用包括使用基于核酸的检测测定—例如基于扩增的测定—的方法来检测sars-cov-2。这种方法通常包括利用体外核酸扩增反应来扩增靶核酸内的靶序列和通过例如将扩增产物与核酸检测探针特异性杂交来检测扩增产物，所述核酸检测探针提供指示样品中存在靶的信号。扩增步骤包括将样品与对靶核酸中的靶序列特异的两种或更多种扩增寡聚体接触，以产生扩增产物(如果靶核酸存在于样品中的话)。扩增通过使用至少一种核酸聚合酶来利用模板链从扩增寡聚体(引物)延伸序列来合成靶序列或其互补物的另外拷贝。用于检测扩增产物的一种实施方案使用杂交步骤，所述杂交步骤包括使扩增产物与对由所选扩增寡聚体扩增的序列特异的至少一种探针接触，由所选扩增寡聚体扩增的序列例如包含在侧接一对所选扩增寡聚体的靶序列中的序列。合适的扩增方法包括，例如，复制酶介导的扩增、聚合酶链式反应(pcr)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和转录介导的或转录相关的扩增(tma)。这样的扩增方法是本领域熟知的(参见例如，
上文对扩增方法的讨论)，并且根据本公开内容的方法容易使用。
[0063]
例如，一些使用tma扩增的扩增方法包括以下步骤。简单地说，含有待扩增序列的靶核酸被提供为单链核酸(例如ssrna或ssdna)。本领域技术人员将理解，双链核酸(例如，dsdna)的常规解链可用于提供单链靶核酸。启动子引物在其靶序列处特异性结合靶核酸，并且逆转录酶(rt)以靶链为模板延伸启动子引物的3’末端，以产生靶序列链的cdna拷贝，产生rna:dna双链体。rna酶消化rna:dna双链体的rna链，并且第二引物特异性结合其靶序列，该靶序列位于启动子引物末端下游的cdna链上。rt通过使用第一cdna模板延伸第二引物的3’末端来合成新的dna链，以创建包含功能启动子序列的dsdna。然后，对启动子序列特异的rna聚合酶启动转录，以产生反应中初始靶链的约100至1000个扩增拷贝的rna转录物(“扩增子”)。当第二引物特异性地结合每个扩增子中的其靶序列时，扩增继续进行，并且rt从扩增子rna模板产生dna拷贝，以产生rna:dna双链体。反应混合物中的rna酶从rna:dna双链体消化扩增子rna，并且启动子引物特异性地结合新合成的dna中的其互补序列。rt延伸启动子引物的3’末端以产生含有功能启动子的dsdna，rna聚合酶与该功能启动子结合以转录与靶链互补的另外的扩增子。在反应过程期间，产生更多扩增子拷贝的自催化循环重复进行，产生样品中存在的靶核酸的约十亿倍扩增。扩增产物可以在扩增期间实时检测，或可以在扩增反应结束时通过使用特异性结合扩增产物中包含的靶序列的探针来检测。检测结合的探针产生的信号表明样品中存在靶核酸。
[0064]
在一些实施方案中，方法利用“反向”tma反应。在这样的变型中，初始或“正向”扩增寡聚体是在靶区3’末端附近与靶核酸杂交的引发寡核苷酸。逆转录酶(rt)通过使用靶核酸作为模板延伸引物的3’末端来合成cdna链。第二或“反向”扩增寡聚体是具有靶杂交序列的启动子引物或启动子提供者，该靶杂交序列被配置为与包含在合成的cdna链中的靶序列杂交。在第二扩增寡聚体是启动子引物的情况下，rt使用cdna链作为模板延伸启动子引物的3’末端，以产生靶序列链的第二cdna拷贝，从而产生含有功能启动子序列的dsdna。然后，扩增基本上如上所述继续进行，以利用rna聚合酶从启动子序列启动转录。可选地，在第二扩增寡聚体是启动子提供者的情况下，通常使用与靶区5’末端附近的靶序列杂交的终止寡核苷酸来终止在终止寡核苷酸3’末端的引发寡聚体的延伸，从而为通过从引发寡聚体延伸合成的初始cdna链提供指定的3’末端。然后，启动子提供者的靶杂交序列与初始cdna链的指定的3’末端杂交，并且该cdna链的3’末端被延伸以添加与启动子提供者的启动子序列互补的序列，导致形成双链启动子序列。然后使用识别双链启动子并由此启动转录的rna聚合酶使用模板将初始cdna链转录为与初始cdna链互补的不包括启动子部分的多于一个rna转录物。然后，这些rna转录物中的每一个可用作从第一引发扩增寡聚体进一步扩增的模板。
[0065]
对扩增产物的检测可以通过检测与扩增的靶序列特异性相关的信号的多种方法来完成。核酸可以与导致物理变化例如可检测的电变化的表面缔合。扩增的核酸可以通过将它们浓缩在基质中或基质上并检测核酸或与它们缔合的染料(例如间插剂，如溴化乙锭或cyber green)，或检测溶液相中与核酸缔合的染料的增加来检测。其他检测方法可以使用核酸检测探针寡聚体，其被配置为与扩增产物中的序列特异性杂交并检测探针:产物复合物的存在，或者通过使用可扩增与扩增产物相关联的可检测信号的探针复合物(例如，美国专利第5,424,413号；第5,451,503号；和第5,849,481号)。与扩增产物特异性相关的直接或间接标记的探针提供指示样品中存在靶核酸的可检测信号。
[0066]
与互补扩增序列杂交的检测探针寡聚体(标记的)可以是dna或rna寡聚体，或者含有dna和rna核苷酸组合的寡聚体，或者用修饰的主链合成的寡聚体，例如，包含一个或更多个2
’‑
甲氧基取代的核糖核苷酸的寡聚体。用于检测扩增序列的探针可以是未标记的并被间接地检测(例如，通过将另一结合伴侣结合到探针上的部分)，或者可以用多种可检测标记物来标记。在用于检测sars-cov-2的方法的一些实施方案中，例如在使用转录介导的扩增(tma)的某些实施方案中，检测探针是直链的(linear)化学发光标记的探针，例如直链的吖啶酯(ae)标记的探针。检测步骤还可以提供关于扩增序列的另外信息，例如，其全部或部分核酸碱基序列。检测可以在扩增反应完成后进行，或者可以与扩增靶区域同时进行，例如实时进行。在一种实施方案中，检测步骤允许均匀检测，例如，检测杂交探针而不从混合物中移除未杂交探针(参见例如美国专利第5,639,604号和第5,283,174号)。
[0067]
在扩增产物的检测发生在扩增步骤接近结束或结束时的实施方案中，直链检测探针可用于提供指示探针与扩增产物杂交的信号。这样的检测的一个实例使用与靶核酸杂交的发光标记探针。然后从非杂交的探针水解发光标记。检测通过使用光度计的化学发光进行。(参见例如，国际专利申请公布第wo 89/002476号)。在使用实时检测的其他实施方案中，检测探针可以是发夹探针，诸如例如分子信标、分子炬或杂交开关探针，该检测探针用当探针与扩增产物结合时被检测到的报告部分标记。这样的探针可以包含靶杂交序列和非靶杂交序列。以前已经描述了这样的探针的各种形式(参见例如，美国专利第5,118,801号；第5,312,728号；第5,925,517号；第6,150,097号；第6,849,412号；第6,835,542号；第6,534,274号；和第6,361,945号；和美国专利申请公布第20060068417a1号和第20060194240a1号)。
[0068]
在利用基于核酸的检测测定的某些实施方案中，方法还包括从样品中的其他组分纯化sars-cov-2靶核酸。这样的纯化可以包括从其他样品组分分离和/或浓缩样品中包含的生物体的方法。在特定的实施方案中，纯化靶核酸包括捕获靶核酸以特异性或非特异性地将靶核酸与其他样品组分分离。非特异性靶捕获方法可以包括从基本上含水的混合物选择性沉淀核酸，将核酸粘附到支持物，所述支持物经洗涤以除去其他样品组分，或从包含sars-cov-2核酸和其他样品组分的混合物物理分离核酸的其他手段。
[0069]
在一些实施方案中，通过将sars-cov-2的靶核酸与捕获探针寡聚体杂交，将靶核酸与其他样品组分分离。捕获探针寡聚体包含靶杂交序列，该靶杂交序列被配置为特异性或非特异性地与靶核酸杂交，以形成与其他样品组分分离的[靶核酸]:[捕获探针]复合物。包含适合于非特异性捕获靶核酸的靶杂交序列的捕获探针在例如wo 2008/016988中描述。
[0070]
在包含被配置为与sars-cov-2靶核酸特异性杂交的一种或更多种靶杂交序列的一些具体变型中，sars-cov-2特异性捕获探针包含靶杂交序列。在优选的变型中，捕获探针将[靶核酸]:[捕获探针]复合物结合到固定探针以形成[靶核酸]:[捕获探针]:[固定探针]复合物，该[靶核酸]:[捕获探针]:[固定探针]复合物从样品分离并任选地被洗涤以去除非靶样品组分(参见，例如，美国专利第6,110,678号；第6,280,952号；和第6,534,273号)。在这样的变型中，捕获探针寡聚体还包含将捕获探针及其结合的靶序列结合到附着在固体支持物的固定探针的序列或部分，从而允许杂交的靶核酸与其他样品组分分离。
[0071]
在一些实施方案中，捕获探针寡聚体包含不与靶核酸互补但与固定探针上的序列特异性杂交的尾部分(例如，3’尾)，从而用作允许靶核酸与其他样品组分分离的部分，例如
先前在例如美国专利第6,110,678号中描述的。任何序列可以用在尾区中，该尾区通常长约5至50个核苷酸，并且优选的实施方案包括约10至40个核苷酸(例如，a10至a40)，更优选地约14至33nt(例如，a14至a30或t3a14至t3a30)的大体上均聚的尾，其与附着在固体支持物(例如基质或颗粒)的互补的固定序列(例如多t)结合。
[0072]
