技术特征：
1.一种使用洗涤剂从流感病毒中纯化表面抗原蛋白的方法，其中用于处理被采样的流感病毒的洗涤剂处理浓度由通过测定被采样的流感病毒每单位剂量的总蛋白定量值(tpqv)并随后将总蛋白定量数值代入如下所示的等式1而获得的值确定：[等式1]洗涤剂处理浓度＝[{(a*tpqv(μg/ml))/(bμg/ml)}/c.*d(其中，a为0.005％(v/v)至0.100％(v/v)，b为100、200、300、400、500、600、700、800或900，并且选择最接近tpqv的值，c为用于处理的洗涤剂母液浓度(％(v/v))，d为待用洗涤剂处理的被采样的流感病毒的剂量)。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤剂处理浓度是用于在病毒核心未被破坏的状态或病毒核心的破坏最小化的状态下选择性地仅分离表面抗原的浓度。3.根据权利要求1所述的方法，其中在确定洗涤剂处理浓度时，不需要通过srid(单向辐射状免疫扩散)对样品中血凝素(ha)蛋白的量进行定量。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤剂是阳离子洗涤剂。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述阳离子洗涤剂是ctab(十六烷基三甲基溴化铵)。6.根据权利要求1所述的方法，其中总蛋白定量值(tpqv)通过bca测定、lowry测定或bradford测定获得。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述被采样的流感病毒通过包括以下步骤的方法获得：(a)在一次性生物反应器(sub)中培养细胞；(b)使用使用一次性袋的低速连续离心机将步骤(a)的细胞培养液中的一部分培养基更换为新鲜培养基；(c)用流感病毒感染繁殖的细胞，并在允许流感病毒复制的条件下培养细胞；和(d)从步骤(c)的培养物中分离流感病毒。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞是madin
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darby犬肾(mdck)细胞。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基通过一种方法进行更换，在所述方法中，使用低速连续离心机将细胞和培养基彼此连续分离，丢弃一部分培养基，并在步骤(b)中将新培养基引入细胞培养箱中，而不需要回收和重新引入全部培养液的过程。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述一部分培养基是整个培养液的50％至80％。11.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(d)的执行包括以下步骤：(d-1)基于对通过在不同条件下纯化以从步骤c)的培养物中纯化流感病毒而获得的流感病毒样品的血凝测定来确定纯化条件；和(d-2)根据步骤(d-1)中确定的条件从步骤(c)的培养物中纯化流感病毒。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述被采样的流感病毒每单位剂量的总蛋白定量值为50μg/ml至950μg/ml。13.一种用于快速确认流感抗原纯化条件的测试方法，该方法包括以下第一纯化条件确定方法和第二纯化条件确定方法：
第一纯化条件确定方法，其用于从流感病毒培养物中纯化流感病毒的步骤中，并且其中基于在不同条件下纯化获得的流感病毒样品的血凝试验、sds-page或其组合来确定流感病毒的纯化条件；以及第二纯化条件确定方法，其用于使用洗涤剂从流感病毒纯化表面抗原蛋白的步骤中，并且其中基于流感病毒样品的总蛋白定量测定来确定表面抗原蛋白纯化期间的洗涤剂处理浓度。14.权利要求13所述的方法，其中用于快速确认流感抗原纯化条件的测试方法不需要通过srid(单向辐射状免疫扩散)对流感病毒中血凝素(ha)蛋白的量进行定量处理。15.根据权利要求13所述的方法，其中通过色谱进行从流感病毒培养物中纯化流感病毒的步骤。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述色谱使用填充有硫酸纤维素(cs)的色谱仪进行。17.根据权利要求13所述的方法，其中所述条件包括缓冲液类型、缓冲液浓度、ph和电导率。18.根据权利要求13所述的方法，其中所述条件是电导率。19.