多特异性蛋白质1.相关专利申请的交叉引用2.本技术要求2020年5月14日向欧洲专利局提交的欧洲专利申请ep20174847和2020年6月22日向欧洲专利局提交的欧洲专利申请ep20181498的权益和优先权。欧洲专利申请ep20174847和ep20181498的内容全文以引用方式并入本文，包括所有表格、图和权利要求。
技术领域：
：3.本发明涉及包含经设计的锚蛋白重复结构域的多特异性蛋白质，所述锚蛋白重复结构域具有针对不同靶标诸如cd40和fap的结合特异性。此外，本发明涉及编码此类多特异性蛋白质的核酸、包含此类多特异性蛋白质或核酸的药物组合物，以及此类结合蛋白、核酸或药物组合物在用于治疗或诊断包括人在内的哺乳动物的疾病诸如癌症的方法中的用途。
背景技术：
：：4.肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员cd40是关键的共刺激受体，当与其配体(cd40l)或激动性抗体接合时，它参与广泛的分子和细胞过程的调节，包括细胞和体液适应性免疫的起始和进展。例如，已经证明cd40在树突状细胞表面上的接合促进它们的细胞因子产生、诱导共刺激分子在它们的表面上的表达并且促进抗原的呈递。总体而言，cd40信号传导的影响“许可”树突状细胞成熟并实现所有必要特征，以有效地触发t细胞活化和分化。b细胞中的cd40信号传导促进生发中心形成、免疫球蛋白(ig)同种型转换、ig的体细胞超突变以增强对抗原的亲和力以及最后长寿浆细胞和记忆b细胞的形成。此外，已经表明，cd40途径对于许多细胞类型(包括生发中心b细胞、树突状细胞和内皮细胞)在正常和炎性条件下的存活是很重要的。已经在各种自身免疫疾病中观察到cd40信号传导的失调。总之，这种广泛的功能强调了cd40受体对于生成获得性免疫反应的重要性。5.cd40最初在b细胞上表征，也在树突状细胞、单核细胞、血小板和巨噬细胞以及非造血细胞(诸如肌成纤维细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞)上表达。cd40的配体(称为cd154或cd40l)主要由活化的t细胞以及活化的b细胞和血小板表达，并且在炎性条件下，它也在单核细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞中诱导。6.因为cd40可以激活先天性和适应性免疫系统，所以它已被公认为肿瘤免疫疗法的合适靶标。一些报道已经证实，cd40刺激可以借助于树突状细胞成熟来增强抗肿瘤免疫反应。用cd40的激动剂活化树突状细胞使得它们的存活增加，il-1、il-6、il-8、il-12、tnf-α和巨噬细胞炎性蛋白-1α分泌。另外，cd40活化诱导共刺激分子(诸如mhcii类、lfa-3、cd80和cd86)的上调，并且分别促进t辅助细胞(th)和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的抗原呈递、致敏和交叉致敏。已经证明抗cd40的激动性抗体在临床前鼠肿瘤模型中是有效的。然而，尽管它们在临床中的使用已经显示出一些抗肿瘤功效，但激动性抗cd40抗体的临床开发可能受到剂量限制性毒性和由此产生的低功效的阻碍。7.因此，仍然需要新的cd40特异性结合蛋白，以及用于治疗和表征受益于cd40特异性结合和活化的疾病(包括癌症)的治疗和诊断方法。具体地，需要可有效地接合cd40同时避免不期望的副作用的新一代激动剂。技术实现要素：8.基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到或仅能够使用常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下实施方案(e)涵盖。9.e1.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含特异性结合成纤维细胞活化蛋白(fap)的第一锚蛋白重复结构域和特异性结合cd40的第二锚蛋白重复结构域。10.e2.根据e1所述的重组蛋白质，该重组蛋白质还包含特异性结合cd40的第三锚蛋白重复结构域。11.e3.根据e2所述的重组蛋白质，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从n末端到c末端排列：(fap结合结构域)–(cd40结合结构域)–(cd40结合结构域)。12.e4根据e1至e3中任一项所述的重组蛋白质，该重组蛋白质还包含半衰期延长部分。13.e5.根据e4所述的重组蛋白质，其中所述半衰期延长部分包含特异性结合血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域。14.e6.根据e5所述的重组蛋白质，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从n末端到c末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(fap结合结构域)–(cd40结合结构域)–(cd40结合结构域)。15.e7.根据e1至e6中任一项所述的重组蛋白质，该重组蛋白质还包含介于任何所述fap结合结构域、所述cd40结合结构域和所述半衰期延长部分之间的接头。16.e8.根据e1至e7中任一项所述的重组蛋白质，该重组蛋白质从n末端到c末端包含下式：(fap结合结构域)–(接头)–(cd40结合结构域)–(接头)–(cd40结合结构域)。17.e9.根据e1至e8中任一项所述的重组蛋白质，该重组蛋白质从n末端到c末端包含下式：(血清白蛋白结合结构域)–(接头)–(fap结合结构域)–(接头)–(cd40结合结构域)–(接头)–(cd40结合结构域)。18.e10.根据e4所述的重组蛋白质，其中所述半衰期延长部分包含免疫球蛋白重链恒定结构域。19.e11.根据e10所述的重组蛋白质，其中所述免疫球蛋白结构域是iga1、iga2、igd、ige、igm、igg1、igg2、igg3或igg4免疫球蛋白的fc结构域。20.e12.根据e11所述的重组蛋白质，其中所述fc结构域是人igg1免疫球蛋白的fc结构域。21.e13.根据e12所述的重组蛋白质，其中所述fc结构域被修饰以降低效应子功能。22.e14.根据e1至e13中任一项所述的重组蛋白质，其中所述fap是人fap。23.e15.根据e1至e14中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40是人cd40。24.e16.根据e5至e19中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白是人血清白蛋白(hsa)。25.e17.根据e10至e13中任一项所述的重组蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链恒定结构域是人免疫球蛋白重链恒定结构域。26.e18.根据e1至e17中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质与fap的结合不会使fap的蛋白酶活性降低超过25％、超过20％、超过15％、超过10％或超过5％。27.e19.根据e1至e18中任一项所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含与seqidno:2具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，seqidno:2的倒数第二位置处的a被l取代并且/或者seqidno:2的最后位置处的a被n取代。28.e20.根据e19所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含seqidno:2的氨基酸序列。29.e21.根据e1至e18中任一项所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含与seqidno:8具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，seqidno:2的倒数第二位置处的a被l取代并且/或者seqidno:8的最后位置处的a被n取代。30.e22.根据e21所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含seqidno:8的氨基酸序列。31.e23.根据e1至e18中任一项所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含与seqidno:9和28至38中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。32.e24.根据e23所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含seqidno:9和28至38中的任一者的氨基酸序列。33.e25.根据e23所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含与seqidno:9、28至31和38中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。34.e26.根据e25所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含与seqidno:28具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。35.e27.根据e23所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含与seqidno:32至37中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的l被a取代并且/或者最后位置处的n被a取代。36.e28.根据e27所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含与seqidno:34具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的l被a取代并且/或者最后位置处的n被a取代。37.e29.根据e1至e28中任一项所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域(i)包含与seqidno:2、8、9和28至37中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且(ii)在其n末端还包含g、s或gs。38.e30.根据e1至e29中任一项所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含与seqidno:2、8、9和28至37中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。39.e31.根据e1至e30中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，seqidno:3的倒数第二位置处的a被l取代并且/或者seqidno:3的最后位置处的a被n取代。40.e32.根据e1至e31中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含seqidno:3的氨基酸序列。41.e33.根据e1至e30中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:10和43至50中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。42.e34.根据e1至e30和e33中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含seqidno:10和43至50中的任一者的氨基酸序列。43.e35.根据e1至e30和e33中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:10、43、44和48至50中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。44.e36.根据e35所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:43具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。45.e37.根据e1至e30和e33中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:45至47中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的l被a取代并且/或者最后位置处的n被a取代。46.e38.根据e37所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:47具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的l被a取代并且/或者最后位置处的n被a取代。47.e39.根据e1至e38中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地(i)包含与seqidno:3、10和43至49中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且(ii)在其n末端还包含g、s或gs。48.e40.根据e1至e39中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3、10和43至49中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。49.e41.根据e1至e40中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和/或位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。50.e42.根据e1至e41中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。51.e43.根据e1至e42中任一项所述的重组蛋白质，其中：52.(a)所述fap结合结构域包含与seqidno:2、8、9和28至37中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其中其n末端还任选地包含g、s或gs；其中其n末端还任选地包含g、s或gs；并且其中倒数第二位置可以是l或a，并且最后位置可以是n或a；以及53.(b)所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3、10和43至49中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少no:41的最后位置处的n被a取代。66.e50.根据e5至e9、e14至e16、e18至e45和e49中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域包含seqidno:39至42中的任一者的氨基酸序列。67.e51.根据e5至e9、e14至e16和e18至e50中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域(i)包含与seqidno:1和39至41中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，或者(ii)包含与seqidno:42具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。68.e52.根据e5至e9、e14至e16和e18至e51中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域包含(i)与seqidno:1和39至41中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，或者(ii)包含与seqidno:42具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。69.e53.根据e5至e9、e14至e16和e18至e52中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域包含(i)seqidno:1和39至41中的任一者的氨基酸序列，或者(ii)包含seqidno:42的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。70.e54.根据e8至e53中任一项所述的重组蛋白质，其中所述接头包含seqidno:4的氨基酸序列。71.e55.根据e1至e54中任一项所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质包含恰好四个锚蛋白重复结构域。72.e56.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含与seqidno:5或seqidno:6或seqidno:7具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中所述蛋白质特异性结合fap和cd40。73.e57.根据e56所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质包含与seqidno:5具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。74.e58.根据e56至e57中任一项所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列。75.e59.根据e56至e58中任一项所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质包含seqidno:5的氨基酸序列。76.e60.根据e56所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质包含与seqidno:6具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。77.e61.根据e56或e60所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质包含与seqidno:6具有至少90％同一性的氨基酸序列。78.e62.根据e56和e60至e61中任一项所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质包含seqidno:6的氨基酸序列。79.e63.根据e56至e62中任一项所述的重组蛋白质，其中所述fap是人fap。80.e64.根据e56至e63中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40是人cd40。81.e65.根据e1至e64中任一项所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域以等于或低于以下的kd值结合人fap：100nm、90nm、80nm、75nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、2nm、1nm、900pm、800pm、700pm、600pm、500pm、400pm、300pm、250pm、200pm、150pm、140pm、130pm或120pm。82.e66.根据e1至e65中任一项所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域以等于或低于100nm的kd值结合人fap。83.e67.根据e1至e66中任一项所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域以等于或低于1nm的kd值结合人fap。84.e68.根据e1至e67中任一项所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域以等于或低于120pm的kd值结合人fap。85.e69.根据e1至e68中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地以等于或低于以下的kd值结合人cd40：100nm、90nm、80nm或75nm。86.e70.根据e1至e69中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地以等于或低于100nm的kd值结合人cd40。87.e71.根据e1至e70中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地以等于或低于75nm的kd值结合人cd40。88.e72.根据e1至e71中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域以等于或低于以下的kd值结合人血清白蛋白：100nm、90nm、80nm、75nm、70nm、60nm、50nm、40nm或35nm。89.e73.根据e1至e72中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域以等于或低于100nm的kd值结合人血清白蛋白。90.e74.根据e1至e73中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域以等于或低于50nm的kd值结合人血清白蛋白。91.e75.根据e1至e74中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域以等于或低于35nm的kd值结合人血清白蛋白。92.e76.根据e1至e75中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于以下的kd值结合人fap：100nm、90nm、80nm、75nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、2nm、1nm、900pm、800pm、700pm、600pm、500pm、400pm或300pm。93.e77.根据e1至e76中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于100nm的kd值结合人fap。94.e78.根据e1至e77中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于1nm的kd值结合人fap。95.e79.根据e1至e78中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于500pm的kd值结合人fap。96.e80.根据e1至e79中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于300pm的kd值结合人fap。97.e81.根据e1至e80中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于以下的kd值结合人cd40：100nm、90nm、80nm、75nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、2nm、1nm、900pm、800pm、700pm、600pm、500pm、400pm、300pm、250pm、200pm、150pm、140pm、130pm、120pm、115pm、110pm、105pm或100pm。98.e82.根据e1至e81中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于100nm的kd值结合人cd40。99.e83.根据e1至e82中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于1nm的kd值结合人cd40。100.e84.根据e1至e83中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于500pm的kd值结合人cd40。101.e85.根据e1至e84中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于100pm的kd值结合人cd40。102.e86.根据e1至e85中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于以下的kd值结合人血清白蛋白：100nm、90nm、80nm、75nm、70nm、60nm或50nm。103.e87.根据e1至e86中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于100nm的kd值结合人血清白蛋白。104.e88.根据e1至e87中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于75nm的kd值结合人血清白蛋白。105.e89.根据e1至e88中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以等于或低于50nm的kd值结合人血清白蛋白。106.e90.根据e65至e89中任一项所述的重组蛋白质，其中所述kd在pbs中通过表面等离振子共振(spr)测量。107.e91.根据e90所述的重组蛋白质，其中所述kd使用biacoret200仪器测量。108.e92.根据e65至e89中任一项所述的重组蛋白质，其中所述kd通过生物层干涉测量法(bli)测量。109.e93.根据e92所述的重组蛋白质，其中所述kd使用fortebiooctet仪器测量。110.e94.