靶捕获通常发生在含有一种或更多种捕获探针寡聚体的溶液相混合物中，所述捕获探针寡聚体在杂交条件下，通常在高于[尾序列]:[固定探针序列]双链体的tm的温度与靶核酸杂交。对于包含捕获探针尾的实施方案，通过调整杂交条件捕获[靶核酸]:[捕获探针]复合物，从而使捕获探针尾与固定探针杂交，并且然后将固体支持物上的整个复合物与其他样品组分分离。可洗涤附有[固定探针]:[捕获探针]:[靶核酸]的支持物一次或更多次，以进一步去除其他样品组分。优选的实施方案使用颗粒状固体支持物，例如顺磁珠，以便附有[靶核酸]:[捕获探针]:[固定探针]复合物的颗粒可以悬浮在洗涤溶液中，并优选地通过使用磁吸引从洗涤溶液回收。在包括使用基于扩增的检测测定的方法的实施方案中，为了限制处理步骤的数量，可以通过简单地将支持物上的复合物中的靶核酸与扩增寡聚体混合并继续扩增步骤来扩增靶核酸。
[0073]
根据本发明，检测sars-cov-2的存在或不存在可以单独进行(例如，在单独的反应容器中)，或者作为多重反应系统与另一测定一起进行。因此，在一些实施方案中，如本文所述的方法(例如，诊断covid-19的方法)利用多重反应，其中反应混合物包含用于平行测定多于一个(例如，至少两个、三个、四个或更多个)不同靶序列的试剂。在这些情况下，反应混合物可包含用于执行检测测定的多于一个不同的靶特异性寡核苷酸。例如，在利用基于扩增的检测测定的方法中，多重反应可以包含多于一组(例如，多于一对)扩增寡聚体(例如，多于一对pcr引物或多于一对tma扩增寡聚体(例如，对于tma，多于一对启动子引物和非启动子引物，或多于一对启动子提供者和非启动子引物))。
[0074]
在一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中的sars-cov-2核酸的方法，所述方法包括：
[0075]
(1)将样品与用于扩增sars-cov-2靶核酸的至少一个靶区的至少两种扩增寡聚体接触，所述样品怀疑含有sars-cov-2核酸，其中所述至少两种扩增寡聚体包含：
[0076]
(i)用于扩增sars-cov-2核酸的第一靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体，其中
[0077]
(a)第一扩增寡聚体包含第一靶杂交序列，所述第一靶杂交序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:2、seq id no:4和seq id no:23组成的组的序列；和
[0078]
(b)第二扩增寡聚体包含第二靶杂交序列，所述第二靶杂交序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:5和seq id no:6组成的组的序列；
[0079]
和/或
[0080]
(ii)用于扩增sars-cov-2核酸的第二靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体，其中
[0081]
(a)第一扩增寡聚体包含第一靶杂交序列，所述第一靶杂交序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:27和seq id no:29组成的组的序列；和
[0082]
(b)第二扩增寡聚体包含第二靶杂交序列，所述第二靶杂交序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:30和seq id no:31组成的组的序列；
[0083]
(2)进行体外核酸扩增反应，其中所述样品中存在的任何sars-cov-2靶核酸用作产生扩增产物的模板；和
[0084]
(3)检测所述扩增产物的存在或不存在，从而指示所述样品中存在或不存在sars-cov-2靶核酸。
[0085]
在方法的一些实施方案中，用于扩增第一靶区的第一扩增寡聚体包含以下或由以下组成：选自由seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:22和seq id no:23组成的组的序列。
[0086]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区的第二扩增寡聚体包含以下或由以下组成：选自由seq id no:5和seq id no:6组成的组的序列。
[0087]
在一些实施方案中，用于扩增第二靶区的第一扩增寡聚体包含以下或由以下组成：选自由seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28和seq id no:29组成的组的序列。
[0088]
在一些实施方案中，用于扩增第二靶区的第二扩增寡聚体包含以下或由以下组成：选自由seq id no:30和seq id no:31组成的组的序列。
[0089]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区和/或第二靶区的第一扩增寡聚体是还包含位于第一靶杂交序列5’侧的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。
[0090]
在一些实施方案中，启动子序列是t7启动子序列。
[0091]
在一些实施方案中，t7启动子序列包含seq id no:7或由seq id no:7组成。
[0092]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体的第一靶杂交序列和第二靶杂交序列分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0093]
(a)seq id no:2、seq id no:4或seq id no:23和seq id no:5；或
[0094]
(b)seq id no:2、seq id no:4或seq id no:23和seq id no:6；或
[0095]
(c)seq id no:2和seq id no:5或seq id no:6；或
[0096]
(d)seq id no:4和seq id no:5或seq id no:6；或
[0097]
(e)seq id no:23和seq id no:5或seq id no:6；或
[0098]
(f)seq id no:2和seq id no:5；或
[0099]
(g)seq id no:2和seq id no:6；或
[0100]
(h)seq id no:4和seq id no:5；或
[0101]
(i)seq id no:4和seq id no:6，或
[0102]
(j)seq id no:23和seq id no:5；或
[0103]
(k)seq id no:23和seq id no:6。
[0104]
在一些实施方案中，用于扩增第二靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体的第一靶杂交序列和第二靶杂交序列分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0105]
(a)seq id no:27或seq id no:29和seq id no:30；或
[0106]
(b)seq id no:27或seq id no:29和seq id no:31；或
[0107]
(c)seq id no:27和seq id no:30或seq id no:31；或
[0108]
(d)seq id no:29和seq id no:30或seq id no:31；或
[0109]
(e)seq id no:27和seq id no:30；或
[0110]
(f)seq id no:27和seq id no:31；或
[0111]
(g)seq id no:29和seq id no:30；或
[0112]
(h)seq id no:29和seq id no:31。
[0113]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区或第二靶区的至少两种扩增寡聚体包括冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体。
[0114]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区的冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体的第一靶杂交序列和第二靶杂交序列分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0115]
(a)seq id no:2和seq id no:4和seq id no:5；或
[0116]
(b)seq id no:2和seq id no:4和seq id no:6；或
[0117]
(c)seq id no:2和seq id no:5和seq id no:6；或
[0118]
(d)seq id no:4和seq id no:5和seq id no:6；或
[0119]
(e)seq id no:2和seq id no:4和seq id no:5和seq id no:6；或
[0120]
(f)seq id no:2和seq id no:23和seq id no:5；或
[0121]
(g)seq id no:2和seq id no:23和seq id no:6；或
[0122]
(h)seq id no:23和seq id no:5和seq id no:6；或
[0123]
(i)seq id no:2和seq id no:23和seq id no:5和seq id no:6；或