根据权利要求13所述的方法，其中在所述第二纯化条件确定方法中，所述洗涤剂处理浓度由通过测定所述第一纯化获得的流感病毒培养物的每单位剂量的总蛋白定量值(tpqv)，然后将总蛋白定量值代入以下等式1获得的值来确定：[等式1]洗涤剂处理浓度＝[{(a*tpqv(μg/ml))/(bμg/ml)}/c]*d(其中，a为0.005％(v/v)至0.100％(v/v)，b为100、200、300、400、500、600、700、800或900，并选择最接近tpqv的值，c为用于处理的洗涤剂母液浓度(％(vv/v))，d为待用洗涤剂处理的流感病毒培养物的剂量)。20.一种疫苗生产方法，包括从流感病毒中纯化表面抗原蛋白，其中所述步骤是在使用洗涤剂进行处理的条件下进行的，所述洗涤剂的值是通过测定每单位剂量采样流感病毒的总蛋白定量值(tpqv)，然后将总蛋白定量值代入以下等式1获得的值确定的：[等式1]洗涤剂处理浓度＝[{(a*tpqv(μg/ml))/(bμg/ml)}/c]*d(其中，a为0.005％(v/v)至0.100％(v/v)，b为100、200、300、400、500、600、700、800或900，并且选择最接近tpqv的值，c为用于处理的洗涤剂母液浓度(％(v/v))，d为待用洗涤剂处理的采样流感病毒的剂量)。d为待用洗涤剂处理的采样流感病毒的剂量)。21.一种快速纯化流感表面抗原的方法，所述方法包括以下步骤：a)用流感病毒感染细胞并培养该细胞以获得病毒培养物；b)基于血凝试验、sds-page或其组合确定通过在不同条件下纯化获得的流感病毒样品
的纯化条件，以从步骤a)的培养物中纯化流感病毒；c)根据步骤b)中确定的条件从步骤a)的培养物中纯化流感病毒；d)基于流感病毒的总蛋白定量测定来确定表面抗原蛋白纯化期间的洗涤剂处理浓度，以从步骤c)中纯化的流感病毒中纯化表面抗原；和e)通过根据步骤d)中确定的条件进行洗涤剂处理，从流感病毒中纯化表面抗原蛋白。22.根据权利要求21所述的方法，其中用于快速纯化流感表面抗原的方法进一步包括在步骤b)之前从病毒培养物中去除细胞和细胞碎片。23.根据权利要求22所述的方法，其中通过一种或多种选自过滤、透析和离心的方法从病毒培养物中去除细胞和细胞碎片。24.根据权利要求21所述的方法，其中所述用于快速纯化流感表面抗原的方法包括在步骤c)之后通过一种或多种选自超滤和渗滤的方法的附加纯化过程。25.根据权利要求21所述的方法，其中通过进行洗涤剂处理，然后进行离心，并在步骤e)中回收上清液来分离所述表面抗原蛋白。26.根据权利要求21所述的方法，其中所述快速纯化流感表面抗原的方法进一步包括步骤e)之后的洗涤剂去除过程。27.根据权利要求21所述的方法，其中所述快速纯化流感表面抗原的方法包括用于在步骤e)之后去除杂质的附加色谱。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述色谱是tmae(三甲基氨基乙基)阴离子交换色谱。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述快速纯化流感表面抗原的方法包括通过一种或多种选自超滤和色谱后渗滤的方法的附加纯化过程。30.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，在一次性生物反应器(sub)中培养步骤a)中的拟用于病毒感染的细胞或步骤a)中的感染了病毒的细胞。31.根据权利要求21所述的方法，其中在步骤a)中用病毒感染细胞之前，通过低速连续离心机将细胞培养物中拟用于病毒感染的一部分培养基更换为新鲜培养基。32.根据权利要求21所述的方法，其中所述快速纯化流感表面抗原的方法进一步包括在步骤c)之后用全能核酸酶、核酸外切酶、核酶或其混合物处理的方法。33.根据权利要求21的方法，其中用于快速纯化流感表面抗原的方法进一步包括步骤c)后的病毒灭活过程。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述病毒灭活是通过用洗涤剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(c60)、仲乙胺、乙酰基亚乙基胺或其组合进行处理来进行的。
技术总结
本发明涉及一种使用一次性培养过程系统的流感病毒生产方法，以及用于快速检查流感病毒抗原纯化条件的测试。根据本发明，可以根据本发明的独特方法快速可靠地检查流感表面抗原获得(纯化)的条件，即使不使用常规用作流感疫苗生产时标准测试方法的单一辐射状免疫扩散技术，因此，流感表面抗原亚单位疫苗的生产时间显著缩短，从而实现快速疫苗研发/生产的快速反应，即使是在快速的新型流感大流行现场。此外，根据本发明的流感病毒生产方法，培养基更换可以通过使用使用一次性袋的连续低速离心机在气密系统中进行，因此可以大大降低病毒生产过程中发生污染的可能性。毒生产过程中发生污染的可能性。毒生产过程中发生污染的可能性。
技术研发人员：郑桓义 金允熙 金勋 朴容郁
受保护的技术使用者：爱思开生物科技有限公司
技术研发日：2021.04.07
技术公布日：2023/2/3