根据e1至e93中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质具有如通过体外b细胞活化测定所评估的不超过约100nm、不超过约75nm、不超过约65nm、不超过约55nm、不超过约45nm、不超过约35nm、不超过约25nm、不超过约15nm、不超过约10nm、不超过约5nm、不超过约4nm、不超过约3nm、不超过约2nm、不超过约1nm、不超过约0.1nm、约0.01nm至约50nm、约0.01nm至约25nm、约0.01nm至约10nm、约0.01nm至约5nm、约0.01nm至约1nm、约0.01nm至约0.1nm、约0.01nm至约0.07nm、约0.04nm至约50nm、约0.04nm至约25nm、约0.04nm至约10nm、约0.04nm至约5nm、约0.04nm至约1nm、约0.04nm至约0.1nm、约0.04nm至约0.07nm、约0.1nm至约50nm、约0.1nm至约25nm、约0.1nm至约10nm、约0.1nm至约5nm、约0.1nm至约1nm、约0.1nm至约0.9nm、约0.1nm至约0.85nm、约0.18nm至约0.85nm的半最大有效浓度(ec50)。111.e95.根据e1至e94中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质具有如通过体外b细胞活化测定所评估的不超过约10nm的ec50。112.e96.根据e1至e95中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质具有如通过体外b细胞活化测定所评估的不超过约1nm的ec50。113.e97.根据e1至e96中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质具有如通过体外b细胞活化测定所评估的约0.1nm至约1nm、优选地约0.18nm至约0.85nm的ec50。114.e98.根据e1至e97中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质具有如通过体外b细胞活化测定所评估的约0.01nm至约0.1nm、优选地约0.04nm至约0.07nm的ec50。115.e99.根据e94至e98中任一项所述的重组蛋白质，其中所述b细胞活化测定是人b细胞活化测定。116.e100.根据e94至e99中任一项所述的重组蛋白质，其中所述ec50使用graphpadprism(第8.1.2版)测量。117.e101.一种重组蛋白质，所述重组蛋白质包含：118.特异性结合血清白蛋白的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合成纤维细胞活化蛋白质(fap)的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合cd40的第三锚蛋白重复结构域和特异性结合cd40的第四锚蛋白重复结构域，119.其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从n末端到c末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(fap结合结构域)–(cd40结合结构域)–(cd40结合结构域)。120.e102.根据e101所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含与seqidno:2具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且以等于或低于100nm、优选地等于或低于1nm、更优选地等于或低于120pm的kd值结合人fap。121.e103.根据e101或e102所述的重组蛋白质，其中所述fap结合结构域包含seqidno:2或seqidno:8的氨基酸序列。122.e104.根据e101至e103中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且以等于或低于100nm、优选地等于或低于75nm的kd值结合人cd40。123.e105.根据e101至e104中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和/或位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置，优选地其中所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。124.e106.根据e101至e105中任一项所述的重组蛋白质，其中所述cd40结合结构域中的每一者包含seqidno:3的氨基酸序列。125.e107.根据e101至e106中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且以等于或低于100nm、优选地等于或低于50nm、更优选地等于或低于35nm的kd值结合人血清白蛋白。126.e108.根据e101至e107中任一项所述的重组蛋白质，其中血清白蛋白结构域包含seqidno:1的氨基酸序列。127.e109.根据e101至e108中任一项所述的重组蛋白质，该重组蛋白质从n末端到c末端包含下式：(血清白蛋白结合结构域)–(接头)–(fap结合结构域)–(接头)–(cd40结合结构域)–(接头)–(cd40结合结构域)，其中接头包含seqidno:4的氨基酸序列。128.e110.根据e101至e110中任一项所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质包含恰好四个锚蛋白重复结构域。129.e111.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含seqidno:5或seqidno:6的氨基酸序列。130.e112.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含seqidno:5的氨基酸序列。131.e113.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含seqidno:6的氨基酸序列。132.e114.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且以等于或低于100nm的kd值结合人fap、人cd40和人血清白蛋白。133.e115.根据e5至e114中任一项所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质能够同时结合cd40、fap和血清白蛋白。134.e116.根据e1至e115中任一项所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质具有如通过体外人b细胞活化测定所评估的约0.1nm至约5nm的半最大有效浓度(ec50)。135.e117.根据e1至e116中任一项所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质与fap的结合不将fap的脯氨酰内肽酶活性抑制超过25％。136.e117a.根据e1至e117中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质特异性结合cd40受体的n末端富含半胱氨酸的结构域1(crd1)(seqidno:51的氨基酸23-59)。137.e118.一种核酸，该核酸编码根据e1至e117中任一项所述的重组蛋白质或根据e1至e117中任一项所定义的锚蛋白重复结构域。138.e119.根据e118所述的核酸，该核酸包含seqidno:58的核苷酸序列。139.e120.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含由seqidno:58的核苷酸序列编码的氨基酸序列。140.e121.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含由与seqidno:58的序列具有至少85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。141.e122.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含由能够在高严格条件下与seqidno:58的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列。142.e123.一种载体，该载体包含根据e118或e119所述的核酸。143.e124.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据e118或e119所述的核酸。144.e125.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据e123所述的载体。145.e126.根据e124或e125所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。146.e127.根据e124至e126中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(e.coli)。147.e128.根据e124或e125所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。148.e129.一种制备根据e1至e117和e120至e122中任一项所述的重组蛋白质的方法，该方法包括在其中表达所述重组蛋白质的条件下培养根据e124至e128中任一项所述的宿主细胞。149.e130.根据e129所述的方法，该方法还包括分离所述重组蛋白质。150.e131.一种药物组合物，该药物组合物包含根据e1至e117和e120至e122中任一项所述的重组蛋白质或根据e118或e119所述的核酸，以及任选地药学上可接受的载体或赋形剂。151.e132.一种在包括人在内的哺乳动物的表达cd40的细胞中定位活化cd40的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用根据e1至e117和e120至e122中任一项所述的重组蛋白质、根据e118或e119所述的核酸或根据e131所述的药物组合物的步骤。152.e133.根据e132所述的方法，其中所述表达cd40的细胞位于肿瘤、优选地实体瘤中。153.e134.根据e133所述的方法，其中所述肿瘤包括表达fap的细胞。154.e135.一种治疗医学病症的方法，该方法包括向对有需要的受试者施用治疗有效量的根据e1至e117和e120至e122中任一项所述的重组蛋白质、根据e118或e119所述的核酸或根据e131所述的药物组合物。155.e136.根据e134所述的方法，其中所述受试者是人。156.e137.根据e134或e135所述的方法，其中所述医学病症是癌症。157.e138.根据e136所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。158.e139.根据e136或e137所述的方法，其中所述癌症包括表达fap的细胞。159.e140.根据e137至e139中任一项所述的方法，其中所述癌症是脑癌、膀胱癌、乳腺癌、透明细胞肾癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、头颈鳞状细胞癌、唇癌、口腔癌、肝癌、宫颈癌、肺鳞状细胞癌、黑素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、非黑素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、尿道上皮癌、肉瘤、小细胞肺癌(sclc)、头颈鳞状细胞癌(scchn)、三阴性乳腺癌或甲状腺癌。160.e141.根据e137至e140中任一项所述的方法，其中所述癌症是肾上腺皮质肿瘤、肺泡状软组织肉瘤、恶性肿瘤、软骨肉瘤、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、内胚窦瘤、上皮样血管内皮细胞瘤、尤文肉瘤、生殖细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾瘤、成神经细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(nrsts)、骨肉瘤、椎旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤或wilms瘤。161.e142.根据e137所述的方法，其中癌症是急性淋巴母细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)或慢性髓性白血病(cml)。162.e143.根据e137所述的方法，其中该癌症是弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(hl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、多发性骨髓瘤(mm)、骨髓增生异常综合征(mds)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)。163.e144.根据e132至e143中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白质、核酸或药物组合物经静脉内施用。164.e145.根据e132至e144中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白质、核酸或药物组合物经皮下施用。165.e146.根据e132至e145中任一项所述的方法，其中约每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每月两次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每四个月一次施用所述重组蛋白质、核酸或药物组合物。166.e147.根据e1至e117和e120至e122中任一项所述的重组蛋白质、根据e118或e119所述的核酸或根据e131所述的药物组合物，其用作药物。167.e148.根据e1至e117和e120至e122中任一项所述的重组蛋白质、或根据e118或e119所述的核酸、或根据e131所述的药物组合物，其用于治疗受试者的医学病症。168.e149.用于根据e148所述的用途的重组蛋白质，其中所述医学病症是癌症。169.e150.根据e1至e117和e120至e122中任一项所述的重组蛋白质、根据e118或e119所述的核酸或根据e131所述的药物组合物在制造用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。170.e151.根据e1至e117和e120至e122中任一项所述的重组蛋白质、根据e118或e119所述的核酸或根据e131所述的药物组合物用于治疗受试者的医学病症的用途。171.e152.根据e151所述的用途，其中所述医学病症是癌症。172.e153.一种试剂盒，该试剂盒包含容器；该容器内的组合物，该组合物包含根据e1至e117和e120至e122中任一项所述的重组蛋白质、或根据e118或e119所述的核酸、或根据e131所述的药物组合物；以及包装说明书，该包装说明书包含用于施用治疗有效量的重组蛋白质、核酸或药物组合物以治疗对有需要的患者的说明书。173.e154.一种在包括人在内的哺乳动物中诱导抗肿瘤免疫记忆的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用根据e1至e117和e120至e122中任一项所述的重组蛋白质、根据e118或e119所述的核酸或根据e131所述的药物组合物的步骤。174.e155.根据e154所述的方法，其中免疫记忆不限于fap相关抗原。175.e156.根据e1至e117和e120至e122中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质能够在包括人在内的哺乳动物的肿瘤中优先定位和/或积累。176.e157.根据e156所述的重组蛋白质，其中所述肿瘤包括表达fap的细胞。177.e158.根据e1至e117、e120至e122和e156至e157中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质能够在包括人在内的哺乳动物中诱导抗肿瘤免疫记忆。178.e159.根据e158所述的重组蛋白质，其中所述免疫记忆不限于fap相关抗原。179.本文章节标题的使用仅仅是为了便于阅读，而并非旨在进行限制。整个文档旨在被视为统一的公开内容，并且应当理解，本文所述的特征的所有组合都是预期的。附图说明180.图1.描绘体外b细胞活化测定的卡通图。使用纯化的原代人b细胞和表达fap(+fap)或非表达fap(-fap)的cho细胞进行测定。181.图2.用于确定cd86阳性细胞的mfi和百分比的门控策略概述。使用以下设置：fsc：200；ssc：400；采集：200ul/min，100.000个事件。缩写：fmo＝荧光扣除对照，ssc＝侧向散射，fsc＝前向散射，fsc–a＝前向散射面积，fsc–h＝前向散射高度。182.图3.hsa结合结构域削弱双特异性fapxcd40锚蛋白重复结合蛋白的效力和功效。将人b细胞在存在表达fap的cho细胞(全符号)的情况下共培养，并且用递增浓度的sma014(向上的三角形)、sma087(向下的三角形)、sma095(菱形)和激动剂抗cd40mab(正方形)处理。作为对照，将b细胞在存在fap阴性cho细胞的情况下共培养，并且仅用最高浓度的相应构建体处理，描绘为空符号。在不存在a)和存在b)600μmhsa的情况下，根据cd86的上调评估人b细胞的活化(测量为平均荧光强度(mfi)和细胞百分比(％))。每个值描绘重复测量的平均值。所示数据代表两个独立实验。误差条显示±sem。所有构建体在存在表达fap的cho细胞的情况下的ec50和功效值(以nm计)在图表中描绘的表中示出。183.图4.cd40二价强效增加双特异性fapxcd40锚蛋白重复结合蛋白的效力和功效。将人b细胞在存在表达fap的cho细胞的情况下培养，并且用递增浓度的sma014(向上的三角形)、sma104(向下的三角形)、sma105(菱形)和激动剂抗cd40mab(正方形)处理。作为对照，将b细胞在存在fap阴性cho细胞的情况下共培养，并且仅用最高浓度的相应构建体处理，描绘为空符号。在不存在hsa的情况下，根据cd86的上调评估人b细胞的活化(测量为平均荧光强度(mfi)和细胞百分比(％))。每个值描绘重复测量的平均值。所示数据代表两个独立实验。误差条显示±sem。所有构建体在存在表达fap的cho细胞的情况下的ec50和功效值(以nm计)在图表中描绘的表中示出。184.图5.cd40二价挽救由hsa结合结构域诱导的抑制作用。将人b细胞在存在表达fap的cho细胞的情况下培养，并且用递增浓度的sma014(向上的三角形)、sma104(向下的三角形)、sma091(圆形)、sma099(菱形)、as579(六边形)和激动剂抗cd40mab(正方形)处理。作为对照，将b细胞在存在fap阴性cho细胞的情况下共培养，并且仅用最高浓度的相应构建体处理，描绘为空符号。在不存在a)和存在b)hsa的情况下，根据cd86的上调评估人b细胞的活化(测量为平均荧光强度(mfi)和细胞百分比(％))。每个值描绘重复测量的平均值。所示数据代表两个独立实验。误差条显示±sem。所有构建体在存在表达fap的cho细胞的情况下的ec50和功效值(以nm计)在图表中描绘的表中示出。185.图6.通过尺寸排阻色谱法(sec)和多角度光散射(mals)分析蛋白质#5(也称为sma136)。该图表将sec曲线示出为随时间推移的摩尔质量。示出了蛋白质#5的测定分子量。186.图7.表面等离振子共振(spr)迹线示出蛋白质#5(也称为sma136)与人cd40(a)、人fap(b)和人血清白蛋白(c)的结合。示出了所测定的kd值。187.图8.表面等离振子共振(spr)迹线示出蛋白质#5与hcd40、hfap和hsa同时结合。垂直线(1、2和3)表示三次注射：(1)蛋白质#5与固定的bio-hcd40的结合；(2)hfap(菱形◆、三角形▲和圆形●符号)或蛋白质#5(对照；叉号x符号)与bio-hcd40/蛋白质#5复合物的结合；(3)hsa(菱形◆、三角形▲符号)或hfap(对照；圆形●符号)与bio-hcd40/蛋白质#5/hfap复合物的结合，接着是600s解离期。注射方案在表8中使用相同的符号描绘。hcd40/蛋白质#5/hfap/hsa的同时结合在两个不同泳道(菱形和三角形符号)上一式两份测量。188.图9.蛋白质#5在体外经由cd40活化人b细胞。将人b细胞在存在表达fap的cho细胞的情况下培养，并且用递增浓度的蛋白质#5(圆形符号)和抗cd40mab(正方形符号)处理。根据cd86和cd69的上调评估人b细胞的活化(测量为平均荧光强度(mfi)和细胞百分比(％))。每个值描绘重复测量的平均值。所示数据代表十三个独立实验。误差条显示±sem。所描绘的表示出了蛋白质#5(左栏)和抗cd40mab(右栏)的ec50和功效值。189.图10.蛋白质#5在体外对人b细胞的活化是fap依赖性的。数据表明，蛋白质#5在体外不存在表达fap的cho细胞时不诱导人b细胞中的cd86和cd69的上调。如图9所述进行实验和数据绘图，即使用蛋白质#5(圆形符号)和抗cd40mab(正方形符号)，但存在fap阴性cho细胞。所示数据代表十三个独立实验。误差条显示±sem。所描绘的表示出了仅抗cd40mab的ec50和功效值。190.图11.使用体外分化的人单核细胞衍生的树突状细胞(mddc)和经照射的表达fap(+fap)或非表达fap(-fap)的cho细胞的mddc活化测定的示意图。191.图12.体内抗肿瘤功效研究的实验设计的示意图。在第0天用mc38-fap结肠癌细胞对小鼠皮下接种。如图12a和图12b所示，对于相应的研究，基于肿瘤大小和天数将小鼠随机分成处理组。进行四个具有不同方案的不同实验：(a)早时间点终止：在第一次处理后4天处死小鼠，并通过facs分析来分析肿瘤(研究pd1033和pd1038)；(b)晚时间点终止：在第一次处理后10-11天使小鼠安乐死，随时间推移测量肿瘤大小以评估抗肿瘤功效，并且在终止当天，通过facs分析研究肿瘤(研究pd1032和pd1035)。在指定的时间点用as598、as608或抗cd40抗体腹膜内处理小鼠。192.图13.抗肿瘤功效研究期间的小鼠体重。如图12所述处理小鼠。示出了研究pd1032(a)和研究pd1035(b)的每个处理组的平均体重(±sem，n＝10)。虚线表示随机化的时间点和处理的开始。使用kruskal-wallis进行统计分析，与媒介物进行多重比较。当*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001时，认为结果是显著的。193.图14.抗肿瘤功效研究期间的平均肿瘤生长体积。如图12所述处理小鼠，并且每3至4天测量一次肿瘤体积。示出了研究pd1032(a)和研究pd1035(b)的每个处理组的平均肿瘤体积(±sem，n＝10)。虚线表示随机化的时间点和处理的开始。箭头表示处理的时间点。使用kruskall-wallis进行统计分析，在终止时与媒介物或阴性对照as608(括号中)进行多重比较。当**p《0.01、***p《0.001、****p《0.0001时，认为结果是显著的。194.图15.在存在各种fap特异性重组结合蛋白的情况下的平均fap活性。在存在或不存在各种重组蛋白质的情况下，测量通过重组人fap进行的底物z-gly-pro-amc向荧光产物的转化。示出了温育95分钟后的fap活性。与在不存在测试分子的情况下的fap活性(第一对照：hfap和底物)相比，所有测试的含有fap结合结构域的重组蛋白质(分子1至4)未对fap酶活性显示抑制作用。观察到分子编号5(用作测定对照)对fap活性的部分抑制。示出了四组测量的平均fap活性和标准偏差。195.图16.(a)注射铟111标记的蛋白质#7后96小时的mc38-fap荷瘤小鼠的代表性spect/ct图像。示出了使用归一化强度设置生成的最大强度投影(mip)。标记的蛋白质#7优先在肿瘤中定位和积累。(b)在注射后24小时通过免疫组织化学(ihc)检测mc38-fap肿瘤中的蛋白质#7(上图)或对照蛋白质(下图)。尺寸条示于图像的右下角。(c)铟111标记的分子的组织分布的时间进程。在指定的时间点在肿瘤(左图)和肌肉(右图)中分析对照分子(实心条)和蛋白质#7(条纹条)的组织分布。数据以每克组织的分子注射剂量的百分比(％id/g)给出并表示为平均值±sd。n＝4只小鼠/时间点。196.图17.(a)体内抗肿瘤功效研究的实验设计的示意图。(b)抗肿瘤功效研究期间的平均肿瘤生长体积。如图17a和实施例9所述处理小鼠并测量肿瘤体积。示出了媒介物(三角形符号)、as598(圆形符号)和抗cd40抗体(正方形符号)的每个处理组的平均肿瘤体积(±sem，n＝10)。箭头表示处理的开始。197.图18.抗肿瘤功效研究中的长期作用。如实施例10所述，用媒介物(三角形符号)、as598(正方形符号)和as608(阴性对照)(圆形符号)处理携带mc38-fap肿瘤的小鼠，并且每3至4天测量一次肿瘤体积。每个处理组的平均肿瘤体积(±sem)示于(a)中，并且kaplan-meier生存曲线示于(b)中。箭头表示处理时间点。198.图19.抗肿瘤免疫记忆的诱导。(a)图18a所示的实验进行更长的时间，示出了用媒介物(向上的空心三角形)、as598(空心圆形)和as608(阴性对照)(向下的空心三角形)处理的mc38-fap荷瘤小鼠的平均肿瘤生长曲线。短箭头表示处理时间点。在约120天时，用mc38-wt(向下的实心三角形)或mc38-fap(向上的实心三角形)肿瘤细胞再次攻击先前用as598处理过的无瘤小鼠，并且监测直至第200天。示出了每组8只小鼠的平均肿瘤生长曲线。(b)在约120天时，用mc38-wt(向下的三角形)或mc38-fap(向上的三角形)肿瘤细胞攻击原初对照小鼠。示出了每组5只小鼠的平均肿瘤生长曲线。199.图20.毒性评估。(a)将携带mc38-fap肿瘤的小鼠用媒介物(n＝10)(向上的三角形)、as608(阴性对照)(n＝5)(向下的三角形)、as598(蛋白质#7)(n＝10)(圆形)或抗mcd40抗体(n＝10)(正方形)处理一次，并且在24小时后测量血清细胞因子。