[0124]
(j)seq id no:4和seq id no:23和seq id no:5；或
[0125]
(k)seq id no:4和seq id no:23和seq id no:6；或
[0126]
(l)seq id no:4和seq id no:23和seq id no:5和seq id no:6。
[0127]
在一些实施方案中，用于扩增第二靶区的冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体的第一靶杂交序列和第二靶杂交序列分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0128]
(a)seq id no:27和seq id no:29和seq id no:30；或
[0129]
(b)seq id no:27和seq id no:29和seq id no:31；或
[0130]
(c)seq id no:27和seq id no:30和seq id no:31；或
[0131]
(d)seq id no:29和seq id no:30和seq id no:31；或
[0132]
(e)seq id no:27和seq id no:29和seq id no:30和seq id no:31。
[0133]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区和第二靶区的至少两种扩增寡聚体冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体。
[0134]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区和第二靶区的冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0135]
(a)seq id no:2、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:30和seq id no:31，或
[0136]
(b)seq id no:2、seq id no:23、seq id no:5、seq id no:6、seq id n:27、seq id no:29、seq id no:30和seq id no:31，或
[0137]
(c)seq id n:4、seq id no:23、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:30和seq id no:31。
[0138]
在一些实施方案中，本发明的方法还包括在步骤(1)之前从样品中的其他组分纯化靶核酸。
[0139]
在一些实施方案中，纯化步骤包括使样品与至少一种捕获探针寡聚体接触，所述
至少一种捕获探针寡聚体包含与结合固定探针的序列或部分共价附接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:9和seq id no:11组成的组或选自由seq id no:33和seq id no:35组成的组的序列。
[0140]
在一些实施方案中，在本发明的方法中，至少一种捕获探针寡聚体序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10和seq id no:11组成的组或选自由seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35组成的组的序列。
[0141]
在一些实施方案中，在本发明的方法中，至少一种捕获探针寡聚体是分别包含以下或由以下组成的至少两种捕获探针寡聚体：选自由seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10和seq id no:11组成的组的至少一种序列和选自由seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35组成的组的至少一种序列。
[0142]
在一些实施方案中，至少两种捕获探针寡聚体包含以下或由以下组成：seq id no:8、seq id no:10、seq id no:32和seq id no:34或seq id no:9、seq id no:11、seq id no:33和seq id no:35。
[0143]
在一些实施方案中，检测步骤(3)包括使所述体外核酸扩增反应与跟扩增产物杂交的至少一种检测探针寡聚体在确定存在或不存在扩增产物的条件下接触，从而指示所述样品中存在或不存在sars-cov-2。
[0144]
在一些实施方案中，至少一种检测探针寡聚体包含长度为约14至约40个核苷酸并与包含以下或由以下组成的靶序列杂交的靶杂交序列：seq id no:13、seq id no:13的dna等同物、seq id no:13的互补物、seq id no:13的互补物的dna等同物或seq id no:13的dna/rna嵌合体、或seq id no:25、seq id no:25的rna等同物、seq id no:25的互补物、seq id no:25的互补物的rna等同物或其dna/rna嵌合体。
[0145]
在一些实施方案中，检测探针靶杂交序列包含在seq id no:25的序列中，并且至少包括seq id no:13的序列。
[0146]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体包含seq id no:13或由seq id no:13组成。
[0147]
在一些实施方案中，至少一种检测探针寡聚体包含长度为约14至约40个核苷酸并与包含以下或由以下组成的靶序列杂交的靶杂交序列：seq id no:36、seq id no:36的dna等同物、seq id no:36的互补物、seq id no:36的互补物的dna等同物或seq id no:36的dna/rna嵌合体、或seq id no:43、seq id no:43的rna等同物、seq id no:43的互补物、seq id no:43的互补物的rna等同物或其dna/rna嵌合体。
[0148]
在一些实施方案中，检测探针靶杂交序列包含在seq id no:43的序列中，并且至少包括seq id no:36的序列。
[0149]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体包含seq id no:36或由seq id no:36组成。
[0150]
在一些实施方案中，至少一种检测探针寡聚体是分别包含seq id no:13和seq id no:36的至少两种不同的检测探针寡聚体。
[0151]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体以及检测探针寡聚体分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0152]
(a)seq id no:2和seq id no:5和seq id no:13；或
[0153]
(b)seq id no:2和seq id no:6；和seq id no:13；或
[0154]
(c)seq id no:4和seq id no:5；和seq id no:13；或
id no:21或seq id no:40或其互补物。
[0181]
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中的sars-cov-2核酸的方法，所述方法包括：
[0182]
(1)将样品与用于扩增sars-cov-2靶核酸的至少一个靶区的至少两种扩增寡聚体接触，所述样品怀疑含有sars-cov-2核酸，其中所述至少两种扩增寡聚体包含：
[0183]
(i)用于扩增sars-cov-2核酸的第一靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体，其中
[0184]
(a)第一扩增寡聚体包含第一靶杂交序列，所述第一靶杂交序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:2、seq id no:4和seq id no:23组成的组的序列；或
[0185]
(b)第二扩增寡聚体包含第二靶杂交序列，所述第二靶杂交序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:5和seq id no:6组成的组的序列；
[0186]
和/或
[0187]
(ii)用于扩增sars-cov-2核酸的第二靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体，其中
[0188]
(a)第一扩增寡聚体包含第一靶杂交序列，所述第一靶杂交序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:27和seq id no:29组成的组的序列；或
[0189]
(b)第二扩增寡聚体包含第二靶杂交序列，所述第二靶杂交序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:30和seq id no:31组成的组的序列；
[0190]
(2)进行体外核酸扩增反应，其中所述样品中存在的任何sars-cov-2靶核酸用作产生扩增产物的模板；和
[0191]
(3)检测扩增产物的存在或不存在，从而指示所述样品中存在或不存在sars-cov-2靶核酸。
[0192]
在一些实施方案中，所述扩增产物具有65至119个连续核苷酸的长度，并包含seq id no:21或seq id no:40或其互补物。
[0193]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区的第一扩增寡聚体包含以下或由以下组成：选自由seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:22和seq id no:23组成的组的序列。
[0194]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区的第二扩增寡聚体包含以下或由以下组成：选自由seq id no:5和seq id no:6组成的组的序列。
[0195]
在一些实施方案中，用于扩增第二靶区的第一扩增寡聚体包含以下或由以下组成：选自由seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28和seq id no:29组成的组的序列。
[0196]
在一些实施方案中，用于扩增第二靶区的第二扩增寡聚体包含以下或由以下组成：选自由seq id no:30和seq id no:31组成的组的序列。
[0197]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区和/或第二靶区的第一扩增寡聚体是还包含位于第一靶杂交序列5’侧的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。
[0198]
在一些实施方案中，启动子序列是t7启动子序列。
[0199]
在一些实施方案中，t7启动子序列包含seq id no:7或由seq id no:7组成。
[0200]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区和/或第二靶区的至少两种扩增寡聚体包括冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体。
[0201]
在一些实施方案中，冗余的寡聚体是以下组：
[0202]
(a)seq id no:2和seq id no:4；或
[0203]
(b)seq id no:2和seq id no:23；或
[0204]
(c)seq id no:4和seq id no:23；或
[0205]
(d)seq id no:5和seq id no:6，或
[0206]
(e)seq id no:27和seq id no:29，或
[0207]
(f)seq id no:30和seq id no:31。
[0208]
在一些实施方案中，本发明的方法还包括在步骤(1)之前从样品中的其他组分纯化靶核酸。
[0209]
在一些实施方案中，纯化步骤包括使样品与至少一种捕获探针寡聚体接触，所述至少一种捕获探针寡聚体包含与结合固定探针的序列或部分共价附接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:9和seq id no:11组成的组或选自由seq id no:33和seq id no:35组成的组的序列。
[0210]
在一些实施方案中，捕获探针寡聚体序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10和seq id no:11组成的组或选自由seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35组成的组的序列。
[0211]
在一些实施方案中，至少一种捕获探针寡聚体是分别包含以下或由以下组成的至少两种捕获探针寡聚体：选自由seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10和seq id no:11组成的组的至少一种序列和选自由seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35组成的组的至少一种序列。
[0212]
在一些实施方案中，至少两种捕获探针寡聚体包含以下或由以下组成：seq id no:8、seq id no:10、seq id no:32和seq id no:34或seq id no:9、seq id no:11、seq id no:33和seq id no:35。
[0213]
在一些实施方案中，检测步骤(3)包括使所述体外核酸扩增反应与被配置为与扩增产物特异性杂交的至少一种检测探针寡聚体在确定存在或不存在扩增产物的条件下接触，从而指示所述样品中存在或不存在sars-cov-2。
[0214]
在一些实施方案中，至少一种检测探针寡聚体包含长度为约14至约40个核苷酸并与包含以下或由以下组成的靶序列杂交的靶杂交序列：seq id no:13、seq id no:13的dna等同物、seq id no:13的互补物、seq id no:13的互补物的dna等同物或seq id no:13的dna/rna嵌合体、或seq id no:25、seq id no:25的rna等同物、seq id no:25的互补物、seq id no:25的互补物的rna等同物或其dna/rna嵌合体。
[0215]
在一些实施方案中，检测探针靶杂交序列包含在seq id no:17的序列中，并且至少包括seq id no:13的序列。
[0216]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体包含seq id no:13或由seq id no:13组成。
[0217]
在一些实施方案中，至少一种检测探针寡聚体包含长度为约14至约40个核苷酸并被配置为与包含以下或由以下组成的靶序列特异性杂交的靶杂交序列：seq id no:36、seq id no:36的dna等同物、seq id no:36的互补物、seq id no:36的互补物的dna等同物或seq id no:36的dna/rna嵌合体、或seq id no:43、seq id no:43的rna等同物、seq id no:43的互补物、seq id no:43的互补物的rna等同物或其dna/rna嵌合体。
[0218]
在一些实施方案中，检测探针靶杂交序列包含在seq id no:41的序列中，并且至少包括seq id no:36的序列。
[0219]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体包含seq id no:36或由seq id no:36组成。
[0220]
在一些实施方案中，至少一种检测探针寡聚体是分别包含seq id no:13和seq id no:36的至少两种不同的检测探针寡聚体。
[0221]
在一些实施方案中，用于扩增靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体以及检测探针寡聚体分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0222]
(a)seq id no:2和seq id no:5和seq id no:13；或
[0223]
(b)seq id no:2和seq id no:6；和seq id no:13；或
[0224]
(c)seq id no:4和seq id no:5；和seq id no:13；或
[0225]
(d)seq id no:4和seq id no:6和seq id no:13；或
[0226]
(e)seq id no:23和seq id no:5；和seq id no:13；或
[0227]
(f)seq id no:23和seq id no:6和seq id no:13。
[0228]
在一些实施方案中，用于扩增第二靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体以及检测探针寡聚体分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0229]
(a)seq id no:27和seq id no:30和seq id no:36；或
[0230]
(b)seq id no:27和seq id no:31；和seq id no:36；或
[0231]
(c)seq id no:29和seq id no:30；和seq id no:36；或
[0232]
(d)seq id no:29和seq id no:31；和seq id no:36。
[0233]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区和第二靶区的至少两种扩增寡聚体包括冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体和/或冗余的检测探针寡聚体。