从两个独立实验中收集样品并一起分析。(b)将携带mc38-fap肿瘤的小鼠用媒介物(向上的三角形)、as608(阴性对照)(向下的三角形)、as598(蛋白质#7)(圆形)或抗mcd40抗体(正方形)(每组5只小鼠)处理一次，并且在24小时后测量血清天冬氨酸转氨酶(ast)和丙氨酸转氨酶(alt)。从两个独立实验中收集样品并一起分析。(c)将携带mc38-fap肿瘤的小鼠用媒介物、as608(阴性对照)(未示出)、as598(蛋白质#7)或抗mcd40抗体(n＝5-10)处理一次，并且在24小时后收获肝脏并通过免疫组织化学(ihc)分析组织损伤。示出了不同处理的代表性图片。nec，坏死；ici，免疫细胞浸润。尺寸条示于图片的右下角。200.图21.通过x射线晶体学确定与具有seqidno:3的氨基酸序列的蛋白质复合的人肿瘤坏死因子受体超家族成员5(hcd40)的结构。具体实施方式201.1.概述202.本文公开了包含对fap和cd40具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组蛋白质。本文还公开了编码结合蛋白的核酸、包含结合蛋白或核酸的药物组合物、以及使用结合蛋白、核酸或药物组合物的方法。在一个方面，本公开的材料和方法利用fap在肿瘤相关基质中的表达，从而允许例如肿瘤中表达cd40的细胞的特异性靶向和那些表达cd40的细胞中cd40的选择性活化。203.cd40激动剂抗体已在临床前鼠肿瘤模型中展示出功效，并且其在临床中的使用也已显示出一些抗肿瘤功效。然而，激动性抗cd40抗体的临床开发可能受到剂量限制性毒性和导致的低功效的阻碍。204.本文所述的多特异性重组蛋白质促进癌症靶标介导的和肿瘤定位的聚集和cd40的活化，从而解决与先前的治疗方法相关的挑战。在自然条件下，cd40的聚集是通过结合三聚体cd40配体(cd40l、cd154)实现的，所述配体在某些细胞例如活化的cd4+t细胞的表面上表现为膜分子。cd40在例如由cd40l靶向的细胞的细胞膜中聚集是其信号传导途径活化的先决条件。本文所公开的本发明的多特异性重组蛋白质利用该聚集效应；并且cd40的活化与肿瘤抗原fap的表达相关。205.成纤维细胞活化蛋白质α(fap，也称为seprase)是一种ii型膜结合糖蛋白，在许多实体瘤的基质中由癌症相关联成纤维细胞大量表达。fap在超过90％的上皮恶性肿瘤(原发性和转移性)(包括肺癌、结直肠癌、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌)的反应性基质成纤维细胞中，以及在骨和软组织肉瘤的恶性间充质细胞中选择性表达，而其通常不存在于正常成人组织中(brennen等人，molcancerther.11:257–266(2012)；garin-chesa等人，procnatlacadsciusa87,7235-7239(1990)；rettig等人，cancerres.53:3327–3335(1993)；rettig等人，procnatlacadsciusa85,3110-3114(1988))。fap也在某些恶性肿瘤细胞上表达。206.尽管不受特定理论的限制，但在不存在肿瘤抗原fap(正常、非恶性、非癌症相关细胞)的情况下，将发生cd40的最小聚集，并且免疫活化将受到限制。相比之下，在癌症相关成纤维细胞中，fap被高度表达，因此，通过fap结合，本发明的多特异性蛋白质促进cd40在表达cd40的免疫细胞(诸如b细胞和抗原呈递细胞)中聚集和活化。该策略的优点有两方面：全身性毒性应受到限制，因为活化将很大程度上局限于表达fap的组织，并且肿瘤介导的cd40聚集应驱动强效激动作用。207.2.定义208.除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。一般来讲，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名法以及技术是本领域熟知的和常用的那些。209.除非另外说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被理解为开放式术语。如果本发明的各方面被描述为“包括”特征，则还设想到“由该特征组成”或“基本上由该特征组成”的实施方案。除非另外提出权利要求，否则本文所提供的任何和全部实例或示例性语言(例如“诸如”)仅仅旨在更好地举例说明本公开，并且并不用来限制本公开的范围。说明书中的任何语言都不应理解为表示任何不受权利要求书保护的要素是实施本公开所必需的。除了在操作示例中，或在另外指明的情况下，本文所用的表示成分或反应条件的量的所有数字在所有情况下均应理解为由相关领域的技术人员将理解的术语“约”修饰。210.除非本文另外说明，否则本文对值的范围的表述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值和每个端点的简略方法，并且每个单独值和端点并入本说明书中，如同其在本文中被单独地表述一样。211.术语“多肽”涉及由多个(即两个或更多个)经由肽键连接的氨基酸的一条或多条链组成的分子。优选地，多肽由八个以上经由肽键连接的氨基酸组成。术语“多肽”还包括通过半胱氨酸的s-s桥连接在一起的氨基酸的多个链。多肽是本领域技术人员熟知的。212.术语“蛋白质”是指包含多肽的分子，其中该多肽的至少一部分通过在单条多肽链内和/或多条多肽链之间形成二级、三级和/或四级结构而具有或能够获得限定的三维排列。如果蛋白质包含两条或更多条多肽链，则各条多肽链可非共价连接或共价连接，例如通过两条多肽链之间的二硫键连接。通过形成二级和/或三级结构而单独具有或能够获得限定的三维排列的蛋白质部分被称为“蛋白质结构域”。这种蛋白质结构域是本领域技术人员熟知的。213.专利申请wo2002/020565和forrer等人，2003(forrer,p.,stumpp,m.t.,binz,h.k.,plückthun,a.,2003.febsletters539,2-6)包含重复蛋白质、重复结构域和重复模块的特征、技术和应用的一般描述。214.术语“重复结构域”是指包含两个或更多个连续重复模块作为结构单元的蛋白质结构域，其中所述重复模块具有结构和序列同源性。优选地，重复结构域还包含n-末端和/或c-末端的封端模块。为了清楚起见，封端模块可以是重复模块。本领域从业人员根据以下各项的示例熟知此类重复结构域、重复模块和封端模块、序列基序以及结构同源性和序列同源性：锚蛋白重复结构域(binz等人，j.mol.biol.332,489–503,2003；binz等人，2004,loc.cit.；wo2002/020565；wo2012/069655)、富含亮氨酸的重复结构域(wo2002/020565)、三角形四肽重复结构域(main,e.r.,xiong,y.,cocco,m.j.,d'andrea,l.,regan,l.,structure11(5),497-508,2003)和犰狳重复结构域(wo2009/040338)。本领域技术人员还熟知，此类重复结构域不同于包含重复氨基酸序列的蛋白质，其中每个重复氨基酸序列能够形成单个结构域(例如纤连蛋白的fn3结构域)。215.术语“锚蛋白重复结构域”是指包含两个或更多个连续锚蛋白重复模块作为结构单元的重复结构域，其中所述锚蛋白重复模块具有结构同源性和序列同源性。216.术语“重复模块”是指经设计的重复结构域的重复氨基酸序列和结构单元，其最初来源于天然存在的重复蛋白的重复单元。包含在重复结构域中的每个重复模块来源于天然存在的重复蛋白家族或亚家族(优选锚蛋白重复蛋白家族)的一个或多个重复单元。因此，术语“锚蛋白重复模块”是指最初来源于天然存在的锚蛋白重复蛋白的重复单元的重复模块。锚蛋白重复蛋白是本领域技术人员熟知的。参见例如国际专利公布wo2002/020565、wo2010/060748、wo2011/135067、wo2012/069654、wo2012/069655、wo2014/001442、wo2014/191574、wo2014/083208、wo2016/156596和wo2018/054971。217.可使用标准重组dna技术(参见例如forrer,p.等人，febsletters，第539卷，第2-6页，2003年，wo2012/069655、wo2002/020565)，将锚蛋白重复结构域模块化地组装成根据本公开的较大锚蛋白重复蛋白质，任选地具有半衰期延长结构域。218.如在经设计的重复蛋白、经设计的重复结构域、经设计的锚蛋白重复结构域等中使用的术语“经设计的”是指此类重复蛋白和重复结构域分别是人造的并且在自然界中不存在的特性。219.如在重组蛋白、重组结合蛋白、重组多肽等中使用的术语“重组”意指所述蛋白质或多肽是通过使用本领域技术人员熟知的重组dna技术产生的。例如，可将编码多肽的重组dna分子(例如，通过基因合成产生)克隆到细菌表达质粒(例如，pqe30，qiagen公司)、酵母表达质粒、哺乳动物表达质粒或植物表达质粒，或者能够体外表达的dna中。如果例如将此类重组细菌表达质粒插入适当的细菌(例如，大肠杆菌(escherichiacoli))中，则这些细菌可产生由该重组dna编码的多肽。对应产生的多肽或蛋白质被称为重组多肽或重组蛋白。220.在本发明的上下文中，术语“结合蛋白”是指包含结合结构域的蛋白质。结合蛋白还可包含两个、三个、四个、五个或更多个结合结构域。优选地，所述结合蛋白是重组结合蛋白。221.术语“结合结构域”意指对靶标表现出结合特异性的蛋白质结构域。优选地，所述结合结构域是重组结合结构域。222.术语“靶标”是指单独的分子，诸如核酸分子、肽、多肽或蛋白、碳水化合物或任何其他天然存在的分子，包括此类单独的分子的任何部分；或者两种或更多种此类分子的复合物；或者整个细胞或组织样品；或者任何非天然化合物。优选地，靶标是天然存在的或非天然的多肽或蛋白质，或含有化学修饰(例如天然或非天然的磷酸化、乙酰化或甲基化)的visexp.2014；(84):51383)。kd值可使用技术(octetqke系统，fortebio)测量。另选地或另外地，也可使用(动力学排除测定)测定，购自sapidyneinstruments(boise,id.)。本文涵盖适用于评估两个结合配偶体之间的结合亲和力的任何方法。优选地，通过spr在pbs中测定kd值，例如，如实施例2所述。228.术语“多肽标签”是指附接到多肽/蛋白质的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可用于纯化、检测或靶向所述多肽/蛋白质，或者其中所述氨基酸序列改善多肽/蛋白质的物理化学行为，或者其中所述氨基酸序列具有效应子功能。结合蛋白的各个多肽标签、部分和/或结构域可直接彼此连接或经由多肽接头彼此连接。这些多肽标签是本领域熟知的，并且是本领域技术人员完全可用的。多肽标签的示例是小的多肽序列，例如his(例如，由seqidno:57组成的his标签)、myc、flag或strep标签，或部分诸如允许检测所述多肽/蛋白质的酶(例如，碱性磷酸酶等酶)，或可用于靶向的部分(诸如免疫球蛋白或其片段)和/或用作效应子分子的部分。229.术语“多肽接头”是指能够连接例如两个蛋白质结构域、多肽标签和蛋白质结构域、蛋白质结构域和非多肽部分(诸如聚乙二醇)或者两个多肽标签的氨基酸序列。此类另外的结构域、标签、非多肽部分和接头是相关领域技术人员已知的。此类多肽接头的示例是由seqidno:4和56组成的接头。230.术语“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸分子，其可以是单链或双链的核糖核酸(rna)分子或脱氧核糖核酸(dna)分子，并且包括dna或rna的经修饰形式和人造形式。核酸分子可以以分离的形式存在，或者被包含在重组核酸分子或载体中。231.在本发明的上下文中，术语“医学病症”、“疾病”和“疾患”可互换使用，并且包括但不限于自身免疫疾患、炎性疾患、视网膜病变(特别是增生性视网膜病变)、神经退行性疾患、感染性疾病、代谢疾病和肿瘤性疾病。“医学病症”可能是以不适当的细胞增殖为特征的病症。医学病症可能是过度增生病症。医学病症可能是肿瘤性疾病。如本文所用，术语“肿瘤性疾病”是指以细胞生长或肿瘤快速增殖为特征的细胞或组织的异常状态或病症。医学病症可能是恶性肿瘤性疾病。医学病症可能是癌症。术语“癌症”和“癌性”在本文中用来指或描述哺乳动物中通常以未受调控的细胞生长为特征的生理状况。癌症涵盖实体瘤和液体瘤，以及原发性肿瘤和转移。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。实体瘤通常还包含肿瘤基质。癌症的示例包括但不限于原发性和转移性癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、骨髓瘤、黑素瘤和白血病，以及任何其他上皮和血细胞恶性肿瘤。此类癌症的更具体的示例包括脑癌、膀胱癌、乳腺癌，卵巢癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、头颈癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、恶性黑素瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、上皮癌、鳞状细胞癌、透明细胞肾癌、头/颈鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肾细胞癌、小细胞肺癌(sclc)、三阴性乳腺癌、急性成淋巴细胞性白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(hl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、多发性骨髓瘤(mm)、骨髓增生异常综合征(mds)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、头颈部鳞状细胞癌(scchn)、慢性髓细胞性白血病(cml)、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、恶性间皮瘤、脂肪肉瘤、成神经细胞瘤或滑膜肉瘤。232.术语“处理”以及与其相关的词语不一定暗示100％或完全固化。相反，存在本领域普通技术人员认为具有潜在的有益效果或治疗效果不同程度的治疗。在这方面，本公开的治疗癌症的方法可提供任何量或任何水平的治疗。此外，由本公开的方法提供的治疗可包括治疗(即，缓解)一种或多种病症或症状。而且，由本公开的方法提供的治疗可涵盖减慢癌症的进展。例如，这些方法可通过增强针对癌症的t细胞活性或免疫应答、减少新病变的肿瘤或癌症生长或外观、减少肿瘤细胞的转移、增加肿瘤或癌细胞的细胞死亡、抑制肿瘤或癌细胞存活等来治疗癌症。在示例性方面，这些方法通过将癌症的发作或复发延迟1天、2天、4天、6天、8天、10天、15天、30天、两个月、4个月、6个月、1年、2年、4年或更长时间来治疗。在示例性方面，这些方法通过增加受试者的存活率来治疗。术语“治疗”还包括预防性治疗。233.任何给定疾病或病症中的治疗应答可通过特定于该疾病或病症的标准化应答标准来确定。肿瘤应答可使用筛选技术评估，诸如磁共振成像(mri)扫描、x射线照相成像、计算机断层摄影(ct)扫描、正电子发射断层摄影(pet)扫描、骨扫描、超声、肿瘤活检取样、循环中肿瘤细胞的计数和/或肿瘤抗原(例如前列腺特异性抗原(psa)和/或甲胎蛋白(afp))的测量。除了这些治疗应答之外，接受疗法的受试者可体验到与疾病相关的症状改善的有益效果。234.术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施。需要治疗的那些患者包括已经患有疾患的那些患者，以及要预防疾患的那些患者。235.术语“治疗有效量”是指足以在受试者中诱导期望的生物学结果、药理学结果或治疗结果的量。在本发明的上下文中，治疗有效量意指以适用于任何医学治疗的合理的效/险比治疗或预防疾病或疾患的结合蛋白的足够的量。236.用于治疗的目的，术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物、非人灵长类动物，和动物园、运动或宠物动物，诸如狗、马、猫、牛等。237.术语“温育”是指在ph7.4下温育。在一个实施方案中，所述在ph7.4下的温育是指在pbs中温育。238.术语“pbs”意指含有137mmnacl、10mm磷酸盐和2.7mmkcl并且ph为7.4的磷酸盐缓冲水溶液。239.术语改善的药代动力学特性是指曲线下面积增加、清除率减少或终末半衰期增加。药代动力学特性的这些参数和确定它们的方式是本领域熟知的(参见例如mahmood,i.,methodstodeterminepharmacokineticprofilesoftherapeuticproteins,drugdiscovtoday:technol(2009),doi:10.1016/j.ddtec.2008.12.001)。240.在本发明的上下文中，术语“任何氨基酸”优选地意指20种最常见的天然存在的氨基酸中的任一种，即丙氨酸(ala；a)、精氨酸(arg；r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、缬氨酸(val，v)。241.3.靶向fap和cd40的多特异性分子242.本文公开了靶向fap和cd40的多特异性分子。这些分子可用于例如治疗癌症。根据本发明，本文提供的靶向fap和cd40的多特异性分子优选地为经设计的重复蛋白质，更优选地为经设计的锚蛋白重复蛋白质。243.3.1.锚蛋白重复结构域和锚蛋白重复蛋白质244.经设计的锚蛋白重复蛋白是一类结合分子，其具有克服单克隆抗体限制的潜力，从而允许新型治疗方法。此类锚蛋白重复蛋白可以包含单个经设计的锚蛋白重复结构域，或者可以包含两个、三个、四个、五个或更多个具有相同或不同靶标特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的组合(stumpp等人，drugdiscov.today13,695-701,2008；美国专利号9,458,211)。仅包含单个经设计的锚蛋白重复结构域的锚蛋白重复蛋白为小蛋白质(14kda)，其可被选择为以高亲和力和特异性结合给定靶蛋白。这些特征以及在一种蛋白中组合两个、三个、四个、五个或更多个经设计的锚蛋白重复结构域的可能性使得经设计的锚蛋白重复蛋白成为理想的激动性、拮抗性和/或抑制性药物候选物。此外，此类锚蛋白重复蛋白可被工程化以携带各种效应子功能，例如细胞毒性剂或半衰期延长剂，从而实现全新的药物形式。总之，经设计的锚蛋白重复蛋白为具有超过现有抗体药物的潜力的下一代蛋白质治疗剂的示例。245.本文所述的经设计的锚蛋白重复结构域通常包含一个或多个经设计的重复模块、优选地锚蛋白重复模块作为结构单元(此后也称为结构重复序列或重复单元)，其中所述重复模块、优选地所述锚蛋白重复模块具有结构和序列同源性。锚蛋白重复模块通常包含两个反平行α螺旋，后面是β凸起和含β发夹的环，连接到下一个重复序列上，每个重复序列具有约28-33个残基。246.包含经设计的锚蛋白重复模块的重组蛋白质或其经设计的结合结构域在本文中也称为蛋白质。参见stumpp等人，curropindrugdiscovdevel.10(2):153-9(2007)；以及binz等人，naturebiotech.22(5):575-582(2004)。蛋白质可被认为是对靶蛋白质具有高特异性和高结合亲和力的抗体模拟物。一般来讲，蛋白质包含至少一个锚蛋白重复模块，例如至少2个、3个或更多个锚蛋白重复模块。是molecularpartnersag,switzerland拥有的商标。247.本文所述的锚蛋白重复结构域通常包含提供结构的核心支架，以及结合到靶标的靶标结合残基。结构核心包括保守的氨基酸残基，并且靶标结合表面包括根据靶标而不同的氨基酸残基。例如，锚蛋白重复模块可包含以下序列：xdxxgxtplhlaxxxgxxxivxvllxxgadvna(seqidno:23)，其中“x”表示任何氨基酸，优选地其中“x”不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸。又如，锚蛋白重复模块可包含seqidno:24至27中的任一者的氨基酸序列。248.经设计的重复蛋白文库(包括经设计的锚蛋白重复蛋白文库)(wo2002/020565；binz等人，nat.biotechnol.22,575-582,2004；stumpp等人，drugdiscov.today13,695-701,2008)可用于选择/筛选以高亲和力结合其靶标的靶标特异性的经设计的重复结构域。此类靶标特异性的经设计的重复结构域进而可以用作用于治疗疾病的重组结合蛋白的有价值的组分。制备此类文库的方法是本领域技术人员已知的(wo2002/020565)。249.多个锚蛋白重复结构域可连接(通过共价键或非共价缔合)以形成双特异性或多特异性分子。本文公开了此类多特异性分子，包括其中一个fap结合结构域和两个cd40结合结构域相连的分子。此类分子还可以在n末端包含半衰期延长部分。250.3.2.n末端和c末端封端模块251.本文所公开的重组蛋白质的重复结构域、优选地锚蛋白重复结构域优选地包含n末端和/或c末端封端模块(此后也称为封端重复序列或封端单元)。封端模块位于锚蛋白重复结构域的n末端和/或c末端，通常与其间的锚蛋白重复模块形成紧密的三级相互作用(即三级结构相互作用)，从而提供保护一侧的锚蛋白重复结构域的疏水核免于暴露于溶剂的盖。252.n末端和/或c末端封端模块可来源于存在于邻近重复单元的天然存在的重复蛋白质中的封端单元或其他结构单元。封端序列的示例在国际专利公布wo2002/020565和wo2012/069655、美国专利公布us20130296221以及interlandi等人，jmolbiol.2008年1月18日；375(3):837-54中有所描述。n末端封端模块(即n末端封端重复序列)的示例是seqidno:11-16，并且c末端封端模块(即c末端封端重复序列)的示例是seqidno:18-21。253.在一个示例性实施方案中，n末端封端模块包含氨基酸序列dlgkklleaaragqddevrillaagadvna(seqidno:14)或dlgkklleaaragqddevrellkagadvna(seqidno:15)，其中seqidno:14或seqidno:15的至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸任选地被任何氨基酸交换；并且其中seqidno:14或seqidno:15还可任选地在其n末端包含“g”、“s”或“gs”序列。在一个示例性实施方案中，c末端封端模块包含氨基酸序列qdifgktpadiaadaghediaevlqkaa(seqidno:19)或qdksgktpadlaadaghediaevlqkaa(seqidno:20)，其中seqidno:19或seqidno:20的至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸任选地被任何氨基酸交换。254.有利地，在一些实施方案中，本文提供的经设计的锚蛋白重复结构域的n末端封端模块和/或c末端封端模块中的某些氨基酸残基被改变，导致该经设计的锚蛋白重复结构域和包含经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白的药代动力学特性(包括延长的终末半衰期)得到改善。经改变的氨基酸残基主要是表面暴露的残基。优选地，经改变的氨基酸残基是n末端封端模块的位置8和15处的氨基酸残基，其中位置编号对应于seqidno:11中的位置，以及c末端封端模块的位置14和18处的氨基酸残基，其中位置编号对应于seqidno:18中的位置。255.在一个优选的实施方案中，本文提供的经设计的锚蛋白重复结构域包含具有氨基酸序列的n末端封端模块，其中位置8处的氨基酸是q并且/或者位置15处的氨基酸是l。此类n末端封端模块的示例是seqidno:11、12和13。在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含具有氨基酸序列的n末端封端模块，其中位置4处的氨基酸是s，位置8处的氨基酸是q，位置15处的氨基酸是l，位置17处的氨基酸是t，位置20处的氨基酸是t并且/或者位置23处的氨基酸是q。此类n末端封端模块的示例是seqidno:16。在一个优选的实施方案中，所述n末端封端模块包含具有30个氨基酸的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述n-末端封端模块由具有30个氨基酸的氨基酸序列组成。优选地，n末端封端模块的位置的所述位置编号是通过使用seqidno:11的位置编号与seqidno:11进行比对来确定的。优选地，所述比对不包括氨基酸空位。序列比对生成是本领域众所周知的程序。任何所述n末端封端模块还可任选地在其n末端包含“g”、“s”或“gs”序列。256.例如，具有经改变的氨基酸残基的n末端封端模块可包含以下序列：dlgxxllqaaxxgqldxvrxlxxxgadvna(seqidno:17)，其中“x”表示任何氨基酸。257.在一个示例性实施方案中，n末端封端序列包含dlgkkllqaaragqldevrellkagadvna(seqidno:11)、dlgkkllqaaragqldevrillkagadvna(seqidno:12)或dlgkkllqaaragqldevrillaagadvna(seqidno:13)，其中seqidno:11、seqidno:12或seqidno:13中除位置8和15之外的位置中的至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸任选地被任何氨基酸交换；并且其中seqidno:11、seqidno:12或seqidno:13还可任选地在其n末端包含“g”、“s”或“gs”序列。因此，在一个实施方案中，本发明的经设计的重复结构域、优选地锚蛋白重复结构域包含具有氨基酸序列dlgkkllqaaragqldevrellkagadvna(seqidno:11)的n末端封端模块，其中seqidno:11的除位置8和15之外的位置中的至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸任选地被任何氨基酸交换；并且其中seqidno:11还可任选地在其n末端包含“g”、“s”或“gs”序列。258.在另一个示例性实施方案中，n末端封端序列包含dlgskllqaaragqldtvrtllqagadvna(seqidno:16)，其中seqidno:16的除位置4、8、15、17、20和23之外的位置中的至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸任选地被任何氨基酸交换；并且其中seqidno:16还可任选地在其n末端包含“g”、“s”或“gs”序列。259.在另一个优选的实施方案中，本文提供的经设计的重复结构域、优选地锚蛋白重复结构域包含具有氨基酸序列的c末端封端模块，其中位置14处的氨基酸是r并且/或者位置18处的氨基酸是q。此类c末端封端模块的示例是seqidno:18和19。在一个实施方案中，所述经设计的锚蛋白重复结构域包含具有氨基酸序列的c末端封端模块，其中位置3处的氨基酸是t，位置4处的氨基酸是q，位置6处的氨基酸是t，位置14处的氨基酸是r，位置18处的氨基酸是q，位置19处的氨基酸是q，位置22处的氨基酸是s并且/或者位置26处的氨基酸是q。此类c末端封端模块的示例是seqidno:21。在一个优选的实施方案中，所述c-末端封端模块包含具有28个氨基酸的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述c-末端封端模块由具有28个氨基酸的氨基酸序列组成。优选地，c末端封端模块的位置的所述位置编号是通过使用seqidno:18的位置编号与seqidno:18进行比对来确定的。优选地，所述比对不包括氨基酸空位。260.例如，具有经改变的氨基酸残基的c末端封端模块可包含以下序列：xdxxgxtpadxaarxghqxiaxvlqxaa(seqidno:22)，其中“x”表示任何氨基酸。261.在一个示例性实施方案中，c末端封端序列包含qdksgktpadlaaraghqdiaevlqkaa(seqidno:18)，其中seqidno:18的除位置14和18之外的位置中的至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸任选地被任何氨基酸交换。262.在另一个示例性实施方案中，c末端封端序列包含qdtqgttpadlaaraghqqiasvlqqaa(seqidno:21)，其中seqidno:21的除位置3、4、6、14、18、19、22和26之外的位置中的至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸任选地被任何氨基酸交换。263.3.3.fap结合结构域264.一种有吸引力的基质细胞靶标是成纤维细胞活化蛋白质(fap)，它是在几乎所有上皮癌症的癌症相关基质细胞中高度表达的跨膜丝氨酸蛋白酶。fap还在胚胎发育期间、愈合伤口的组织中以及在慢性炎性和纤维化病症(诸如肝硬化和特发性肺纤维化)中表达。然而，fap尚未通过免疫组织化学在良性肿瘤中或在大多数正常静态成人基质细胞中检测到。265.本文所述的重组蛋白质包含特异性结合fap的锚蛋白重复结构域，在本文中也称为“fap结合结构域”。266.在一些实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含与seqidno:2具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含与seqidno:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含seqidno:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含与seqidno:8具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含与seqidno:8具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含seqidno:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含与seqidno:9具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含与seqidno:9具有至少90％同一性的氨基酸序列。在另一个示例性实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含与seqidno:28至38中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含与seqidno:28至38中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。在另一个示例性实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含seqidno:28至38中的任一者的氨基酸序列。267.在一些实施方案中，相对于seqidno:2的序列进行不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:2的序列进行不超过5个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:2的序列进行不超过4个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:2的序列进行不超过3个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:2的序列进行不超过2个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:2的序列进行不超过1个取代。在一些实施方案中，与包含seqidno:2的序列的蛋白质的kd值相比，取代使kd值改变不超过1000倍、不超过100倍或不超过10倍。在一些实施方案中，相对于seqidno:8的序列进行不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:8的序列进行不超过5个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:8的序列进行不超过4个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:8的序列进行不超过3个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:8的序列进行不超过2个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:8的序列进行不超过1个取代。在一些实施方案中，与包含seqidno:8的序列的蛋白质的kd值相比，取代使kd值改变不超过1000倍、不超过100倍或不超过10倍。在某些实施方案中，取代是根据表1的保守取代。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基之外进行取代，例如在连接α-螺旋的β环中。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基内进行取代。例如，锚蛋白结构域可包含共有序列：xdxxgxtplhlaxxxgxxxivxvllxxgadvna(seqidno:23)，其中“x”表示任何氨基酸，优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸；或xdxxgxtplhlaxxxghleivevllkzgadvna(seqidno:24)，其中“x”表示任何氨基酸，优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸，并且“z”选自由天冬酰胺、组氨酸或酪氨酸组成的组。在一个实施方案中，对命名为“x”的残基进行取代。在另一个实施方案中，在命名为“x”的残基之外进行取代。268.此外，倒数第二位置可以是“a”(参见例如seqidno:2、8、9、28至31和38)或“l”(参见例如seqidno:32至37)，并且/或者最后位置可以是“a”(参见例如seqidno:2、8、9、28至31和38)或“n”(参见例如seqidno:32至37)。因此，在一些实施方案中，fap结合结构域包含与seqidno:2、8、9、28至31和38中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个示例性实施方案中，fap结合结构域包含与seqidno:2、8、9、28至31和38中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一些实施方案中，fap结合结构域包含与seqidno:2具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个示例性实施方案中，fap结合结构域包含与seqidno:2具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个优选的实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含seqidno:2的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一些实施方案中，fap结合结构域包含与seqidno:9、28至31和38中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个示例性实施方案中，fap结合结构域包含与seqidno:9、28至31和38中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在另一个示例性实施方案中，fap结合结构域包含seqidno:9、28至31和38中的任一者的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一些实施方案中，fap结合结构域包含与seqidno:32至37中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的l被a取代并且/或者最后位置处的n被a取代。在一个示例性实施方案中，fap结合结构域包含与seqidno:32至37中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的l被a取代并且/或者最后位置处的n被a取代。在另一个示例性实施方案中，fap结合结构域包含seqidno:32至37中的任一者的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的l被a取代并且/或者最后位置处的n被a取代。序列可任选地在其n末端包含g、s或gs(参见下文)。269.此外，fap结合结构域还可任选地在其n末端包含“g”、“s”或“gs”序列(参见例如与seqidno:2相比的seqidno:38)。因此，在一些实施方案中，本文提供的fap结合结构域(i)包含与seqidno:2、8、9和28至37中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且(ii)在其n末端还包含g、s或gs。在一个示例性实施方案中，fap结合结构域包含与seqidno:2、8、9和28至37中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。在一个示例性实施方案中，fap结合结构域包含与seqidno:2、8、9和28至37中的任一具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。在一个示例性实施方案中，fap结合结构域包含seqidno:2、8、9和28至37中的任一者的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。同样因此，在一些实施方案中，本文提供的fap结合结构域包含与seqidno:38具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中seqidno:38的位置1处的g和/或位置2处的s任选地缺失。270.因此，在一个特别优选的实施方案中，本文所述的fap结合结构域包含seqidno:2的氨基酸序列，其中其n末端还任选地包含g、s或gs，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。271.在某些实施方案中，fap结合结构域或包含fap结合结构域的重组蛋白质与其靶标(即，fap)之间的亲和力以kd描述。在示例性实施方案中，kd为约10-1m或更小、约10-2m或更小、约10-3m或更小、约10-4m或更小、约10-5m或更小、约10-6m或更小、约10-7m或更小、约10-8m或更小、约10-9m或更小、约10-10m或更小、约10-11m或更小、约10-12m或更小、约10-13m或更小、约10-14m或更小、约10-5m至约10-15m、约10-6m至约10-15m、约10-7m至约10-15m、约10-8m至约10-15m、约10-9m至约10-15m、约10-10m至约10-15m、约10-5m至约10-14m、约10-6m至约10-14m、约10-7m至约10-14m、约10-8m至约10-14m、约10-9m至约10-14m、约10-10m至约10-14m、约10-5m至约10-13m、约10-6m至约10-13m、约10-7m至约10-13m、约10-8m至约10-13m、约10-9m至约10-13m、约10-10m至约10-13m。272.在示例性实施方案中，fap结合结构域以等于或低于以下的kd值结合fap：约100nm、约90nm、约80nm、约75nm、约60nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm、约10nm、约5nm、约2nm、约1nm、约900pm、约800pm、约700pm、约600pm、约500pm、约400pm、约300pm、约250pm、约200pm、约150pm、约100pm、约50pm、约40pm、约30pm、约25pm、约20pm、约15pm、约10pm、约5pm或约1pm，优选地以等于或低于以下的kd值结合：100nm、90nm、80nm、75nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、2nm、1nm、900pm、800pm、700pm、600pm、500pm、400pm、300pm、250pm、200pm、150pm、140pm、130pm或120pm。在一个示例性实施方案中，fap结合结构域以等于或低于约100nm的kd值结合fap。在另一个示例性实施方案中，fap结合结构域以等于或低于约10nm的kd值结合fap。在另一个示例性实施方案中，fap结合结构域以等于或低于约1nm的kd值结合fap。在一个优选的实施方案中，fap结合结构域以等于或低于约120pm的kd值结合fap。优选地，fap结合结构域具有seqidno:2的氨基酸序列。273.在示例性实施方案中，包含fap结合结构域的重组蛋白质以等于或低于以下的kd值结合fap：约100nm、约90nm、约80nm、约75nm、约60nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm、约10nm、约5nm、约2nm、约1nm、约900pm、约800pm、约700pm、约600pm、约500pm、约400pm、约300pm、约250pm、约200pm、约150pm、约100pm、约50pm、约40pm、约30pm、约25pm、约20pm、约15pm、约10pm、约5pm或约1pm，优选地以等于或低于以下的kd值结合：100nm、90nm、80nm、75nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、2nm、1nm、900pm、800pm、700pm、600pm、500pm、400pm或300pm。在一个示例性实施方案中，重组蛋白质以等于或低于约100nm的kd值结合fap。在另一个示例性实施方案中，fap结合结构域以等于或低于约10nm的kd值结合fap。在另一个示例性实施方案中，重组蛋白质以等于或低于约1nm的kd值结合fap。在另一个示例性实施方案中，重组蛋白质以等于或低于约500pm的kd值结合fap。在一个优选的实施方案中，重组蛋白质以等于或低于约300pm的kd值结合fap。优选地，重组蛋白质具有seqidno:5的氨基酸序列。274.在某些实施方案中，fap是人fap(seqidno:52)。275.表1氨基酸取代276.初始残基保守取代示例性取代ala(a)valval；leu；ilearg(r)lyslys；gln；asnasn(n)glngln；his；asp、lys；argasp(d)gluglu；asncys(c)serser；alagln(q)asnasn；gluglu(e)aspasp；glngly(g)alaalahis(h)argasn；gln；lys；argile(i)leuleu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leu(l)ile正亮氨酸；ile；val；met；ala；phelys(k)argarg；gln；asnmet(m)leuleu；phe；ilephe(f)tyrleu；val；ile；ala；tyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyrtyr；phetyr(y)phetrp；phe；thr；serval(v)leuile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸277.3.4.cd40结合结构域278.本文所公开的重组蛋白质还利用cd40诱导的免疫细胞共刺激活性。279.本文所述的重组蛋白质包含特异性结合cd40的锚蛋白重复结构域，在本文中也称为“cd40结合结构域”。与cd40激动剂抗体类似，cd40结合结构域活化cd40/cd40l信号传导途径。本文所述的重组蛋白质还可包含不止一个cd40结合结构域，例如两个或三个或更多个cd40结合结构域。因此，本文所述的重组蛋白质可包含第一和第二cd40结合结构域，或第一、第二和第三cd40结合结构域。下文提供的实施方案描述了此类第一cd40结合结构域、第二cd40结合结构域和/或第三cd40结合结构域。优选地，本文所述的重组蛋白质包含两个cd40结合结构域，即第一cd40结合结构域和第二cd40结合结构域。280.在一些实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含seqidno:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:10具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:10具有至少90％同一性的氨基酸序列。在另一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含seqidno:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:43至50中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:43至50中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。在另一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含seqidno:43至50中的任一者的氨基酸序列。281.在一些实施方案中，相对于seqidno:3的序列进行不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:3的序列进行不超过5个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:3的序列进行不超过4个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:3的序列进行不超过3个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:3的序列进行不超过2个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:3的序列进行不超过1个取代。在一些实施方案中，与包含seqidno:3的序列的蛋白质的kd值相比，取代使kd值改变不超过1000倍、不超过100倍或不超过10倍。在某些实施方案中，取代是根据表1的保守取代。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基之外进行取代，例如在连接α-螺旋的β环中。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基内进行取代。例如，锚蛋白结构域或每个锚蛋白结合结构域可包含共有序列：xdxxgxtplhlaxxxgxxxivxvllxxgadvna(seqidno:23)，其中“x”表示任何氨基酸，优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸；或xdxxgxtplhlaxxxghleivevllkzgadvna(seqidno:24)，其中“x”表示任何氨基酸，优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸，并且“z”选自由天冬酰胺、组氨酸或酪氨酸组成的组。在一个实施方案中，对命名为“x”的残基进行取代。在另一个实施方案中，在命名为“x”的残基之外进行取代。282.此外，倒数第二位置可以是“a”(参见例如seqidno:3、10、43、44和48至50)或“l”(参见例如seqidno:45至47)，并且/或者最后位置可以是“a”(参见例如seqidno:3、10、43、44和48至50)或“n”(参见例如seqidno:45至47)。因此，在一些实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3、10、43、44和48至50中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3、10、43、44和48至50中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一些实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个优选的实施方案中，本文所述的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含seqidno:3的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一些实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:10、43、44和48至50中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:10、43、44和48至50中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在另一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含seqidno:10、43、44和48至50中的任一者的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。序列可任选地在其n末端包含g、s或gs(参见下文)。283.此外，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者还可任选地在其n末端包含“g”、“s”或“gs”序列(参见例如与seqidno:3相比的seqidno:50)。因此，在一些实施方案中，本文独立提供的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者(i)包含与seqidno:3、10和43至49中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且(ii)在其n末端还包含g、s或gs。在一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3、10和43至49中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。在一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含与seqidno:3、10和43至49中的任一者具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。在一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含seqidno:3、10和43至49中的任一者的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。同样因此，在一些实施方案中，本文提供的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含与seqidno:50具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中seqidno:50的位置1处的g和/或位置2处的s任选地缺失。284.因此，在一个特别优选的实施方案中，本文所述的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含seqidno:3的氨基酸序列，其中其n末端还任选地包含g、s或gs，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。285.