[0234]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区和第二靶区的冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体和/或冗余的检测探针分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0235]
(a)seq id no:2、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6和seq no:13，或
[0236]
(b)seq id no:2、seq id no:23、seq id no:5、seq id no:6和seq no:13，或
[0237]
(c)seq id no:4、seq id no:23、seq id no:5、seq id no:6和seq no:13，或
[0238]
(d)seq id no:27、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31和seq no:36，或
[0239]
(e)seq id no:2、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq no:13和seq no:36，或
[0240]
(f)seq id no:2、seq id no:23、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq no:13和seq no:36或
[0241]
(g)seq id no:4、seq id no:23、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq no:13和seq no:36。
[0242]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体还包含核苷酸序列的核苷酸残基成员中的至少一个上的2’甲氧基修饰。
[0243]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体包含选自由化学发光标记物、荧光标记物、猝灭剂及其一种或更多种的组合组成的组的标记物。
[0244]
在一些实施方案中，标记物是连接在检测探针寡聚体的两个核碱基之间的化学发
id no:7或由seq id no:7组成。
[0265]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体的第一靶杂交序列和第二靶杂交序列分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0266]
(a)seq id no:2、seq id no:4或seq id no:23和seq id no:5；或
[0267]
(b)seq id no:2、seq id no:4或seq id no:23和seq id no:6；或
[0268]
(c)seq id no:2和seq id no:5或seq id no:6；或
[0269]
(d)seq id no:4和seq id no:5或seq id no:6；或
[0270]
(e)seq id no:23和seq id no:5或seq id no:6；或
[0271]
(f)seq id no:2和seq id no:5；或
[0272]
(g)seq id no:2和seq id no:6；或
[0273]
(h)seq id no:4和seq id no:5；或
[0274]
(i)seq id no:4和seq id no:6，或
[0275]
(j)seq id no:23和seq id no:5；或
[0276]
(k)seq id no:23和seq id no:6。
[0277]
在一些实施方案中，用于扩增第二靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体的第一靶杂交序列和第二靶杂交序列分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0278]
(a)seq id no:27或seq id no:29和seq id no:30；或
[0279]
(b)seq id no:27或seq id no:29和seq id no:31；或
[0280]
(c)seq id no:27和seq id no:30或seq id no:31；或
[0281]
(d)seq id no:29和seq id no:30或seq id no:31；或
[0282]
(e)seq id no:27和seq id no:30；或
[0283]
(f)seq id no:27和seq id no:31；或
[0284]
(g)seq id no:29和seq id no:30；或
[0285]
(h)seq id no:29和seq id no:31。
[0286]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区或第二靶区的至少两种扩增寡聚体包括冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体。
[0287]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区的冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体的第一靶杂交序列和第二靶杂交序列分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0288]
(a)seq id no:2和seq id no:4和seq id no:5；或
[0289]
(b)seq id no:2和seq id no:4和seq id no:6；或
[0290]
(c)seq id no:2和seq id no:5和seq id no:6；或
[0291]
(d)seq id no:4和seq id no:5和seq id no:6；或
[0292]
(e)seq id no:2和seq id no:4和seq id no:5和seq id no:6；或
[0293]
(f)seq id no:2和seq id no:23和seq id no:5；或
[0294]
(g)seq id no:2和seq id no:23和seq id no:6；或
[0295]
(h)seq id no:23和seq id no:5和seq id no:6；或
[0296]
(i)seq id no:2和seq id no:23和seq id no:5和seq id no:6；或
[0297]
(j)seq id no:4和seq id no:23和seq id no:5；或
no:25的互补物、seq id no:25的互补物的rna等同物或其dna/rna嵌合体。
[0318]
在一些实施方案中，检测探针靶杂交序列包含在seq id no:25的序列中，并且至少包括seq id no:13的序列。
[0319]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体包含seq id no:13或由seq id no:13组成。
[0320]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体包含长度为16至40个连续核苷酸，并与seq id no:17、seq id no:17的rna等同物、seq id no:17的互补物、seq id no:17的互补物的rna等同物或其dna/rna嵌合体特异性杂交的核苷酸序列。
[0321]
在一些实施方案中，至少一种检测探针寡聚体包含长度为约14至约40个核苷酸并与包含以下或由以下组成的靶序列杂交的靶杂交序列：seq id no:36、seq id no:36的dna等同物、seq id no:36的互补物、seq id no:36的互补物的dna等同物或seq id no:36的dna/rna嵌合体、或seq id no:43、seq id no:43的rna等同物、seq id no:43的互补物、seq id no:43的互补物的rna等同物或其dna/rna嵌合体。
[0322]
在一些实施方案中，检测探针靶杂交序列包含在seq id no:41的序列中，并且至少包括seq id no:36的序列。
[0323]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体包含seq id no:36或由seq id no:36组成。
[0324]
在一些实施方案中，至少一种检测探针寡聚体是分别包含seq id no:13和seq id no:36的至少两种不同的检测探针寡聚体。
[0325]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体以及检测探针寡聚体分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0326]
(a)seq id no:2和seq id no:5和seq id no:13；或
[0327]
(b)seq id no:2和seq id no:6；和seq id no:13；或
[0328]
(c)seq id no:4和seq id no:5；和seq id no:13；或