在一些优选的实施方案中，本文所述的任一cd40结合结构域包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和/或位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。因此，在一些实施方案中，本文所述的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含(1)位置8处的q以及(2)位置143处的r和/或位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。在一些实施方案中，本文所述的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含(1)位置15处的l以及(2)位置143处的r和/或位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。在一些实施方案中，本文所述的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含(1)位置8处的q和位置15处的l以及(2)位置143处的r和/或位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。同样因此，在一些实施方案中，本文所述的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含(1)位置8处的q和/或位置15处的l以及(2)位置143处的r，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。在一些实施方案中，本文所述的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含(1)位置8处的q和/或位置15处的l以及(2)位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。.在一些实施方案中，本文所述的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含(1)位置8处的q和/或位置15处的l以及(2)位置143处的r和位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。在一些更优选的实施方案中，本文所述的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。286.此外，在甚至更优选的实施方案中，本文所述的cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置，导致所述cd40结合结构域的药代动力学与具有相同氨基酸序列但位置8、15、143和147处的氨基酸分别不同于q、l、r和q的cd40结合结构域相比得到改善，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。287.在某些实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者或包含cd40结合结构域的重组蛋白质与其靶标(即，cd40)之间的亲和力以kd描述。在示例性实施方案中，kd为约10-1m或更小、约10-2m或更小、约10-3m或更小、约10-4m或更小、约10-5m或更小、约10-6m或更小、约10-7m或更小、约10-8m或更小、约10-9m或更小、约10-10m或更小、约10-11m或更小、约10-12m或更小、约10-13m或更小、约10-14m或更小、约10-5m至约10-15m、约10-6m至约10-15m、约10-7m至约10-15m、约10-8m至约10-15m、约10-9m至约10-15m、约10-10m至约10-15m、约10-5m至约10-14m、约10-6m至约10-14m、约10-7m至约10-14m、约10-8m至约10-14m、约10-9m至约10-14m、约10-10m至约10-14m、约10-5m至约10-13m、约10-6m至约10-13m、约10-7m至约10-13m、约10-8m至约10-13m、约10-9m至约10-13m、约10-10m至约10-13m。288.在示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地以等于或低于以下的kd值结合cd40：约100nm、约90nm、约80nm、约75nm、约60nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm、约10nm、约5nm、约2nm、约1nm、约900pm、约800pm、约700pm、约600pm、约500pm、约400pm、约300pm、约250pm、约200pm、约150pm、约100pm、约50pm、约40pm、约30pm、约25pm、约20pm、约15pm、约10pm、约5pm或约1pm，优选地以等于或低于以下的kd值结合：100nm、90nm、80nm或75nm。在一个示例性实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地以等于或低于约100nm的kd值结合cd40。在一个优选的实施方案中，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者独立地以等于或低于约75nm的kd值结合cd40。优选地，cd40结合结构域或所述cd40结合结构域中的每一者具有seqidno:3的氨基酸序列。289.在示例性实施方案中，包含两个cd40结合结构域的重组蛋白质以等于或低于以下的kd值结合cd40：约100nm、约90nm、约80nm、约75nm、约60nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm、约10nm、约5nm、约2nm、约1nm、约900pm、约800pm、约700pm、约600pm、约500pm、约400pm、约300pm、约250pm、约200pm、约150pm、约100pm、约50pm、约40pm、约30pm、约25pm、约20pm、约15pm、约10pm、约5pm或约1pm，优选地以等于或低于以下的kd值结合：100nm、90nm、80nm、75nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、2nm、1nm、900pm、800pm、700pm、600pm、500pm、400pm、300pm、250pm、200pm、150pm、140pm、130pm、120pm、115pm、110pm、105pm或100pm。在一个示例性实施方案中，重组蛋白质以等于或低于约100nm的kd值结合cd40。在另一个示例性实施方案中，重组蛋白质以等于或低于约1nm的kd值结合cd40。在另一个示例性实施方案中，重组蛋白质以等于或低于约500pm的kd值结合cd40。在一个优选的实施方案中，重组蛋白质以等于或低于约100pm的kd值结合cd40。优选地，重组蛋白质具有seqidno:5的氨基酸序列。290.在一些实施方案中，优选两个或更多个cd40结合结构域，以进一步促进cd40聚集和免疫细胞共刺激。据报道，cd40配体作为三聚体与免疫细胞上的cd40结合。然而，单独的三聚反应不足以活化cd40信号传导途径。cd40的活化需要更高阶的聚集。如本文所述，通过fap结合，多特异性分子已促进肿瘤环境中的cd40聚集。为了进一步促进cd40聚集，可使用两个或更多个cd40结合结构域，以在细胞表面上产生“交联”效应。例如，如图4所示，单价cd40结合物(fc)足以活化cd40途径。更高的效力可通过使用两个cd40结合结构域(fcc)或三个cd40结合结构域(fccc)来实现。图4还示出了两个cd40结合结构域足以高效活化cd40途径，并且不必具有三个cd40结合结构域来进行有效的cd40聚集。291.在某些实施方案中，cd40是人cd40(seqidno:51)。292.3.5.半衰期延长部分293.与不具有半衰期延长部分的相同蛋白质相比，“半衰期延长部分”延长了本文所述的重组蛋白质的体内血清半衰期。半衰期延长部分的示例包括但不限于多组氨酸、glu-glu、谷胱甘肽s转移酶(gst)、硫氧还蛋白、蛋白质a、蛋白质g、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白质(mbp)、人血清白蛋白(hsa)结合结构域或聚乙二醇(peg)。294.在一些实施方案中，本文所述的重组多特异性蛋白质包含特异性结合血清白蛋白的锚蛋白重复结构域，在本文也称为“血清白蛋白结合结构域”。本文所述的重组蛋白质还可包含不止一个血清白蛋白结合结构域，例如两个或三个或更多个血清白蛋白结合结构域。因此，本文所述的重组蛋白质可包含第一和第二血清白蛋白结合结构域，或第一、第二和第三血清白蛋白结合结构域。下文提供的实施方案描述了此类第一血清白蛋白结合结构域、第二血清白蛋白结合结构域和/或第三血清白蛋白结合结构域。优选地，本文所述的重组蛋白质仅包含一个血清白蛋白结合结构域。295.在一些实施方案中，本文所述的血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:1具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，本文所述的血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:1具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，本文所述的血清白蛋白结合结构域包含seqidno:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:39至42中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，本文所述的血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:39至42中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。在另一个示例性实施方案中，本文所述的血清白蛋白结合结构域包含seqidno:39至42中的任一者的氨基酸序列。296.在一些实施方案中，相对于seqidno:1的序列进行不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:1的序列进行不超过5个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:1的序列进行不超过4个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:1的序列进行不超过3个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:1的序列进行不超过2个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:1的序列进行不超过1个取代。在一些实施方案中，与包含seqidno:1的序列的蛋白质的kd值相比，取代使kd值改变不超过1000倍、不超过100倍或不超过10倍。在某些实施方案中，取代是根据表1的保守取代。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基之外进行取代，例如在连接α-螺旋的β环中。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基内进行取代。例如，锚蛋白结构域可包含共有序列：xdxxgxtplhlaxxxgxxxivxvllxxgadvna(seqidno:23)，其中“x”表示任何氨基酸，优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸；或xdxxgxtplhlaxxxghleivevllkzgadvna(seqidno:24)，其中“x”表示任何氨基酸，优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸，并且“z”选自由天冬酰胺、组氨酸或酪氨酸组成的组。在一个实施方案中，对命名为“x”的残基进行取代。在另一个实施方案中，在命名为“x”的残基之外进行取代。297.此外，倒数第二位置可以是“a”(参见例如seqidno:1、39、40和42)或“l”(参见例如seqidno:41)，并且/或者最后位置可以是“a”(参见例如seqidno:1、39、40和42)或“n”(参见例如seqidno:1)。因此，在一些实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:1、39、40和42中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:1、39、40和42中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一些实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:1具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个优选的实施方案中，本文所述的血清白蛋白结合结构域包含seqidno:1的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一些实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:39、40和42中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:39、40和42中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。在另一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含seqidno:39、40和42中的任一者的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。序列可任选地在其n末端包含g、s或gs(参见下文)。298.此外，血清白蛋白结合结构域还可任选地在其n末端包含“g”、“s”或“gs”序列(参见例如与seqidno:42相比的seqidno:1)因此，在一些实施方案中，本文提供的血清白蛋白结合结构域(i)包含与seqidno:42具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且(ii)在其n末端还包含g、s或gs。在一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:42具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。在一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:42具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。在一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含seqidno:42的氨基酸序列，并且在其n末端还包含g、s或gs。同样因此，在一些实施方案中，本文提供的血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:1和39至41中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中seqidno:1和39至41中的任一者的位置1处的g和/或位置2处的s任选地缺失。在一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与seqidno:1和39至41中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中seqidno:1和39至41中的任一者的位置1处的g和/或位置2处的s任选地缺失。299.因此，在一个特别优选的实施方案中，本文所述的血清白蛋白结合结构域包含seqidno:1的氨基酸序列，其中位置1处的g和/或位置2处的s任选地缺失，并且其中任选地，倒数第二位置处的a被l取代并且/或者最后位置处的a被n取代。300.在某些实施方案中，血清白蛋白结合结构域或包含血清白蛋白结合结构域的重组蛋白质与其靶标(即，血清白蛋白)之间的亲和力以kd描述。在示例性实施方案中，kd为约10-1m或更小、约10-2m或更小、约10-3m或更小、约10-4m或更小、约10-5m或更小、约10-6m或更小、约10-7m或更小、约10-8m或更小、约10-9m或更小、约10-10m或更小、约10-11m或更小、约10-12m或更小、约10-13m或更小、约10-14m或更小、约10-5m至约10-15m、约10-6m至约10-15m、约10-7m至约10-15m、约10-8m至约10-15m、约10-9m至约10-15m、约10-10m至约10-15m、约10-5m至约10-14m、约10-6m至约10-14m、约10-7m至约10-14m、约10-8m至约10-14m、约10-9m至约10-14m、约10-10m至约10-14m、约10-5m至约10-13m、约10-6m至约10-13m、约10-7m至约10-13m、约10-8m至约10-13m、约10-9m至约10-13m、约10-10m至约10-13m。301.在示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域以等于或低于以下的kd值结合血清白蛋白：约100nm、约90nm、约80nm、约75nm、约60nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm、约10nm、约5nm、约2nm、约1nm、约900pm、约800pm、约700pm、约600pm、约500pm、约400pm、约300pm、约250pm、约200pm、约150pm、约100pm、约50pm、约40pm、约30pm、约25pm、约20pm、约15pm、约10pm、约5pm或约1pm，优选地以等于或低于以下的kd值结合：100nm、90nm、80nm、75nm、70nm、60nm、50nm、40nm或35nm。在一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域以等于或低于约100nm的kd值结合血清白蛋白。在另一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域以等于或低于约50nm的kd值结合血清。在一个优选的实施方案中，血清白蛋白结合结构域以等于或低于约35pm的kd值结合血清白蛋白。优选地，血清白蛋白结合结构域具有seqidno:1的氨基酸序列。302.在示例性实施方案中，包含血清白蛋白结构域的重组蛋白质以等于或低于以下的kd值结合血清白蛋白：约100nm、约90nm、约80nm、约75nm、约60nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm、约10nm、约5nm、约2nm、约1nm、约900pm、约800pm、约700pm、约600pm、约500pm、约400pm、约300pm、约250pm、约200pm、约150pm、约100pm、约50pm、约40pm、约30pm、约25pm、约20pm、约15pm、约10pm、约5pm或约1pm，优选地以等于或低于以下的kd值结合：100nm、90nm、80nm、75nm、70nm、60nm或50nm。在一个示例性实施方案中，重组蛋白质以等于或低于约100nm的kd值结合血清白蛋白。在另一个示例性实施方案中，重组蛋白质以等于或低于约75nm的kd值结合血清白蛋白。在一个优选的实施方案中，重组蛋白质以等于或低于约50nm的kd值结合血清白蛋白。优选地，重组蛋白质具有seqidno:5的氨基酸序列。303.在某些实施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白(seqidno:53)。304.在一些实施方案中，半衰期延长部分包含免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白结构域包含fc结构域。在一些实施方案中，fc结构域来源于以下已知重链同种型中的任一者：igg(γ)、igm(μ)、igd(δ)、ige(ε)或iga(α)。在一些实施方案中，fc结构域来源于以下已知的重链同种型或亚型中的任一者：igg1(γ1)、igg2(γ2)、igg3(γ3)、igg4(γ4)、iga1(α1)、iga2(α2)。在一些实施方案中，fc结构域是人igg1的fc结构域。305.在一些实施方案中，fc结构域包含fc结构域的不间断天然序列(即野生型序列)。在一些实施方案中，免疫球蛋白fc结构域包含导致改变的生物活性的变体fc结构域。例如，可将至少一个点突变或缺失引入fc结构域中以便降低或消除效应子活性(例如国际专利公布wo2005/063815)，以及/或者增加重组蛋白质产生期间的同质性。在一些实施方案中，fc结构域是人igg1的fc结构域并且包含以下效应子空取代中的一者或多者：l234a、l235a和g237a(eu编号)。在一些实施方案中，fc结构域不包含位于人igg1的c末端位置处的赖氨酸(即，由eu编号的k447)。不存在赖氨酸可增加重组蛋白质产生期间的同质性。在一些实施方案中，fc结构域包含位于c末端位置处的赖氨酸(k447，eu编号)。306.3.6.接头307.本文所述的重组蛋白质可包含接头。“接头”是使两个单独的实体(例如，fap结合结构域和cd40结合结构域)彼此结合并且可在两个实体之间提供间距和灵活性使得它们能够实现其中它们例如特异性结合它们的相应靶标(例如，fap和cd40)的构象的分子或分子组。蛋白质接头是特别优选的，并且可使用本领域熟知的标准重组dna技术将它们表达为重组蛋白质的组分。308.锚蛋白重复结构域可例如通过二硫键、多肽键或交联剂共价连接；或非共价地产生异源二聚体蛋白质。重组蛋白质可以在任何结合结构域(包括fap和cd40结合结构域)之间以及在任何结合结构域与任选的半衰期延长部分(其本身也可以是结合结构域)之间包含接头。309.在一些实施方案中，接头是肽基接头。在一些实施方案中，肽基接头包含约1个至30个氨基酸残基。示例性接头包括例如富含甘氨酸的肽；包含甘氨酸和丝氨酸的肽；具有序列[gly-gly-ser]n的肽，其中n为1、2、3、4、5或6；或者具有序列[gly-gly-gly-gly-ser]n(seqidno:56)的肽，其中n为1、2、3、4、5或6。富含甘氨酸的肽接头包含肽接头，其中至少25％的残基是甘氨酸。富含甘氨酸的肽接头是本领域熟知的(例如，chichili等人proteinsci.2013年2月；22(2):153-167)。[0310]在一些实施方案中，肽基接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个示例性实施方案中，接头是seqidno:4的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。[0311]在一些实施方案中，接头包含seqidno:4的氨基酸序列。[0312]3.7.fap/cd40双靶向双特异性或多特异性分子[0313]本发明的多特异性分子包含本文所述的结合结构域和任选的接头的任何种类的组合。也就是说，上文在第3.3至3.6节中所述的结构域和接头中的任一者可以组合在本发明的多特异性分子中。此外，本发明的多特异性分子的结合结构域可包含上文在第3.2节中所述的n末端封端模块和/或c末端封端模块中的任一者。[0314]在一些实施方案中，本发明的重组蛋白质从n末端到c末端包含：(i)特异性结合血清白蛋白的第一锚蛋白重复结构域，(ii)特异性结合fap的第二锚蛋白重复结构域，(iii)特异性结合cd40的第三锚蛋白重复结构域，以及(iv)特异性结合cd40的第四锚蛋白重复结构域。所述第一锚蛋白重复结构域可以是如上文在第3.5节中所述的血清白蛋白结合结构域中的任一种，所述第二锚蛋白重复结构域可以是如上文在第3.3节中所述的fap结合结构域中的任一种，并且所述第三锚蛋白重复结构域和第四锚蛋白重复结构域可以是如上文在第3.4节中所述的cd40结合结构域中的任一种。第三锚蛋白重复结构域和第四锚蛋白重复结构域可具有相同的序列，或者可具有不同的序列。[0315]在一些优选的实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质从n末端到c末端包含：(血清白蛋白结合结构域)-(接头)-(fap结合结构域)-(接头)-(cd40结合结构域)-(接头)-(cd40结合结构域)，其中接头优选地包含seqidno:4的氨基酸序列。[0316]在某些实施方案中，本发明的重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中，本发明的重组蛋白质包含seqidno:5的氨基酸序列。[0317]在某些实施方案中，相对于seqidno:5的四个结合结构域中的任一个结合结构域进行不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:5的四个结合结构域中的任一个结合结构域进行不超过10个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:5的四个结合结构域中的任一个结合结构域进行不超过5个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:5的四个结合结构域中的任一个结合结构域进行不超过4个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:5的四个结合结构域中的任一个结合结构域进行不超过3个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:5的四个结合结构域中的任一个结合结构域进行不超过2个取代。在一些实施方案中，相对于seqidno:5的四个结合结构域中的任一个结合结构域进行不超过1个取代。在一些实施方案中，与包含seqidno:5的序列的蛋白质的kd值相比，取代使fap结合或cd40结合或血清白蛋白结合的kd值改变不超过1000倍、不超过100倍或不超过10倍。在某些实施方案中，取代是根据表1的保守取代。[0318]在某些实施方案中，本发明的重组蛋白质包含与seqidno:6具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。[0319]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质在pbs中以低于10-8m、低于10-9m、低于5×10-10m、低于3×10-10m或低于2×10-10m的解离常数(kd)结合人cd40。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人cd40。[0320]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质在pbs中以低于10-8m、低于10-9m、低于5×10-10m或低于3×10-10m的解离常数(kd)结合人fap。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人fap。[0321]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质在pbs中以低于10-7m、低于7×10-8m或低于5×10-8m的解离常数(kd)结合人血清白蛋白。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白质在pbs中以低于10-7m的解离常数(kd)结合人血清白蛋白。[0322]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质在pbs中以低于10-8m、低于10-9m、低于5×10-10m、低于3×10-10m或低于2×10-10m的解离常数(kd)结合人cd40，并且/或者该重组蛋白质在pbs中以低于10-8m、低于10-9m、低于5×10-10m或低于3×10-10m的解离常数(kd)结合人fap。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人cd40，并且该重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人fap。[0323]在某些实施方案中，本发明的重组蛋白质在pbs中以低于10-8m、低于10-9m、低于5×10-10m、低于3×10-10m或低于2×10-10m的解离常数(kd)结合人cd40，并且/或者该重组蛋白质在pbs中以低于10-8m、低于10-9m、低于5×10-10m或低于3×10-10m的解离常数(kd)结合人fap，并且/或者该重组蛋白质在pbs中以低于10-7m、低于7×10-8m或低于5×10-8m的解离常数(kd)结合人血清白蛋白。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人cd40，并且该重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人fap。在一个更优选的实施方案中，本发明的重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人cd40，并且该重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人fap，并且该重组蛋白质在pbs中以低于10-7m的解离常数(kd)结合人血清白蛋白。[0324]在某些优选的实施方案中，本发明的重组结合蛋白能够同时结合fap、cd40和血清白蛋白，其中优选地，通过表面等离振子共振(spr)测量所述同时结合，进一步优选地如实施例3所述。[0325]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质在结合fap和cd40时诱导b细胞的活化。在某些实施方案中，b细胞是人b细胞。在某些实施方案中，通过测量共刺激分子诸如cd86和cd69的表达的体外b细胞活化测定来评估多特异性重组蛋白质的生物活性。据报道，这些共刺激分子(cd86和cd69)在b细胞中的表达增加指示cd40活化。[0326]在某些实施方案中，在表达fap的cho细胞的存在下，本发明的多特异性重组蛋白质活化表达cd40的b细胞中的人cd40，其中ec50值为约10-8m或更小、或约10-9m或更小。[0327]在某些实施方案中，多特异性重组蛋白质具有如通过体外b细胞活化测定所评估的不超过约100nm、不超过约75nm、不超过约65nm、不超过约55nm、不超过约45nm、不超过约35nm、不超过约25nm、不超过约15nm、不超过约10nm、不超过约5nm、不超过约4nm、不超过约3nm、不超过约2nm、不超过约1nm、不超过约0.1nm、约0.01nm至约50nm、约0.01nm至约25nm、约0.01nm至约10nm、约0.01nm至约5nm、约0.01nm至约1nm、约0.01nm至约0.1nm、约0.01nm至约0.07nm、约0.04nm至约50nm、约0.04nm至约25nm、约0.04nm至约10nm、约0.04nm至约5nm、约0.04nm至约1nm、约0.04nm至约0.1nm、约0.04nm至约0.07nm、约0.1nm至约50nm、约0.1nm至约25nm、约0.1nm至约10nm、约0.1nm至约5nm、约0.1nm至约1nm、约0.1nm至约0.9nm、约0.1nm至约0.85nm、约0.18nm至约0.85nm的半最大有效浓度(ec50)。[0328]在一个示例性实施方案中，多特异性重组蛋白质具有如通过体外b细胞活化测定所评估的不超过约10nm的ec50。在另一个示例性实施方案中，多特异性重组蛋白质具有如通过体外b细胞活化测定所评估的不超过约1nm的ec50。在另一个示例性实施方案中，多特异性重组蛋白质具有如通过体外b细胞活化测定所评估的约0.01nm至约10nm、优选地约0.1nm至约1.0nm或约0.18nm至约0.85nm的ec50。在另一个示例性实施方案中，多特异性重组蛋白质具有如通过体外b细胞活化测定所评估的约0.01nm至约0.1nm、优选地约0.04nm至约0.07nm的ec50。[0329]在某些实施方案中，b细胞活化测定是人b细胞活化测定。在一个示例性实施方案中，根据制造商的说明书，使用graphpadprism(第8.1.2版)测量ec50。在一个示例性实施方案中，通过使用graphpadprism软件将数据与四参数逻辑拟合模型进行拟合来确定ec50值。在一个示例性实施方案中，使用实施例中所述的方法确定ec50值。[0330]在某些实施方案中，多特异性重组蛋白质在小鼠模型中具有至少10小时、至少20小时、至少30小时、至少40小时或约44小时的终末半衰期。在某些实施方案中，多特异性重组蛋白质在食蟹猴模型中具有至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或约2.8天或约4.5天的终末半衰期。[0331]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质能够在表达fap的mc38结肠癌小鼠模型中抑制肿瘤生长。在一个实施方案中，本发明的重组蛋白质能够在表达fap的mc38结肠癌小鼠模型中用实施例6所述的处理条件抑制肿瘤生长。[0332]在某些实施方案中，多特异性重组蛋白质不抑制fap蛋白酶活性。在某些实施方案中，在多特异性重组蛋白质的存在下，与对照相比(对照可以是不存在多特异性重组蛋白质的fap蛋白酶活性)，fap蛋白酶活性降低不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过9％、不超过8％，不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％或不超过2％。在一个示例性实施方案中，使用如实施例7中举例说明的方法测量fap活性。[0333]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含两个cd40结合结构域，其中所述cd40结合结构域之一或所述cd40结合结构域中的每一者独立地包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和/或位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。在一个优选的实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含两个cd40结合结构域，其中所述两个cd40结合结构域中的每一者包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。[0334]在一个实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且还具有以下特性中的任一种或任何组合：(i)重组蛋白质在pbs中以低于10-8m、低于10-9m、低于5×10-10m、低于3×10-10m或低于2×10-10m的解离常数(kd)结合人cd40；(ii)重组蛋白质在pbs中以低于10-8m、低于10-9m、低于5×10-10m或低于3×10-10m的解离常数(kd)结合人fap；(iii)重组蛋白质在pbs中以低于10-7m、低于7×10-8m或低于5×10-8m的解离常数(kd)结合人血清白蛋白；(iv)在表达fap的cho细胞的存在下，重组蛋白质活化表达cd40的b细胞中的人cd40，其中ec50值为约10-8m或更小、或约10-9m或更小；(v)重组结合蛋白能够同时结合fap、cd40和血清白蛋白；(vi)重组蛋白质不抑制fap蛋白酶活性，或者在重组蛋白质的存在下，fap蛋白酶活性的降低不超过25％、不超过20％、不超过15％或不超过10％；(vii)重组蛋白质在小鼠模型中具有至少10小时、至少20小时、至少30小时、至少40小时或约44小时的终末半衰期；(viii)重组蛋白质在食蟹猴模型中具有至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或约2.8天或约4.5天的终末半衰期；(ix)重组蛋白质能够在表达fap的mc38结肠癌小鼠模型中抑制肿瘤生长；以及(x)两个cd40结合结构域之一或所述两个cd40结合结构域中的每一者独立地包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和/或位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置，或者更优选地，所述两个cd40结合结构域中的每一者包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。[0335]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人cd40，并且/或者在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人fap。[0336]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人cd40，在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人fap，并且在pbs中以低于10-7m的解离常数(kd)结合人血清白蛋白。[0337]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在表达fap的cho细胞的存在下活化表达cd40的b细胞中的人cd40，其中ec50值为约10-8m或更小、或约10-9m或更小。[0338]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性并且能够同时结合人cd40、人fap和人血清白蛋白的氨基酸序列；其中优选地，所述同时结合通过表面等离振子共振(spr)来测量，进一步优选地如实施例3所述。[0339]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述重组蛋白质不抑制fap蛋白酶活性，或者在重组蛋白质的存在下，fap蛋白酶活性的降低不超过25％、不超过20％、不超过15％或不超过10％。[0340]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在小鼠模型中具有至少10小时、至少20小时、至少30小时、至少40小时或约44小时的终末半衰期。[0341]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在食蟹猴模型中具有至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或约2.8天或约4.5天的终末半衰期。[0342]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述重组蛋白质能够在表达fap的mc38结肠癌小鼠模型中抑制肿瘤生长；其中优选地，如实施例6所述测量所述肿瘤抑制。[0343]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中两个cd40结合结构域之一或所述两个cd40结合结构域中的每一者独立地包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和/或位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。在某些优选的实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述两个cd40结合结构域中的每一者包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。[0344]在一个实施方案中，本发明的重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述重组蛋白质以等于或低于100nm的kd值结合人fap、人cd40和人血清白蛋白，并且其中所述重组蛋白质在食蟹猴模型中具有至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、或约2.8天、或约4.5天的终末半衰期。[0345]在一个实施方案中，本发明的重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述重组蛋白质以等于或低于100nm的kd值结合人fap、人cd40和人血清白蛋白，并且其中在所述重组蛋白质的存在下，与对照相比，fap蛋白酶活性降低不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％或不超过2％，其中典型地且优选地，所述对照是在不存在所述重组蛋白质的情况下的fap蛋白酶活性，并且其中进一步典型地且优选地，所述fap蛋白酶活性如实施例7所述进行测量。[0346]在一个实施方案中，本发明的重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述重组蛋白质以等于或低于100nm的kd值结合人fap、人cd40和人血清白蛋白，并且其中所述重组蛋白质在食蟹猴模型中具有至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或约2.8天或约4.5天的终末半衰期，并且其中在所述重组蛋白质的存在下，与对照相比，fap蛋白酶活性降低不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％或不超过2％，其中典型地且优选地，所述对照是在不存在所述重组蛋白质的情况下的fap蛋白酶活性，并且其中进一步典型地且优选地，所述fap蛋白酶活性如实施例7所述进行测量。[0347]在某些实施方案中，本发明的多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中所述蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人cd40；其中所述蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)结合人fap；其中在表达fap的cho细胞的存在下，所述蛋白质活化表达cd40的b细胞中的人cd40，其中ec50值为约10-8m或更小；其中所述蛋白质能够同时结合fap和cd40；其中所述蛋白质不抑制fap蛋白酶活性，或者在重组蛋白质的存在下，fap蛋白酶活性的降低不超过25％；其中所述蛋白质在小鼠模型中具有至少10小时的终末半衰期。[0348]在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含特异性结合血清白蛋白的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合成纤维细胞活化蛋白质(fap)的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合cd40的第三锚蛋白重复结构域和特异性结合cd40的第四锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从n末端到c末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(接头)-(fap结合结构域)-(接头)-(cd40结合结构域)-(接头)-(cd40结合结构域)，并且其中所述重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)特异性结合人fap，并且其中所述重组蛋白质在pbs中以低于10-9m的解离常数(kd)特异性结合人cd40，并且其中所述重组蛋白质在pbs中以低于10-7m的解离常数(kd)特异性结合人血清白蛋白，并且其中所述fap结合结构域是第3.3节中所述的fap结合结构域中的任一种，并且其中所述两个cd40结合结构域中的每一者独立地是第3.4节中所述的cd40结合结构域中的任一种，并且其中所述血清白蛋白结合结构域是第3.5节中所述的血清白蛋白结合结构域中的任一种，并且其中所述接头是第3.6节中所述的接头中的任一种。在某些实施方案中，所述多特异性重组蛋白质能够同时结合人cd40、人fap和人血清白蛋白；其中优选地，所述同时结合通过表面等离振子共振(spr)来测量，进一步优选地如实施例3所述。在某些实施方案中，在表达fap的cho细胞的存在下，重组蛋白质活化表达cd40的b细胞中的人cd40，其中ec50值为约10-8m或更小。在某些实施方案中，所述多特异性重组蛋白质不抑制fap蛋白酶活性，或者在重组蛋白质的存在下，fap蛋白酶活性的降低不超过25％。在某些实施方案中，所述多特异性重组蛋白质在小鼠模型中具有至少20小时的终末半衰期。在某些实施方案中，所述多特异性重组蛋白质在食蟹猴模型中具有至少3天的终末半衰期。在某些实施方案中，所述多特异性重组蛋白质能够在表达fap的mc38结肠癌小鼠模型中抑制肿瘤生长；其中所述肿瘤生长抑制优选地如实施例6所述进行测量。在某些实施方案中，所述多特异性重组蛋白质的所述两个cd40结合结构域之一或所述两个cd40结合结构域中的每一者独立地包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和/或位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。在某些实施方案中，所述多特异性重组蛋白质的所述两个cd40结合结构域中的每一者包含位置8处的q、位置15处的l、位置143处的r和位置147处的q，其中位置编号对应于seqidno:3中的位置。在某些实施方案中，所述多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述多特异性重组蛋白质包含与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述多特异性重组蛋白质包含多肽，其中所述多肽具有与seqidno:5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述多特异性重组蛋白质包含多肽，其中所述多肽具有与seqidno:5具有至少90％同一性的氨基酸序列。[0349]3.8.核酸和生产多特异性蛋白质的方法[0350]本公开还提供了编码本文所述的重组蛋白质的多核苷酸。本公开还提供了制备本文所述的任何多核苷酸的方法。本公开还提供了通过所述方法获得的重组蛋白质。可通过本领域已知的方法生成和表达多核苷酸。[0351]在一个方面，本公开提供了多核苷酸或包含编码重组多特异性蛋白质的多核苷酸的组合物，其中sad蛋白值包含特异性结合成纤维细胞活化蛋白质(fap)的第一锚蛋白重复结构域和特异性结合cd40的第二锚蛋白重复结构域，以及任选地半衰期延长部分。[0352]在一个方面，本公开提供了多核苷酸或包含多核苷酸的组合物，所述多核苷酸包含编码包含seqidno:1、2、3和/或4的重组蛋白质的核酸序列。在一个方面，本公开提供了多核苷酸或包含多核苷酸的组合物，所述多核苷酸包含编码包含seqidno:5或6的重组蛋白质的核酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了包含seqidno:58的核酸序列的核酸。[0353]另一方面，本公开提供了编码重组蛋白质的多核苷酸及其变体，其中此类变体多核苷酸与本文所公开的任何核酸(诸如包含seqidno:58的核酸序列的核酸)共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。[0354]另一方面，本公开提供了编码重组蛋白质的多核苷酸及其变体，其中此类变体多核苷酸能够在高严格条件下与seqidno:58的序列杂交。“高严格条件”包括以下那些条件：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如在50℃下0.015m氯化钠/0.0015m柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间使用变性剂，诸如在42℃下的甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mm磷酸钠缓冲液，ph6.5，750mm氯化钠，75mm柠檬酸钠；或者(3)在42℃下采用50％甲酰胺、5×ssc(0.75mnacl，0.075m柠檬酸钠)、50mm磷酸钠(ph6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×denhardt's溶液、超声处理的鲑精dna(50pg/ml)、0.1％sds和10％硫酸葡聚糖，在42℃下在0.2×ssc(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中在55℃下洗涤，然后在55℃下进行由含有edta的0.1×ssc组成的高严格度洗涤。[0355]本公开还涵盖与任何此类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是dna(重组的、cdna或合成的)或rna分子。rna分子包括hnrna分子和mrna分子，该hnrna分子包含内含子并且以一对一的方式对应于dna分子，该mrna分子不包含内含子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接至其他分子和/或载体材料。[0356]本领域普通技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码包含如本文所述的氨基酸序列的重组蛋白质(或其单独结构域)的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。本公开特别设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。[0357]本公开还包括经密码子优化的多核苷酸，其中核酸序列已被优化以使在特定细胞中的表达最大化。一般来讲，密码子优化是指通过用在该宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换原始序列的至少一个密码子(例如，约或超过约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个密码子)同时保持原有的氨基酸序列来修饰核酸序列以增强在所关注的宿主细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定偏倚性。密码子偏倚性(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使rna(mrna)的翻译效率相关，这继而据信取决于所翻译密码子的特性以及特定转运rna(trna)分子的可用性等。所选的trna在细胞中的优势通常是在肽合成中最频繁使用的密码子的反映。因此，可基于密码子优化对基因进行定制以在给定生物体中进行最佳基因表达。密码子使用表是易得的，并且这些表可以多种方式修改(例如，nakamura,y.等人“codonusagetabulatedfromtheinternationaldnasequencedatabases:statusfortheyear2000”nucl.acidsres.28:292(2000))。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可用的，诸如geneforge(aptagen；jacobus,pa.)也是可用的。在一些实施方案中，编码重组蛋白质的序列中的一个或多个密码子(例如1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、50个或更多个密码子，或所有密码子)对应于特定氨基酸的最常用密码子。[0358]合适的克隆载体可根据标准技术构建，或者可选自本领域可用的大量克隆载体。虽然所选的克隆载体可根据旨在使用的宿主细胞而变化，但有用的克隆载体将通常具有自我复制的能力，可具有特定限制性内切核酸酶的单个靶标，并且/或者可携带可用于选择含有该载体的克隆的标记物的基因。