[0329]
(d)seq id no:4和seq id no:6和seq id no:13；或
[0330]
(e)seq id no:23和seq id no:5；和seq id no:13；或
[0331]
(f)seq id no:23和seq id no:6和seq id no:13。
[0332]
在一些实施方案中，用于扩增第二靶区的第一扩增寡聚体和第二扩增寡聚体以及检测探针寡聚体分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0333]
(a)seq id no:27和seq id no:30和seq id no:36；或
[0334]
(b)seq id no:27和seq id no:31；和seq id no:36；或
[0335]
(c)seq id no:29和seq id no:30；和seq id no:36；或
[0336]
(d)seq id no:29和seq id no:31；和seq id no:36。
[0337]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区和/或第二靶区的至少两种扩增寡聚体包括冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体和/或冗余的检测探针寡聚体。
[0338]
在一些实施方案中，用于扩增第一靶区和第二靶区的冗余的第一扩增寡聚体和/或冗余的第二扩增寡聚体和/或冗余的检测探针分别包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：
[0339]
(a)seq id no:2、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6和seq no:13，或
[0340]
(b)seq id no:2、seq id no:23、seq id no:5、seq id no:6和seq no:13，或
[0341]
(c)seq id no:4、seq id no:23、seq id no:5、seq id no:6和seq no:13，或
[0342]
(d)seq id no:27、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31和seq no:36，或
[0343]
(e)seq id no:2、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq no:13和seq no:36，或
[0344]
(f)seq id no:2、seq id no:23、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq no:13和seq no:36或
[0345]
(g)seq id no:4、seq id no:23、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq no:13和seq no:36。
[0346]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体还包含核苷酸序列的核苷酸残基成员中的至少一个上的2’甲氧基修饰。
[0347]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体包含选自由化学发光标记物、荧光标记物、猝灭剂及其一种或更多种的组合组成的组的标记物。
[0348]
在一些实施方案中，标记物是连接在检测探针寡聚体的两个核碱基之间的化学发光吖啶酯(ae)化合物。
[0349]
在一些实施方案中，组合还包括与检测探针寡聚体大体上互补的探针保护寡聚体。
[0350]
在另一方面，本发明提供了一种用于特异性检测样品中sars-cov-2靶核酸的检测探针寡聚体，所述检测探针寡聚体包含长度为约14至约40个核苷酸并被配置为与包含以下或由以下组成的靶序列特异性杂交的靶杂交序列：seq id no:13或seq id no:36、seq id no:13或seq id no:36的dna等同物、seq id no:13或seq id no:36的互补物、seq id no:13或seq id no:36的互补物的dna等同物、或seq id no:13或seq id no:36的dna/rna嵌合体、或seq id no:25或seq id no:43、seq id no:25或seq id no:43的rna等同物、seq id no:25或seq id no:43的互补物、seq id no:25或seq id no:43的互补物的rna等同物、或其dna/rna嵌合体。
[0351]
在一些实施方案中，检测探针靶杂交序列包含在seq id no:17或seq id no:41的序列中，并且至少包括seq id no:13或seq id no:36的序列。
[0352]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体包含长度为16至40个连续核苷酸，并与seq id no:17或seq id no:41、seq id no:17或seq id no:41的rna等同物、seq id no:17或seq id no:41的互补物、seq id no:17或seq id no:41的互补物的rna等同物或其dna/rna嵌合体特异性杂交的核苷酸序列。
[0353]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体还包含核苷酸序列的核苷酸残基成员中的至少一个上的2’甲氧基修饰。
[0354]
在一些实施方案中，检测探针寡聚体包含选自由化学发光标记物、荧光标记物、猝灭剂及其一种或更多种的组合组成的组的标记物。
[0355]
在一些实施方案中，标记物是连接在检测探针寡聚体的两个核碱基之间的化学发光吖啶酯(ae)化合物。
[0356]
在另一方面，本发明提供了一种用于从样品特异性分离sars-cov-2核酸的捕获探针寡聚体，所述捕获探针寡聚体包含与结合固定探针的序列或部分共价附接的靶杂交序列，其中所述靶杂交序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:9和seq id no:11组成的组或选自由seq id no:33和seq id no:35组成的组的序列。
[0357]
在一些实施方案中，捕获探针寡聚体序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10和seq id no:11组成的组或选自由seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35组成的组的序列。
[0358]
在一些实施方案中，捕获探针寡聚体序列包含以下或由以下组成：选自由seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10和seq id no:11组成的组的至少一种序列或选自由seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34和seq id no:35组成的组的至少一种序列。
[0359]
在另一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含上述寡聚体中的至少两种的组合。
[0360]
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含上述寡聚体中的至少两种的组合。
[0361]
在另一方面，本发明提供了一种反应混合物，该反应混合物包含上述寡聚体中的至少两种的组合。
[0362]
在另一个方面，本发明提供了上述寡聚体中的至少两种的组合用于特异性扩增样品中的sars-cov-2核酸的用途。
[0363]
在另一方面，本发明提供了上述检测探针寡聚体用于特异性检测样品中的sars-cov-2核酸的用途。
[0364]
在另一方面，本发明提供了上述捕获探针寡聚体用于从样品特异性捕获sars-cov-2核酸的用途。
[0365]
最后，本发明提供了一种用于诊断受试者的covid-19的方法，包括根据上述方法在来自所述受试者的样品中检测sars-cov-2的存在。
实施例
[0366]
sars-cov-2测定
[0367]
对于本文所述实施例中使用的sars-cov-2测定，鉴定表1中列出的寡聚体。
[0368]
测定试剂包括以下：靶捕获试剂(tcr)，包括表1中列出的两种捕获探针寡聚体(也称为“靶捕获寡聚物”或“tco”)；扩增试剂，包括表1中列出的t7启动子提供者和非t7引物；由吖啶酯(ae)标记的检测探针组成的探针试剂。还使用了酶试剂、选择试剂、阴性和阳性校准物及内部对照试剂。
[0369]“靶捕获试剂”一般是指含有许多有助于从溶液捕获核酸的组分的溶液。例如，靶捕获试剂可以包括hepes、氢氧化锂、氯化锂、edta、在ph 6.4和具有与之共价结合的dt
14
寡聚体的磁性颗粒。另一靶捕获试剂可包括hepes、氢氧化锂、lls、丁二酸、具有共价结合的dt
14
寡聚体。靶捕获试剂的其他制品也可以发挥同样的作用。