合适的示例包括质粒和细菌病毒，例如puc18、puc19、bluescript(例如pbssk+)及其衍生物、mp18、mp19、pbr322、pmb9、cole1、pcr1、rp4、噬菌体dna和穿梭载体诸如psa3和pat28。这些和许多其他克隆载体可购自商业供应商诸如biorad、strategene和invitrogen。[0359]还提供了表达载体。表达载体通常是含有根据本公开的多核苷酸的可复制多核苷酸构建体。这暗示了表达载体必须作为附加体或作为染色体dna的整体部分在宿主细胞中可复制。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、粘粒)和pct公开wo87/04462中公开的表达载体。载体组分通常可包括但不限于以下中的一者或多者：信号序列；复制起点；一个或多个标记基因；合适的转录控制元件(诸如启动子、增强子和终止子)。对于表达(即翻译)，通常还需要一个或多个翻译控制元件，诸如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。[0360]可通过多种适当的手段中的任一者将含有所关注的多核苷酸和/或多核苷酸本身的载体引入宿主细胞中，这些手段包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂转染；以及感染(例如，其中载体是感染原，诸如牛痘病毒)。引入载体或多核苷酸的选择通常将取决于宿主细胞的特征。[0361]示例性宿主细胞包括大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞。在本领域熟知的许多细胞中，优选的宿主细胞包括大肠杆菌细胞、cho细胞、人胚肾(hek)293细胞或sp2.0细胞。[0362]4.治疗方法[0363]本文所述的重组蛋白质可用于例如治疗患有医学病症例如癌症的受试者。[0364]本公开提供了一种治疗医学病症的方法，该方法包括向对有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的重组蛋白质、核酸或药物组合物。在某些实施方案中，受试者是人。在优选的实施方案中，医学病症是癌症。在某些实施方案中，癌症是实体瘤。在某些实施方案中，癌细胞表达fap。在某些实施方案中，肿瘤基质细胞表达fap。[0365]在一些实施方案中，癌症是脑癌、膀胱癌、乳腺癌、透明细胞肾癌、宫颈癌、结肠癌和直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、头颈鳞状细胞癌、唇癌、口腔癌、肝癌、宫颈癌、肺鳞状细胞癌、黑素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、非黑素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、尿道上皮癌、肉瘤、小细胞肺癌(sclc)、头颈鳞状细胞癌(scchn)、三阴性乳腺癌或甲状腺癌。[0366]在一些实施方案中，癌症是肾上腺皮质肿瘤、肺泡状软组织肉瘤、恶性肿瘤、软骨肉瘤、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、内胚窦瘤、上皮样血管内皮细胞瘤、尤文肉瘤、生殖细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾瘤、成神经细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(nrsts)、骨肉瘤、椎旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤或wilms瘤。[0367]在一些实施方案中，癌症是急性淋巴母细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)或慢性髓性白血病(cml)。[0368]在一些实施方案中，癌症是弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(hl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、多发性骨髓瘤(mm)、骨髓增生异常综合征(mds)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)。[0369]实际上，可治疗的癌症包括但不限于肺泡横纹肌肉瘤、骨癌、肛门肛管或肛肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈部胆囊或胸膜癌、鼻部鼻腔或中耳癌、口腔癌、外阴癌、食管癌、胃肠类癌肿瘤、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、腹膜网膜和肠系膜癌、咽癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、输尿管癌和膀胱癌。[0370]在特定方面，癌症选自头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和食管癌、胰腺癌、胃肠道癌、胃癌、乳腺癌、子宫内膜癌和结肠直肠癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、肺癌和细支气管肺泡癌。[0371]在某些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(nsclc)、头颈癌、肾癌、三阴性乳腺癌或胃癌。在某些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌(sclc)、头颈癌、肾癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、淋巴瘤或白血病。在某些实施方案中，癌症是脑癌。[0372]本文所述的重组蛋白质可在外科手术之前或之后用于去除肿瘤，并且可在放射疗法之前、期间或之后使用。重组蛋白质可用于治疗足够大以通过触诊或通过本领域熟知的成像技术(诸如mri、超声或cat扫描)发现的肿瘤。在一些实施方案中，重组蛋白质用于治疗晚期肿瘤，该晚期肿瘤具有至少约200mm3、300mm3、400mm3、500mm3、750mm3或至多1000mm3的尺寸。[0373]5.药物组合物和施用[0374]另一方面，本公开还提供了包含本文所述的重组多特异性蛋白质的药物组合物。[0375]药物组合物可包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。标准药物载体包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水或水/油乳液以及各种类型的润湿剂。[0376]药物组合物可包含任何药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气溶胶抛射剂、空气置换剂、碱化剂、抗结块剂、抗凝剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、防腐剂、碱、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、涂层剂、着色剂、干燥剂、洗涤剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解增强剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳液稳定剂、填料、成膜剂、风味增强剂、调味剂、流动增强剂、胶凝剂、粒化剂、湿润剂、润滑剂、黏膜粘附剂、膏剂基料、膏剂、含油溶媒、有机基料、锭剂基料、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、多价螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基料、界面活性剂、表面活性剂、悬浮剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张度剂、毒性剂、增粘剂、吸水剂、水混溶性共溶剂、水软化剂或润湿剂。参见例如handbookofpharmaceuticalexcipients，第三版，a.h.kibbe(pharmaceuticalpress,london,uk,2000)。remington’spharmaceuticalsciences，第十六版，e.w.martin(mackpublishingco.,easton,pa.,1980)。[0377]可配制药物组合物以实现生理上相容的ph。在一些实施方案中，药物组合物的ph可例如介于约4或约5和约8.0之间，或介于约4.5和约7.5之间，或介于约5.0和约7.5之间。在示例性实施方案中，药物组合物的ph介于5.5和7.5之间。[0378]本文所述的重组多特异性蛋白质可经由任何合适的施用途径施用给受试者，这些施用途径诸如肠胃外、鼻腔、口服、肺部、局部、阴道或直肠施用。适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、以及使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。另外的细节参见pharmaceuticsandpharmacypractice，j.b.lippincottcompany，philadelphia，pa，banker和chalmers编辑，第238-250页，1982年，以及ashphandbookoninjectabledrugs，toissel，第4版，第622-630页，1986年。[0379]在治疗方案的过程中施用的本公开的活性剂的剂量应足以在从施用时起的临床可接受的时间段(例如，1周至4周或更长(诸如5周至20周或更长))内治疗癌症。在某些实施方案中，该时间段可甚至更长。剂量将由特定活性剂的功效和动物(例如，人)的病症以及有时待治疗的动物(例如，人)的体重来确定。在施用一定剂量时治疗癌症的程度可由例如活性剂的细胞毒性或用活性剂实现的肿瘤消退程度来表示。测量重组多特异性蛋白质的细胞毒性的方法和测定肿瘤消退的方法是本领域已知的。以举例的方式并且不旨在限制本公开，本公开的活性剂的剂量可以是约0.0001g/kg受试者体重/天至约1g/kg受试者体重/天、约0.0001g/kg体重/天至约0.001g/kg体重/天、或约0.01mg至约1g/kg体重/天。剂量单位也可以rag/m2表示，其是指以毫克/平方米身体表面积表示的量。[0380]本文所述的重组多特异性蛋白质可与另一种治疗剂(诸如另一种抗癌剂)组合使用。每种治疗剂可同时施用(例如，在相同药物中或同时施用)、并行施用(即，在单独的药物中以任何顺序一个接一个地施用)或以任何顺序依次施用。当组合疗法中的治疗剂为不同剂型(例如，一种药剂是片剂或胶囊剂，并且另一种药剂是无菌液体)和/或以不同给药方案施用时，顺序施用可能是有用的，例如，至少每天施用的化学治疗剂和较不频繁施用的生物治疗剂，诸如每周一次、每两周一次或每三周一次。[0381]实施例[0382]实施例1—多特异性结合蛋白质的设计[0383]生成各种格式的多特异性结合蛋白，并确定它们的fap特异性、cd40活化的功效和效力。这些多特异性蛋白质都包含fap特异性结合结构域和cd40特异性结合结构域。评价以下项的影响：(i)添加人血清白蛋白(hsa)结合结构域，(ii)通过添加另外的cd40结合结构域增加化合价，以及(iii)改变结合结构域在蛋白内的顺序。[0384]为了比较不同的格式，建立了体外测定，测量在cd40触发时在人b细胞上表达的共刺激受体cd86的上调。该细胞测定在存在或不存在表达fap的细胞的情况下使用原代人b细胞。评价cd86共刺激分子的上调作为b细胞活化的标志物。将抗cd40单克隆抗体(其作用机制不依赖于fap介导的交联)用作参考材料。[0385]不同格式的多特异性蛋白质。从包含一个fap特异性结合结构域和一个cd40特异性结合结构域的亲本分子(seqidno:59；sma014)开始，生成若干种多特异性蛋白质格式，如表2中所汇总。[0386]表2.各种结构域格式的多特异性蛋白质[0387]seqidno/构建体名称格式seqidno:59/sma014fcseqidno:60/sma087hfcseqidno:61/sma095hfchseqidno:62/sma104fccseqidno:63/sma091hfccseqidno:64/sma099hfcchseqidno:65/as579hhfccseqidno:66/sma105fccc[0388]表2中的“c”、“f”和“h”分别表示特异性结合cd40、fap和hsa的锚蛋白重复结构域。如表2中所示的不同结构域的顺序反映了蛋白质的分子结构中从n末端到c末端的结构域的实际序列。为了便于纯化，所有蛋白质在n末端另外具有his标签(seqidno:57)。[0389]材料和方法[0390]作为参照，使用cd40单克隆抗体。该cd40mab(一种igg2mab)与cd40结合导致独立于fap的抗原呈递细胞的活化。抗cd40mab对应于us7,338,660b2的序列21.4.1。[0391]将cho细胞在37℃、5％co2处在含有10％fbs的dmem培养基中培养，并且每2-3天使用accutase分离细胞。[0392]表达fap的cho细胞系是在细胞表面上表达人fap的稳定转染的克隆细胞系。含有人fap的orf的gfp融合体的质粒从origenetechnologies(#rg204692)获得。使用标准分子生物学技术亚克隆编码人fap(无gfp)的cdna。然后使用脂质体将该质粒转染到cho细胞中以产生过表达人fap的稳定转染子。使用不同浓度的遗传霉素g-418(promega，v8091)施加选择压力。使用对应于esc11的抗fap抗体(wo2011/040972)通过流式细胞术分析fap的表达。来自条件1.9mg/mlg-418(fap-cho-1.9)的fap-cho转染子群体显示出较低的fap表达水平，而来自条件1.7mg/ml(fap-cho-1.7)的那些转染子群体显示出较高的fap表达水平。使用fap-cho-1.7生成本实施例中的数据。[0393]体外b细胞活化测定。体外b细胞活化测定的设计在图1中示意性地示出。血沉棕黄层从苏黎世献血中心获得并用pbs稀释。然后使用leucosep管通过密度离心分离外周血单核细胞(pbmc)。在若干洗涤步骤之后，根据制造商的建议使用阳性选择(人cd19microbeads试剂盒)从pbmc中富集人cd19+b细胞。将1×105个细胞/孔的cd19+b细胞和5×104个细胞/孔的表达fap的cho细胞或cho野生型(wt-cho)细胞连同剂量滴定(400nm、200nm、40nm、8nm、5nm、1.6nm、0.3nm、0nm)的指定分子一起接种到96孔板中的含或不含600μmhsa的rpmi1640培养基+10％fbs中。将培养物在37℃、5％co2处温育24小时，并且使用attunenxt通过流式细胞术评估cd20+b细胞上cd86和cd69的上调。[0394]facs染色、流式细胞仪设置和抗体稀释。将细胞首先用150μlpbs洗涤，然后在室温(rt)处用100μl在pbs中稀释(1:100)的bd人fc-block温育20分钟。在fc阻断温育后，将细胞与100μl在facs缓冲液中稀释的直接标记的抗体(参见下表3的稀释因子)一起温育，并在4℃处在黑暗中再温育20分钟。将细胞用pbs洗涤，重新悬浮于100μl在pbs中稀释(1:1000)的live/dead染色液中，并在4℃处在黑暗中温育20分钟。添加100μl含有fbs反应的facs缓冲液以终止live/dead染色反应。将细胞再次用pbs洗涤，并根据制造商的建议使用在水中稀释(1:10)的bdcellfix溶液固定。抗体的稀释度和facs设置在下表3中汇总。根据制造商的建议(thermofisher；abctm总抗体补偿珠粒试剂盒)，用补偿珠粒对facs机器进行补偿。使用flowjo软件(第10.0.3版)分析raw_fcs文件。使用live-dead区分染料对活细胞进行门控，然后对cd20阳性细胞进行门控，如图2中针对cd86所示。输出cd86的mfi和阳性细胞百分比，并使用graphpadprism软件第8.1.2版作图。[0395]表3[0396]fsc：200ssc：400采集：200ul/min，100.000个事件[0397]靶标荧光色素稀释度稀释介质通道电压cd20apc-cy71:100facs缓冲液bl2400cd86pe1:200facs缓冲液yl1380cd69apc1:200facs缓冲液rl-1400live/deadaqua1:1000pbsvl2400[0398]ec50确定。使用graphpadprism第7.02版通过以下方式确定ec50值：以对数模式转换x值(浓度)，并用用于确定ec50值的可变斜率(三个参数)公式在非线性模式对数(激动剂)与应答中拟合。[0399]功效确定。使用graphpadprism第7.02版通过计算最高浓度(400nm)下mfi值的重复平均值来确定功效值。[0400]结果[0401]hsa结合结构域削弱双特异性fapxcd40锚蛋白重复结合蛋白(f-c格式)的效力和功效。以不同格式克隆f-c格式的双特异性fapxcd40分子sma014，添加一个(h-f-c，sma087)或两个(h-f-c-h，sma095)hsa结合锚蛋白重复结构域，并在体外b细胞活化测定中进行测试。如图3所示，hsa结合结构域削弱了f-c格式的原始双特异性结合蛋白的效力和功效，并且削弱水平与添加到结合蛋白中的hsa结合结构域的数量相关。重要的是，在存在模拟人血清中白蛋白的生理浓度的600μm白蛋白的情况下，抑制更为明显。有理由假设复合hsa结合物/白蛋白可能对cd40和/或fap结构域的结合以及由此产生的活性产生空间削弱。正如预期，蛋白质和抗cd40mab以剂量依赖性方式上调cd86，并且蛋白质仅在存在表达fap的cho细胞的情况下具有活性(图3)。在不存在和存在hsa的情况下，hsa结合结构域不影响fap特异性作用模式。正如预期，激动性抗cd40mab独立于fap表达诱导人b细胞的活化，从而在存在fap-cho或wt-cho细胞的情况下活化b细胞。两个独立实验的ec50(效力)和最大mfi(功效)平均值分别在表4和表5(对于fap-cho)中以及表6(对于wt-cho)中汇总。[0402]总之，半衰期延长hsa结合结构域的添加削弱了双特异性fapxcd40结合蛋白(f-c格式)的功能，抑制随着添加的hsa结合结构域的数量而增加，并且在存在生理浓度的白蛋白的情况下，抑制更为明显。[0403]cd40的二价增加效力和功效并且挽救由hsa结合结构域诱导的抑制作用。然后申请人研究了cd40化合价如何影响双特异性fapxcd40分子的性能。以不同格式克隆f-c格式的双特异性fapxcd40分子sma014，添加一个(f-c-c，sma104)或两个(f-c-c-c，sma105)cd40结合darpin结构域，并在体外b细胞活化测定中进行测试。如图4所示，二价和三价格式诱导更强的cd86上调，表明化合价有利于分子的性能。具体地，在存在表达fap的cho细胞的情况下，cd40二价(sma104)强效增加了分子的效力(20倍)和功效(2倍)。与cd40二价相比，cd40三价(sma105)仅引起分子的效力轻微增加，但不进一步影响功效。在不存在fap的情况下，二价cd40格式(sma104)不诱导人b细胞上cd86的上调，而三价cd40格式(sma105)在不存在最高浓度的fap的情况下也显示出轻微活化，表明三价cd40结合物可能诱导fap非依赖性活化。鉴于这些结果，选择二价cd40格式用于进一步表征。具体地，申请人测试了cd40二价是否可以挽救hsa结合结构域的抑制作用。为了解决这个问题，克隆二价cd40构建体sma104，其在不同位置具有另外的hsa结合结构域(克隆sma091、sma099和as579；关于它们的结构域格式的信息参见上表2)。与sma014相比，所有测试格式都显示出改善的效力和功效(图5a)。重要的是，在存在hsa的更接近生理的条件下，具有hsa结合结构域的所有格式的活性都降低，但是与sma014相比，sma091仍然显示出改善的活性(图5b)。在不存在fap的情况下，即使在最高浓度下，也没有锚蛋白重复结合蛋白增强cd86在b细胞上的表达(图5a和图5b)。正如预期，激动性抗cd40mab独立于fap表达诱导人b细胞的活化，从而用fap-cho或wt-cho活化b细胞。两个独立实验的ec50(效力)和最大mfi(功效)平均值分别在表4和表5(对于fap-cho)中以及表6(对于wt-cho)中汇总。[0404]表4[0405][0406]表5[0407][0408]表6[0409][0410][0411]结论：f-c格式的双特异性fapxcd40锚蛋白重复蛋白在功能性细胞测定中显示出良好的生物活性并且显示出良好的物理特性。然而，该结合蛋白可能需要半衰期延长结构域以允许其临床开发。因此，分析不同的格式以确定半衰期延长hsa结合结构域的数量和位置是否以及如何影响分子的活性。观察到半衰期延长结构域对分子的活性具有有害作用，并且该作用随着半延长结构域的数量和hsa的存在而增加。此外，随后惊讶地发现，cd40二价(通过具有两个cd40结合结构域)强效增加了结合蛋白的效力(20倍)和功效(2倍)，并且保持了严格的fap特异性作用机制，但是cd40三价(通过具有三个cd40结合结构域)与cd40二价相比仅轻微增加了效力，并且没有显示出对功效的任何进一步影响。此外，三价cd40结合蛋白在最高浓度下在不存在fap的情况下也显示出轻微活化，表明fap特异性作用模式部分丧失。进一步发现cd40二价能够通过增加结合蛋白的效力和功效来挽救一个半衰期延长结构域的抑制作用。具体地，在hsa的生理浓度下，h-f-c-c格式的结合蛋白保留与f-c格式的结合蛋白相当的活性和fap特异性。总之，通过添加第二个cd40结合结构域，我们可以防止hsa结合半衰期延长结构域的有害作用，并生成具有与f-c格式的亲本结合蛋白相似的功能特性但配有半衰期延长结构域的分子，这将促进其临床开发。出于所有这些原因，选择h-f-c-c结构域格式用于进一步研究。该格式用于本发明的结合蛋白，该结合蛋白包含以下实施例中所述的seqidno:5(蛋白质#5或仅“蛋白质#5”)、seqidno:6(蛋白质#6或仅“蛋白质#6”)或seqidno:7(蛋白质#7或仅“蛋白质#7”)的氨基酸序列。[0412]实施例2-本发明的多特异性结合蛋白的生物物理特性、结合亲和力和结合特异性[0413]本实施例描述了用于确定本发明的多特异性结合蛋白的(1)生物物理特性，诸如聚集体形成，以及(2)对各种靶蛋白(即fap、cd40和血清白蛋白)的结合亲和力和物种交叉反应性的实验。[0414]聚集体形成[0415]通过尺寸排阻色谱法(sec)和多角度光散射(mals)分析蛋白质#5(在本文中有时也称为sma136)。图6示出了该分析的结果。该sec曲线证明了蛋白质#5在溶液中是单体的和单分散性的并且不形成聚集体。[0416]对靶蛋白的结合亲和力[0417]概述。通过表面等离振子共振(spr)分析蛋白质#5(“蛋白质#5”)与人、食蟹猴和小鼠的cd40、fap和血清白蛋白的结合。结果显示，蛋白质#5特异性结合(i)人和食蟹猴来源的cd40，(ii)人、小鼠和食蟹猴来源的血清白蛋白，以及(iii)人和食蟹猴来源的fap。未检测到与小鼠cd40和小鼠fap的特异性结合。蛋白质#5的动力学参数汇总于表7中。蛋白质#5与人cd40、人fap和人血清白蛋白结合的spr迹线示于图7中。[0418]表7.蛋白质#5与不同物种(人、小鼠或食蟹猴)的cd40、血清白蛋白和fap结合的动力学参数。[0419][0420]*这些值表示一式两份测量的平均值[0421]**这些值表示一式三份测量的平均值[0422]chi2/rmax》10％被定义为不准确的拟合[0423]！由于芯片上msa的强效非特异性结合，高估了蛋白质#5上的msa结合的kd[0424]n.d.：由于未进行平行测定，因此未确定标准偏差[0425]材料和方法。[0426]使用proteonxpr36仪器(biorad)和含有0.005％tween的pbsph7.4运行缓冲液(pbst)进行所有spr测量。使用1:1langmuir模型拟合spr迹线。[0427]蛋白质#5与不同物种的cd40结合的proteon设置。用本领域已知的标准方法将不同物种(人、食蟹猴、小鼠)的cd40蛋白(acrobiosystem)生物素酰化，得到bio-hcd40、bio-ccd40和bio-mcd40蛋白。将bio-hcd40、bio-ccd40和bio-mcd40蛋白固定在nlc芯片(biorad)上，分别达到300ru、250ru和300ru的水平。通过以3nm、1.5nm、0.75nm、0.38nm和0.19nm的系列稀释度注射蛋白质#5，使用100μl/min的恒定流速以120s的缔合和900s的解离测量蛋白质#5与cd40的相互作用。将测量重复两次或三次，并且使用10mm甘氨酸ph2以100μl/min的流速在各个测量之间再生靶标18s。相对于经运行缓冲液(pbst)处理的对照泳道，对信号进行双重参考。[0428]蛋白质#5与不同物种的血清白蛋白结合的proteon设置。首先，将人fap(hfap)包被在glc芯片(biorad)上至700ru的水平，然后将50nm蛋白质#5作为分析物以100μl/min的恒定流速固定120s(解离0s)至120ru的水平。通过以100nm、33nm、11nm和3.7nm的系列稀释度注射人血清白蛋白(hsa)、食蟹猴血清白蛋白(csa)和小鼠血清白蛋白(msa)，使用100μl/min的恒定流速以120s的缔合和600s的解离测量血清白蛋白与蛋白质#5的结合。连续测量hsa、csa和msa结合，并且每次用10mm甘氨酸ph2以100μl/min的流速再生hfap/蛋白质#5复合物18s。因此，蛋白质#5必须在每个再生步骤后重新固定在hfap上。相对于对照泳道，对信号进行双重参考((a)pbst运行缓冲液；(b)用蛋白质#5不结合的非相关靶标包被)。在解离的前300s计算动力学。[0429]蛋白质#5与不同物种的fap结合的proteon设置。将hfap、食蟹猴fap(cfap)和小鼠fap(mfap)固定在glc芯片(biorad)上的10mm乙酸钠缓冲液ph5.3中，分别达到1200ru、800ru和2000ru的水平。通过以50nm、25nm、12nm、6.5nm和3.13nm的系列稀释度施用蛋白质#5，使用100μl/min的恒定流速以120s的缔合和1800s的解离测量fap和蛋白质#5的相互作用。