[0370]“扩增试剂”一般是指有助于扩增反应的反应组分的浓缩混合物。取决于诸如例如扩增类型(pcr、tma等)、靶核酸(gc含量)等因素，扩增试剂将包含各种浓度的多种不同试剂。引物可以添加到扩增试剂，或添加到与扩增试剂分离的扩增反应中。扩增试剂中的酶可以包括moloney鼠白血病病毒逆转录酶(mmlv-rt)和噬菌体t7 rna聚合酶中的一种或更多种，其单位在功能上定义为：1u mmlv-rt以200-400微摩尔寡聚dt引发的多(a)为模板，在37℃在10分钟内掺入1nmol dttp；并且1u t7 rna聚合酶以含有t7启动子的dna模板，在37℃在1小时内将1nmol atp掺入rna中。
[0371]“探针试剂”一般是指含有一种或更多种标记的检测探针的溶液。
[0372][0373]
表1.sars-cov-2测定的寡聚体。小写＝甲氧基rna；大写＝dna
[0374]
实施例1：灵敏度小组中sars-cov-2检测的sars-cov-2测定限值
[0375]
目的
[0376]
本研究的目的是评价sars-cov-2(scv2)测定在procleix panther系统上检测scv2 rna的分析灵敏度和检出限(lod)。
[0377]
材料和方法
[0378]
分析灵敏度小组由以下组成：来自bio-synthesis(lewisville,tx)的scv2体外转录物(ivt)、来自asuragen(austin，tx)的armored rna quant sars-cov-2对照以及来自seracare(milford，ma)的accuplex sars-cov-2阳性参考材料。
[0379]
由bio-synthesis合成了与来自genbank登录号mn908947的适当序列对应的ivt，并用uv吸光度在260nm进行了定量。将ivt小组在hepes去垢剂中连续稀释。
[0380]
armored rna quant sars-cov-2对照包含sars-cov-2病毒核衣壳(n)序列区。将armored rna小组在k2edta捐赠血浆中连续稀释，这些捐赠血浆从innovative research(novi,michigan)获得并从16名捐赠者汇集。
[0381]
来自seracare的accuplex sars-cov-2阳性参考材料由以下组成：蛋白包被的rna混合物，包括orf1a、rdrp、包膜和核衣壳区；分别地核苷酸417-1899、3094-3360、13291-13560、18577-19051、25801-28200、27952-29873。将accuplex小组在从innovative research(novi,michigan)获得并从16名捐赠者汇集的k2edta捐赠血浆中连续稀释，和在病毒运输培养基(viral transport medium，vtm)(hank平衡盐溶液，胎牛血清，fungizone)中连续稀释。将vtm中的稀释液在含hepes去垢剂的溶液中进一步1:1稀释。
[0382]
将在5.5ml单次使用等分试样中冷冻的分析灵敏度小组成员在临使用前在室温解冻。采用sas(gompertz model)系统软件9.4版(cary,nc)中的probit函数进行回归分析，计算95％和50％的检测水平概率。
[0383]
结果
[0384]
对含有rna的样品计算的平均相对光单位(rlu)和变异系数百分比(％cv)值仅来自反应结果(信号/截止值≥1.0)。计算阴性小组(negative panel)的平均闪光器rlu和％cv。
[0385]
体外转录物的检测：在100拷贝/ml时，sars-cov-2测定的平均rlu值为1,121,151rlu，并且在30拷贝/ml时，平均rlu值为1,121,996rlu。
[0386]
armored rna quant sars-cov-2对照的检测：在100拷贝/ml时，sars-cov-2测定的平均rlu值为991,549rlu，并且在30拷贝/ml时，平均rlu值为949,043rlu。
[0387]
accuplex sars-cov-2阳性参考材料的检测：在100拷贝/ml时，sars-cov-2测定的平均rlu值为1,057,173rlu，并且在30拷贝/ml时，平均rlu值为1,048,391rlu。
[0388]
在vtm中稀释的accuplex sars-cov-2阳性参考材料的检测：在200拷贝/ml时，sars-cov-2测定的平均rlu值为1,082,489rlu，并且在60拷贝/ml时，平均rlu值为1,061,625rlu。
[0389]
probit分析显示了由从测试获得的结果预测的以拷贝/ml计的50％和95％检出率。在panther上的sars-cov-2测定中，在含hepes去垢剂的溶液中稀释的体外转录物的95％检测概率为20.67拷贝/ml，95％基准限为14.26至37.34拷贝/ml。在panther上的sars-cov-2测定中，在血浆中稀释的armored rna quant sars-cov-2对照的95％检测概率为31.79拷贝/ml，95％基准限为21.90至56.82拷贝/ml。在panther上的sars-cov-2测定中，在血浆中稀释的accuplex sars-cov-2阳性参考材料的95％检测概率为17.90拷贝/ml，95％基准限为12.32至29.75拷贝/ml。在panther上的sars-cov-2测定中，在vtm中稀释的accuplex sars-cov-2阳性参考材料的95％检测概率为37.83拷贝/ml，95％基准限为28.45至56.08拷贝/ml。
[0390]
结论
[0391]
分析灵敏度研究表明了在含hepes去垢剂的溶液中的scv2 ivt、在血浆中的armored rna、在血浆中的accuplex材料和在vtm中的accuplex材料的灵敏的检测。在panther上的sars-cov-2测定中，对于在含hepes去垢剂的溶液中稀释的体外转录物，probit分析给出的95％检测为20.67拷贝/ml。在panther上的sars-cov-2测定中，对于在血浆中稀释的armored rna quant sars-cov-2对照，probit分析给出的95％检测为31.79拷贝/ml。在panther上的sars-cov-2测定中，对于在血浆中稀释的accuplex sars-cov-2阳性参考材料，probit分析给出的95％检测为17.90拷贝/ml。在panther上的sars-cov-2测定中，对于在vtm中稀释的accuplex sars-cov-2阳性参考材料，probit分析给出的95％检测为37.83拷贝/ml。
[0392]
实施例2：通过计算机模拟分析包容性和交叉反应性
[0393]
目的
[0394]
本研究的目的是使用计算机模拟分析寡聚物设计来确定sars-cov-2测定的包容性和交叉反应性。
[0395]
材料和方法
[0396]
用以下方法评价包容性：计算机模拟分析gisaid和genbank数据库中可得的有关sars-cov-2(scv2)序列的测定引物和探针(表1)。通过与多个序列比对的直接比较，评估引
物和探针与公开可获得的包含预定靶区域的序列的保守性。
[0397]
交叉反应性分析采用blast搜索ncbi数据库中针对呼吸道样本中观察到的常见病原体和血源性病原体的引物进行。核苷酸集合由genbank+embl+ddbj+pdb+refseq序列组成，但不包括est、sts、gss、wgs、tsa、专利序列以及0、1和2相htgs序列和大于100mb的序列。数据库是非冗余的。相同的序列被合并到一个条目中，同时保留每个条目的登录、gi、标题和分类学信息。对于短输入序列自动调整搜索参数，并且期望阈值为1000；5)匹配和不匹配得分分别为1和-3；6)比对中产生和扩大空位的罚分分别为5和2。
[0398]
结果
[0399]
包容性(分析灵敏度)：
[0400]
用以下方法评价包容性：计算机模拟分析与gisaid中可用的sars-cov-2序列相关的测定引物和探针(截至2020年3月底，有约1700个相关序列)。通过与多个序列比对的直接比较，评估引物和探针与公开可获得的包含预定靶区域的序列的保守性。100％匹配的序列百分比总结在表2中。
[0401]
表2.测定中每种寡聚物100％匹配的百分比
[0402][0403][0404]
每个捕获探针寡聚体、正向引物(t7-引物扩增寡聚体)、检测探针寡聚体和反向引物(非t7扩增寡聚体)的冗余引物策略降低了突变的风险。
[0405]
同时，高亲和力的替代碱基被用于靶向捕获寡核苷酸和探针，以产生具有增强的杂交特性的寡核苷酸主链。这种类型的寡核苷酸能够检测微小的病毒变体，而不失去灵敏度或特异性。
[0406]
基于此分析和应用于procleix产品和此测定的策略，对于本系统中包括的寡核苷酸不太可能发生假阴性结果。
[0407]
交叉反应性(分析特异性)
[0408]
使用blast搜索ncbi数据库中针对fda eua预提交过程(计算机模拟)指南(表3中列出)要求的生物体和其他血源性病原体的引物进行计算机模拟交叉反应性分析。blast搜索没有发现任何交叉反应，除了sars冠状病毒之外，sars冠状病毒与sars-cov-2病毒属于同一亚属(沙贝病毒亚属(sarbecovirus))。与sars冠状病毒(nc_004718)基因组序列相比，nt7引物存在90％同源性，并且t7引物存在90％同源性，以及探针存在72％同源性。因此，不太可能与sars冠状病毒发生交叉反应。
[0409]
为了评价与sars冠状病毒和其他相关沙贝病毒亚属病毒的交叉反应性，将来自这些生物体的纯化核酸掺入缓冲液基质中，并用sars-cov-2测定进行测试。初步测试未观察到与这些沙贝病毒亚属病毒的交叉反应性。
[0410]
表3.交叉反应微生物
[0411][0412][0413]
来自同一遗传家族病原体的互补湿法测试
[0414]
将从来自从同一遗传家族的一些病原体纯化的基因组rna掺入缓冲溶液中，在panther仪器上使用sars-cov-2测定来测试。结果总结于表4。初步湿法测试未观察到交叉反应性。
[0415]
表4.与密切相关冠状病毒的交叉反应性
[0416]
病原体pnrna浓度结果人类冠状病毒oc43vr-1558dq≥1x1e5c/ml无交叉反应性人类冠状病毒hku1vr-3262sd1e5-1e6c/ml无交叉反应性人类冠状病毒nl63atcc 3263sd1e5-1e6c/ml无交叉反应性人类冠状病毒229eatcc vr-740dq≥1x1e5c/ml无交叉反应性sars-cov frankfurt 1sars-cov1e41e5c/ml无交叉反应性mers-cov rnavr-3248sd1e5-1e6c/ml无交叉反应性
[0417]
结论
[0418]
计算机模拟分析sars-cov-2测定设计和测定中应用的策略(冗余引物和更高亲和力寡核苷酸)的包容性表明足够的分析灵敏度。对于本测定中包括的测定设计，假阴性结果不太可能发生。
[0419]
计算机模拟分析交叉反应性和与密切相关冠状病毒的互补湿法测试显示了足够的分析特异性。对于本测定中包括的测定设计，假阳性结果不太可能发生。
[0420]
实施例3：正常献血者血浆样本中sars-cov-2测定特异性
[0421]
目的
[0422]
本研究的目的是确定procleix panther系统上sars-cov-2测定的特异性。测试了正常献血者血浆和血清样本。
[0423]
材料和方法
[0424]
来自阴性正常献血者的样本由grifols diagnostic solutions inc.从seracare(milford,ma)和promeddx(norton,ma)以及charlotte,nc的creative testing solutions(cts)获得。根据血液中心的标准方案，所有样本由获得它们的供应商的血液中心使用许可的血清学和核酸测试(nat)测定进行预筛查。
[0425]
冷冻样本在测试当天在室温解冻。
[0426]
结果以信号比截止(s/co)值表示。如果分析物s/co大于或等于1.0，则样品被认为是“反应性”(阳性)的。如果分析物s/co《1.0且内部对照(ic)s/co》1.0，则样品被认为是“非反应性”(阴性)的。对于分析物s/co和ic s/co都《1.0的任何样品，该样品被认为“无效”。分析物和ic截止值由测定软件根据每次运行中包括的阴性和阳性校准物确定。
[0427]
真阴性(tn)定义为在sars-cov-2测定中给出有效的非反应性结果的所有阴性样本。重新测试初始反应性(ir)样品。假阳性(fp)被定义为在sars-cov-2测定中为ir，但在随后的任何试验中没有重复反应性(rr)的样本。真阳性(tp)定义为在sars-cov-2测定中为rr的样本。如下计算特异性：
[0428]
特异性＝100x[#tn/(#tn+#fp)]
[0429]
95％置信区间(ci)采用score method(sas版本9.4)计算。
[0430]
结果
[0431]
用sars-cov-2测定测试了共2332例正常献血者样本。sars-cov-2测定因测定化学错误的初始无效率为0.04％(1/2407)。sars-cov-2测定的总特异性为99.7％(2326/2332)，95％置信区间较低，为99.4％。
[0432]
实施例4：sars-cov-2核衣壳(n)区的检测
[0433]
目的
[0434]
本研究的目的是使用针对其核衣壳(n)基因区域的不同扩增寡聚体评价sars-cov-2测定的反应性。
[0435]
实验设置如下表5所示，并且所用的捕获和检测探针及扩增寡聚体的序列如表6所示：
[0436]
表5.实验设置
[0437]
实验捕获探针扩增寡聚体检测探针amp 01cvtc01&2cvnt02&3_cvt7a04&01cvp05&6amp 02cvtc01&2cvnt02&3_cvt7a04&06cvp05&6amp03cvtc01&2cvnt01&3_cvt7a04&01cvp05&6
[0438]
表6.捕获和检测探针以及扩增寡聚体的序列和seq id no。
[0439][0440]
材料和方法
[0441]
在手动procleix系统上使用sars-cov-2体外转录物(ivt)使用转录介导的扩增(tma)进行初始引物筛选。测定机架(rack)由10排10管单元(ttu)组成。将400微升(400μl)的靶捕获试剂(上面概述的合适试剂)和5皮摩尔的每种靶捕获寡核苷酸加入机架上的适当管中，使得扩增寡聚体的每个组合在001、005、020和100拷贝/反应以10个阴性对照重复和10个sars-cov-2ivt重复进行测试。将样品/tcr组合涡旋20秒，在60
±
1℃孵育2分钟，在室温孵育15分钟，并置于靶捕获站(tcs)试管托架10分钟。从试管中取出液体，并加入1ml洗涤液。将管涡旋20秒，并放回tcs试管托架5分钟。重复抽吸/洗涤/保持步骤。抽吸最后的洗涤缓冲液，并从tcs试管托架移除管。将75微升(75μl)扩增试剂和5皮摩尔的每种t7启动子提供者寡核苷酸和非t7引物寡核苷酸加到适当的试管中，向每个管中加入200μl油，并且然后用密封卡覆盖机架并涡旋至少20秒。
[0442]
然后将机架在60
±
1℃的水浴中孵育10
±
1分钟，然后在41.5
±
1℃的水浴中孵育20分钟。当机架保持在水浴中时，移除密封卡，并在每个反应管中添加25μl商购可得的procleix酶试剂(grifols diagnostic solutions inc.)，然后再次用密封卡覆盖。轻轻摇动支架使其混合，并且然后再次用密封卡覆盖，并在41.5
±
1℃的水浴中再孵育60
±
5分钟。
[0443]
孵育完成后，将机架转移到杂交保护测定(hpa)区，在那里移除密封卡。100μl由吖啶酯(ae)标记的探针组成的探针试剂以每个反应至少2.5e6相对光单位(rlu)的总期望浓度添加到杂交试剂中。然后将探针试剂加入适当的反应管中。用密封卡覆盖管，并且涡旋机架至少20秒，然后将机架在61
±
2℃的水浴中孵育15
±
1分钟。
[0444]
从水浴中取出机架，移除密封卡，并在每个管中添加250μl商购可得的procleix选择试剂(grifols diagnostic solutions inc.)。用密封卡覆盖管并涡旋至少20秒，并且然后回到61
±
2℃水浴中并孵育10
±
1分钟。孵育后，允许机架在23
±
4℃的水浴中冷却至少10分钟。
[0445]
为了检测，将ttu从机架上取出并加载到自动引导仪上，然后使用商购可得的procleix auto detect 1和2试剂(grifols diagnostic solutions inc.)关闭光，并将结果导出，分析以相对光单位(rlu)计的信号。
[0446]
结果
[0447]
对于dna的不同拷贝数(1、5、20和100拷贝)，基于rlu高于阴性对照的背景rlu的重复数，测量反应性百分比(％)。结果在表7中示出。
[0448]
表7.每个实验的反应性(％)
[0449][0450][0451]
在本实验中，所有组合在020拷贝/反应及以上表现出100％检测的良好反应性。amp03在阴性对照中显示10％的反应性。
[0452]
实施例5：sars-cov-2刺突(s)区的检测
[0453]
目的
[0454]
本研究的目的是使用针对其刺突(s)基因区域的不同扩增寡聚体评价sars-cov-2测定的反应性。
[0455]
实验设置如下表8所示，并且所用捕获和检测探针及扩增寡聚体的序列如表9所示：
[0456]
表8.实验设置
[0457]
系统捕获探针扩增寡聚体检测探针acvstc01&3cvnt7s01&3_cvt7s04&05cvsp01&3bcvstc01&3cvnt7s01&3_cvt7s03&05cvsp01&3ccvstc01&3cvnt7s02&3_cvt7s04&05cvsp01&3
[0458]
表9.捕获和检测探针以及扩增寡聚体的序列和seq id no。
[0459][0460]
材料和方法
[0461]
材料和方法与对实施例4描述的相同。
[0462]
结果
[0463]
如表10所示，所有系统在020拷贝/反应及以上时显示100％的反应性。系统a表现最好，在低至001拷贝/反应时有50％的反应性，并且在005拷贝/反应及以上的平均rlu值有1％至3％的变异系数(％cv)，显示出用于检测低sars-cov-2rna检测的稳健和一致的信号。
[0464]
表10.实施例5实验中测试的每个组合的结果。
[0465]
[0466][0467][0468][0469]
n：有效的数量，#：数量，r：反应性，rlu：相对光单位，sd：标准差，cv：变异系数
[0470]
序列
[0471]
[0472][0473]
注意，扩增子和部分扩增子序列在本文被图示为dna，然而，本领域技术人员理解，取决于扩增循环中的阶段，在tma反应期间产生的扩增产物是rna或dna。在本文提供dna命名只是为了方便，而不是限制。