使用10mm甘氨酸(ph2)和124mmh3p04再生靶标。相对于经pbst处理的对照泳道，对信号进行双重参考。[0430]结果和结论[0431]表面等离振子共振测量显示，蛋白质#5分别以103±12pm和101±11pm的基本上相同的结合亲和力(kd)紧密结合人和食蟹猴cd40。蛋白质#5不与小鼠cd40交叉反应，这可能是由于仅57.5％的细胞外结构域的低序列同一性。蛋白质#5显示出以50nm的结合亲和力(kd)与人血清白蛋白的结合。此外，蛋白质#5显示出分别以0.307nm和0.339nm的相似结合亲和力(kd)与人和食蟹猴fap的结合，而对于小鼠fap未检测到交叉反应性。[0432]实施例3-通过表面等离振子共振分析蛋白质#5与cd40、fap和血清白蛋白的同时结合[0433]以下实验描述了进行表面等离振子共振实验，该实验分析包含seqidno:5的多特异性蛋白质分别与人cd40、人fap和人血清白蛋白的同时结合。[0434]材料和方法。使用proteonxpr36仪器(biorad)进行spr测量。运行缓冲液是含有0.005％tween的pbsph7.4(pbst)。将生物素酰化的人cd40(bio-hcd40-fc)固定在中和亲和素(neutravidin)包被的nlc传感器芯片上，达到550ru的水平。在第一分析步骤(分析物1)中，以120s的缔合和0s的解离将25nm蛋白质#5固定在bio-hcd40上。该第一步骤之后直接是第二分析物步骤(分析物2)，在此期间以120s的缔合和0s的解离注射pbst、25nm蛋白质#5或50nmhfap。在第三步骤(分析物3)中，以120s的缔合和600s的解离施用pbst、50nmhfap或50nmhsa(注射方案：参见表8)。整个实验以100μl/min的恒定流速进行。只有当蛋白质#5(分析物1)已结合到cd40(固定在芯片上)时，该设置才允许结合hfap和hsa。信号以pbst处理的l6和a6对照泳道进行双重参考。[0435]表8.spr测量的注射方案[0436][0437]结果。蛋白质#5与hcd40、hfap和hsa同时结合的spr迹线示于图8中。简而言之，将550ru生物素酰化的人cd40固定在中和亲和素芯片上。在第一缔合步骤中，蛋白质#5饱和结合hcd40，达到200ru的总信号，如图8注射1所示。在第二缔合步骤(图8，注射2)中，hfap结合到复合物蛋白质#5/cd40，导致200ru的增加。必须注意，在注射1与注射2之间的时间间隔期间，蛋白质#5已经开始从hcd40解离(损失75ru)。第三缔合步骤(图8，注射3)导致人血清白蛋白与复合物hcd40/蛋白质#5/hfap结合(增加80ru)，表明蛋白质#5与所有三种靶标同时结合。[0438]总之，表面等离振子共振研究的结果显示，蛋白质#5能够同时结合cd40、fap和血清白蛋白。[0439]实施例4-经由cd40活化人b细胞[0440]本研究的目的是评估多特异性结合蛋白，包含seqidno:5的蛋白质#5和包含seqidno:6的蛋白质#6的生物活性和fap特异性作用机制。在存在或不存在表达fap的细胞的情况下，使用原代人b细胞在细胞测定中测试蛋白质#5和蛋白质#6。评价共刺激分子、具体地cd86和cd69的上调作为由cd40信号传导介导的b细胞活化的标志物。将具有不依赖于fap介导的交联的作用机制的抗cd40单克隆抗体用作参考材料。与参考材料相比，评价蛋白质#5或蛋白质#6的效力、功效和fap特异性。[0441]在人b细胞活化测定中获得的体外数据显示，蛋白质#5和蛋白质#6可经由cd40活化来活化b细胞，如通过cd86和cd69的上调所反映的那样，并且蛋白质#5和蛋白质#6可以仅在fap阳性细胞的存在下而不在fap阴性细胞的存在下活化b细胞，证实了严格依赖于fap介导的交联的作用机制。[0442]材料和方法[0443]基本上如实施例1所述进行体外b细胞活化测定、facs染色、流式细胞仪设置和抗体稀释、ec50确定和功效确定。[0444]用作参照的抗cd40抗体以及表达fap和非表达fap的cho细胞如实施例1所述。[0445]结果[0446]蛋白质#5和蛋白质#6以fap依赖性作用机制诱导人b细胞中的共刺激分子的上调。在表达fap的cho细胞的存在下，评估蛋白质#5和蛋白质#6经由cd40活化人b细胞的能力。蛋白质#5诱导与表达fap的cho细胞共培养的人b细胞中共刺激分子cd86和cd69的上调，其中ec50为0.04nm-0.07nm(图9)。相反地，蛋白质#5在非表达fap的cho细胞、野生型(wt)-cho细胞的存在下不活化人b细胞(图10)。正如预期，激动性抗cd40mab独立于fap表达诱导人b细胞的活化，从而用fap-cho或wt-cho活化b细胞。蛋白质#6获得了与蛋白质#5类似的结果。[0447]结论[0448]蛋白质#5和蛋白质#6仅在fap阳性cho细胞的存在下，而不在fap阴性cho细胞的存在下，在原代人b细胞中诱导两种不同共刺激分子cd86和cd69的上调，证实了严格依赖于fap介导的交联的作用机制。在fap的存在下，蛋白质#5显示出与比较抗cd40单克隆抗体类似的效力和功效。在表达fap的cho细胞的存在下，蛋白质#5以剂量依赖性方式诱导共刺激分子的上调，其中ec50为0.04nm-0.07nm。蛋白质#6获得了类似的结果。[0449]实施例5-经由cd40活化人树突状细胞[0450]用人单核细胞衍生的树突状细胞(mddc)进行概念上与实施例4中针对b细胞所述相似的研究(参见图11中的示意图)。[0451]本研究的目的是评估mddc上的多特异性结合蛋白，包含seqidno:5的蛋白质#5和包含seqidno:6的蛋白质#6的生物活性和fap特异性作用机制。在存在或不存在表达fap的细胞的情况下，使用人mddc在细胞测定中测试蛋白质#5和蛋白质#6。评价共刺激分子、具体地cd86、cd83和cd80的上调和il-12的分泌作为由cd40信号传导介导的mddc活化的标志物。将具有不依赖于fap介导的交联的作用机制的抗cd40单克隆抗体用作参考材料。与参考材料相比，评价蛋白质#5或蛋白质#6的效力、功效和fap特异性。[0452]在人mddc活化测定中获得的体外数据显示，蛋白质#5和蛋白质#6可经由cd40活化来活化mddc，如通过共刺激分子的上调和il-12的分泌所反映的那样，并且蛋白质#5和蛋白质#6可以仅在fap阳性细胞的存在下而不在fap阴性细胞的存在下活化mddc，证实了严格依赖于fap介导的交联的作用机制。蛋白质#5能够在表达fap的cho细胞的存在下，而不在fap阴性cho细胞的存在下，以剂量依赖性方式诱导共刺激分子的上调和il-12的分泌，其中ec50分别为0.03nm-7.67nm和0.83nm-7.63nm。用蛋白质#6获得了类似的结果。[0453]总之，该研究显示，蛋白质#5和蛋白质#6能够经由cd40在体外以fap依赖性方式活化人mddc。[0454]实施例6-蛋白质#7体内抗肿瘤活性[0455]以下实施例评价了重复剂量的多特异性结合蛋白蛋白质#7在鼠mc38结肠癌模型中的剂量依赖性体内功效。蛋白质#7是蛋白质#5或蛋白质#6的小鼠替代物，其包含结合小鼠fap的fap结合结构域和结合小鼠cd40的cd40结合结构域。mc38癌模型先前已被证明对cd40激动剂处理敏感。由于据发现，同基因小鼠肿瘤诸如mc38与人肿瘤基质相比表达非常低水平的基质fap，因此转染mc38细胞系以表达fap，从而更好地模拟在人肿瘤中观察到的fap表达。[0456]在所述研究pd1032、pd1033、pd1035和pd1038中，蛋白质#7(具有n末端his标签(seqidno:57)；也称为as598)以2.5mg/kg的剂量测试，并且在研究pd1032和pd1033中，还以12.5mg/kg的剂量测试。将可商购获得的结合小鼠cd40的抗cd40抗体(fgk45；bioxell)用作阳性对照。将蛋白质#7的非fap结合变体(称为as608；具有n末端his标签(seqidno:57)的seqidno:67)用作阴性对照分子以证明蛋白质#7的药理学活性对mfap结合的依赖性，其中fap结合结构域被非结合锚蛋白重复结构域替代。[0457]本发明的多特异性结合蛋白诸如蛋白质#7旨在局部活化肿瘤组织中的cd40，以降低全身毒性。因此，为了评估蛋白质#7的安全性，与已知诱导肝毒性的抗mcd40抗体相比，除肿瘤生长和抑制之外，还测定了全身毒性的若干参数，包括体重减轻、血清细胞因子和转氨酶升高以及肝组织损伤。[0458]材料和方法：[0459]肿瘤实验：如图12示意性所示进行肿瘤实验。将同基因小鼠(c57bl/6jrj)用mc38-mfap多克隆肿瘤细胞皮下接种到右胁腹区域(第0天)。将小鼠随机分成处理组，并在同一天处理(第25天为pd1032，第39天为pd1033，第26天为pd1035，第37天为pd1038)。然后根据如表9所示的预定方案将测试制品(as598、as608、fgk45)施用于荷瘤小鼠(还可参见图12)。每3至4天通过卡尺测量监测肿瘤生长，直到接种后第36、43、36和40天。在实验的第36天(pd1032和pd1035)，处死小鼠，去除肿瘤，并通过流式细胞术进行免疫表型分析。在实验的第43天(pd1033)和第40天(pd1038)，处死小鼠，去除肿瘤，并通过流式细胞术进行免疫表型分析。[0460]pd1032和pd1035是两个独立的主要抗肿瘤功效研究，而pd1033和pd1038是两个相邻的facs肿瘤环境分析研究。在主要研究中，as598以2.5mg/kg(研究pd1032、pd1035)和12.5mg/kg(研究pd1032)的剂量每四天施用三次。非fap靶向的对照as608以2.5mg/kg每四天施用三次(研究pd1035)。在facs分析的早期终止研究中，以2.5mg/kg(研究pd1033、pd1038)和12.5mg/kg(研究pd1033)的剂量施用as598两次，其间相隔三天。类似地以2.5mg/kg的剂量施用非fap靶向的对照as608两次，其间相隔三天(研究pd1038)。抗cd40抗体fgk45在所有研究中用作阳性对照，并且以与蛋白质相同的方案以5mg/kg(与as598的摩尔剂量相等，为2.5mg/kg)施用。[0461]表9.研究设计-实验组[0462]pd1032和pd1035：[0463][0464][0465]pd1033和pd1038：[0466][0467]注：n：动物数量；pd10033中的小鼠/组数量与pd1038不同(n/n)[0468]肿瘤接种：在标准异氟烷麻醉下，将90只(pd1032+pd1033)或105只(pd1035+pd1038)雌性c57bl6小鼠用0.2mlpbs中的mc38-mfap多克隆肿瘤细胞(9×106)皮下接种到右后胁腹/背部区域，以进行肿瘤发展。[0469]肿瘤测量：从肿瘤接种后第15天(pd1032和pd1033)或第14天(pd1035和pd1038)，每周进行两次肿瘤测量。用卡尺测量肿瘤的长度和宽度。用下式计算肿瘤体积：(长度×(宽度)2×π)/6。[0470]随机化：在肿瘤接种后第25、39、26和37天进行基于肿瘤体积的组随机化。在初始的90只(pd1032和pd1033)移植了肿瘤的小鼠中，将40只在肿瘤接种(pd1032)后25天分别随机分成4个子组，每组10只动物。在肿瘤接种(pd1033)后39天，将剩下的50只小鼠分别随机分成4个子组，每组5只动物。在初始的105只(pd1035和pd1038)移植了肿瘤的小鼠中，将40只在肿瘤接种(pd1035)后26天分别随机分成4个子组，每组10只动物。在肿瘤接种(pd1038)后37天，将剩下的65只小鼠分别随机分成4个子组，每组6只动物。[0471]观察结果和数据收集：在组随机化之后，每周检查动物两次，在此期间进行体重和肿瘤测量。还检查动物的肿瘤生长和处理对正常行为的任何影响，诸如活动性、食物和水消耗的视觉估计、体重增加/损失、眼睛/毛发无光泽和任何其他异常影响。基于每个子集内的动物数量记录死亡和观察到的临床征象。[0472]采样：取出肿瘤，称重并用于facs，并且将剩余材料固定在福尔马林中。取出脾脏，一半用于facs，另一半固定在福尔马林中。取出肝脏并固定在福尔马林中。在multivette600zgel(sarstedt#15.1674)中，在第24、26和36天采集pd1032的血样，在第43天采集pd1033的血样，在第27和36天采集pd1035的血样，在第41天采集pd1038的血样，并且以15,000rpm离心5分钟。收获血清并储存在-80℃以用于可能的后续分析。[0473]统计分析：用prism8.2.0软件(graphpadsoftware)进行统计分析。通过使用kruskal-wallis非参数检验，之后与媒介物相比对所有组进行dunn’s多重比较检验，进行具有多重比较的所有统计。为了比较两组之间的差异，进行非参数mann-whitney双尾分析。[0474]肝酶。在鼠模型以及人类的临床试验中，已经证明抗cd40的激动性抗体显著但短暂地增加肝酶，诸如天冬氨酸转氨酶(ast)和丙氨酸转氨酶(alt)。在人类中，ast存在于多种组织中，包括肝、脑、胰腺、心脏、肾、肺和骨骼肌。如果这些组织中的任一个组织被损坏，ast将被释放到血流中。虽然升高的ast水平指示组织损伤，但其本身不特异于肝脏。相反，alt主要存在于肝脏中。alt的任何升高是肝损伤的直接指征。[0475]因此，在这些实验中确定ast和alt水平作为肝毒性的量度。在处理后24小时的时间点进行测量。基于文献和内部时间滴定实验，处理后24小时的时间点是最合适的。根据制造商的指导原则，分别使用试剂盒mak052和mak055(sigma-aldrich)进行alt和ast分析。[0476]细胞因子水平。在第一次注射后24小时(主要研究＝pd1032和pd1035)、第二次注射后24小时(相邻研究＝pd1033和pd1038)和在研究结束时(主要研究＝pd1032和pd1035)从根据图12处理过的mc38-fap结肠癌荷瘤小鼠采血。根据制造商的建议，使用luminex测定(r&dsystems)分析11种不同的细胞因子(tnf-α、il-6、ifn-γ、il12p70、mcp-1、mip-1α、mip-1β、ip-10、il-10、il-2和il-1β)。[0477]肝组织的免疫组织化学(ihc)分析。在第一次注射后24小时收集肝脏，在pbs中洗涤，立即用福尔马林固定并包埋在石蜡块中。对石蜡包埋的肝脏切片进行苏木精/伊红染色，并由病理学家以盲法方式进行分析。[0478]结果：[0479]总体健康和体重。在研究期间，用as598处理未观察到负面健康影响或小鼠体重降低的征象(图13a和图13b)。相比之下，与先前的报道一致，fgk45处理在第一次注射后导致显著但短暂的体重减轻(图13a和图13b)。[0480]肿瘤生长。在研究期间每3-4天测量肿瘤生长。当平均肿瘤体积超过300mm3时，分别在第25天和第26天开始研究pd1032和pd1035中的处理。两个研究中不同处理组的平均肿瘤生长曲线示于图14a和图14b中。[0481]在测试的两个剂量下，与媒介物组相比，as598展示了统计意义上显著的抗肿瘤功效(图14a和图14b)。抗肿瘤功效与用阳性对照抗cd40抗体fgk45观察到的相似。在研究pd1035中使用的非fap结合对照as608不具有任何抗肿瘤功效，表明在该肿瘤模型中观察到的抗肿瘤功效是fap依赖性的。[0482]除肿瘤体积测量之外，在研究结束时从小鼠切下肿瘤并测定肿瘤重量。肿瘤重量测量的结果和结论与肿瘤体积测量的结果和结论一致(数据未示出)。[0483]此外，研究pd1033和pd1038中获得的结果与研究pd1032和pd1035中获得的结果一致(数据未示出)。[0484]血液细胞因子水平。fgk45显著增加所测量细胞因子中的八种细胞因子的血液水平，即tnf-α、il-6、ifn-γ、il12p70、mcp-1、mip-1α、mip-1β和ip-10(图20a，数据未示出)。相比之下，as598(2.5mg/kg或12.5mg/kg)、as608或媒介物不增加任何测量的细胞因子的血液水平(图20a，数据未示出)。[0485]肝酶和损伤。正如预期，fgk45诱导alt水平的显著增加，这在第一次注射后24小时检测到，但在后续注射后未检测到(图20b)。这与文献和先前的内部研究一致。与fgk45相反，as598不诱导alt水平的任何增加(图20b)。除alt之外，在fgk45处理组中第一次注射后24小时ast也有所增加，但在经as598或对照处理的动物中未增加(图20b)。[0486]肝组织的ihc。组织学分析揭示了扩散的组织损伤，其特征在于当用抗mcd40抗体处理小鼠时具有单核白细胞聚集体的血管中心多病灶炎症、血栓形成和坏死(图20c)。相比之下，来自用蛋白质#7处理过的小鼠的肝脏的ihc分析未显示出肝细胞毒性的证据，具有与在经媒介物处理的肝脏中观察到的组织学概况相似的组织学概况(图20c)。[0487]总之，与抗mcd40抗体相反，蛋白质#7在体重减轻、促炎细胞因子(例如il-6、tnfα、ifnγ和il-12p70)升高、转氨酶(ast和alt)水平增加或肝组织损伤方面未显示出全身毒性的征象。[0488]结论：[0489]生成替代小鼠特异性结合蛋白、蛋白质#7，其除了血清白蛋白之外还具有对小鼠fap和小鼠cd40的结合特异性。在基于鼠细胞的体外测定中测试的蛋白质#7显示出与基于人细胞的体外测定中的蛋白质#5和蛋白质#6相当的结果(参见例如实施例4)，从而表现cd40的严格的fap依赖性活化(数据未示出)。如本实施例所示，蛋白质#7(具有n末端his标签；as598)在体内也具有活性并且基本上抑制fap阳性肿瘤的进展。此外，与抗小鼠cd40抗体(fgk45)相反，蛋白质#7的抗肿瘤活性既不与升高的血液细胞因子水平相关，也不与肝毒性的测试指标相关。升高的血液细胞因子水平和肝毒性表现为一些临床cd40活化抗体的剂量限制性毒性。所呈现的数据支持体外和体内的作用模式，其依赖于fap介导的cd40受体的交联，导致肿瘤定位的cd40活化，而不具有外周或肿瘤外器官毒性。[0490]总之，已生成肿瘤靶向的cd40激动性多特异性蛋白，其能够在fap阳性肿瘤中局部活化cd40受体并且在不存在全身毒性的情况下引起显著的抗肿瘤活性。[0491]实施例7：在存在或不存在本发明的多特异性结合蛋白的情况下fap的蛋白酶活性[0492]本实施例描述了fap活性测定，该测定在存在或不存在本发明的各种多特异性结合蛋白的情况下进行，以确定固有fap酶活性是否在多特异性重组蛋白质结合时受到抑制。[0493]fap是一种ii型单跨膜丝氨酸蛋白酶，其表达在组织重塑位点如肿瘤(例如，在》90％的上皮癌的基质成纤维细胞的表面表达，)、伤口愈合、胚胎组织和炎症位点(例如，动脉粥样硬化/关节炎)上高度上调，而fap表达在非患病的成人器官中难以检测到。该非典型丝氨酸蛋白酶具有二肽基肽酶(外肽酶)和肽链内切酶活性两者，在脯氨酸后键处切割底物。在结构上，fap由短细胞质n末端序列(4个氨基酸)、单跨膜螺旋(21个氨基酸)和形成八叶片β-螺旋桨和α/β-水解酶结构域的胞外结构域(735个氨基酸)组成。fap作为同源二聚体具有活性。fap蛋白酶活性必需的催化三联体由残基ser624、asp702和his734组成。活性位点可通过β-螺旋桨的中心孔或通过β-螺旋桨与水解酶结构域的界面处的腔体进入。[0494]fap的蛋白酶活性产生多种底物的裂解，包括神经肽y、i型胶原和α2-抗纤溶酶，而且还产生底物z-gly-pro-amc，其可被外肽酶或内肽酶活性裂解成可用荧光读取器测量的产物。[0495]在fap活性测定中测试的分子汇总于表10中。[0496]表10.测定中使用的重组蛋白质[0497][0498]h＝白蛋白结合结构域[0499]f包含在seqidno:5中的fap结合结构域[0500]f*包含在seqidno:7中的fap结合结构域[0501]c包含在seqidno:5中的cd40结合结构域[0502]c*包含在seqidno:7中的cd40结合结构域[0503]con部分抑制fap活性并充当测定对照的fap结合结构域[0504]fap活性测定。将人fap(hfap)靶标在测定缓冲液(50mmtris，1mnacl，1mg/mlbsa，ph7.5)中稀释至0.67nm，并添加45μl/孔到96孔板中(得到活性测定中0.3nm的最终hfap浓度)。如表10所示，通过将5μl3μm分子添加到靶样品中以500倍摩尔过量施加分子1至5(最终浓度150nm)。最后，添加50μl100μmz-gly-pro-amc底物(最终浓度50μm)以在每个孔中获得100μl的总体积。将分子编号5用作对照以显示fap活性的部分抑制。[0505]在测量前，将板在4000rpm下离心2min以移除任何测定干扰气泡。使用手动增益设置为105％的荧光读取器，在380nm激发和460nm发射下，在95分钟期间内每5分钟测量一次荧光。进行一式四份测量并以平均值和标准偏差示出。[0506]结果。在第一步骤中，在50μm的固定底物浓度下使用0.01nm至1.2nm的fap浓度来测量剂量应答曲线。在95分钟的时间段内在0.3nm的rhfap目标浓度下观察到线性时间依赖性信号增加(每5分钟用0.999的r2测量一次)。为了确定蛋白质结合对fap的酶活性的影响，在fap饱和条件下，通过添加相对于fap(0.3nm)500倍摩尔(150nm)过量的fap结合分子(例如分子编号1(seqidno:5))来进行测定。分子编号1(seqidno:5)的该浓度是分子编号1(seqidno:5)对人fap的结合亲和力(kd＝0.3nm)的500倍。[0507]如图15所汇总，分子编号1至4不抑制固有二肽基fap酶活性。用作为测定对照的另选fap结合分子(分子编号5)观察到部分fap活性抑制。[0508]结论。本发明的多特异性结合蛋白诸如分子编号1(hfcc)或分子编号2(hf*c*c*)或它们的fap结合结构域(f或f*)与fap的结合不影响fap的蛋白酶活性，如通过其切割荧光底物z-gly-pro-amc的能力所测量。[0509]实施例8：本发明的多特异性结合蛋白在肿瘤组织中的优先定位和积累[0510]本实施例描述了为研究本发明的多特异性结合蛋白是否可以在肿瘤组织中优先定位并积累而进行的实验，假定经由与肿瘤组织中表达的fap结合。为此，将实施例6所述的同基因mc38-fap小鼠模型用作合适的实验系统。同样在实施例6描述的蛋白质#7用作本发明的代表性多特异性结合蛋白。[0511]使用三种不同的方法研究蛋白质#7在肿瘤组织中的定位和积累，即spect/ct成像、免疫组织化学(ihc)和体内组织分布分析。[0512]材料和方法[0513]肿瘤接种和处理：如先前所述，将9×106个mc38-fap小鼠结肠癌细胞皮下接种到小鼠的右肩胁腹。当肿瘤达到500mm3的大小时，用约150kbq的放射性缀合分子(蛋白质#7或对照蛋白，其具有对应的四个锚蛋白重复结构域结构并结合hsa，但不结合fap或cd40)注射到小鼠的尾静脉中，对应于2.5mg/kg＝50μg/小鼠。[0514]铟111标记：为了用铟111标记分子，使用马来酰亚胺-dtpa(chematech，目录号：c107，一种对巯基(sh)基团具有特异反应性的双官能螯合剂)将放射性标记缀合到在分子的c末端添加的半胱氨酸的游离sh基团上。在室温(rt)处，将分子在无金属pbs(ph7.4，psi级)和0.05mmedta中搅拌1小时。添加与蛋白质的量相比10倍摩尔过量的马来酰亚胺-dtpa的dmso(sigma-aldrich)溶液并在室温处温育1小时。将反应溶液转移到超滤管(amiconamiconultra15，10kdamw截止值)中，并添加4ml无金属pbs。将管在室温处以4000xg离心6分钟。旋转后，弃去流过物，再添加4ml无金属pbs，并如上所述再次将管离心。将过滤的上清液转移到低蛋白结合的eppendorf反应管中并测定浓度。使用电喷雾电离飞行时间质谱法(esi-tof-ms)确定位点特异性缀合。最终缀合产物储存在4℃处。[0515]spect/ct成像研究：用nanospect/ctplus相机(第1.2版，bioscan)获取单光子发射计算机断层摄影术(spect)/x射线计算机断层摄影术(ct)图像。用软件nucline(第1.02版)进行spect和ct的采集。使用软件nucline重建ct，而对于spect，使用软件hispect(第1.4.3049版，scivisgmbh)。用vivoquanttm后处理软件(第3.5版，invicro,usa)分析spect和ct数据的融合。在成像采集之前，在γ计数管中测量全身活性。在注射111in-分子后4、24、48、72、96小时的时间点，从经麻醉的小鼠(通过吸入2％异氟烷/氧混合物)获取spect/ct体内图像。在注射后96小时获取的图像示于图16a中。每个spect投影每帧花费20秒至60秒，导致每个图像15分钟至45分钟的扫描时间。以55kvp的管电压和145μa的管电流和1000msec/投影的曝光时间进行ct扫描。[0516]ihc研究：将福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)肿瘤组织载玻片最初通过在70℃处保持8分钟的3个循环，随后是在ph7.4(基于edta的溶液，ventana自动染色仪上的cc1条件)下在95℃处保持48分钟的循环去石蜡，以用于抗原修复步骤。然后将载玻片与兔抗抗体缀合物(内部制备，工作浓度：2.0μg/ml)在37℃处温育2小时。使用omnirabbithrp自动分配器(rochediagnostics)通过hrp系统在37℃处检测抗抗体复合物20分钟。最后，将载玻片用苏木精染色，在乙醇梯度(70％》90％》100％&100％，每步1分钟)中脱水，在二甲苯中洗涤2分钟，并用cytoseal封固介质将盖玻片施加到载玻片上。用vectrapolaris扫描载玻片并定性评估蛋白积累。[0517]体内组织分布研究：如上所述处理mc38-fap荷瘤小鼠(肿瘤接种和处理)，并在注射后4、24、48、72或96小时安乐死。切割感兴趣的器官，称重并用γ计数器(packardcobraiigammad5010)以每分钟计数(cpm)确定放射性。然后使用每只小鼠的蛋白总量作为参考值，将每个分析的器官的cpm值转化为每个器官的μg蛋白(μg蛋白/器官)。将μg蛋白/器官转化为每克组织的μg蛋白(μg蛋白/g组织)，并且在图中绘制为每克组织的注射剂量百分比(％id/g)，并表示为平均值±sd，每个时间点使用4只小鼠。[0518]结果[0519]spect/ct成像实验揭示了本发明的多特异性结合蛋白、蛋白质#7在肿瘤组织中的优先定位和积累(图16a)。主要在脾脏中观察到一些肿瘤外摄取，可能是因为蛋白质#7的cd40特异性结构域诱导的靶上分布。[0520]处死mc38-fap荷瘤小鼠，并通过ihc分析肿瘤中分子的存在。ihc分析显示，在肿瘤组织中大量存在本发明的多特异性结合蛋白、蛋白质#7(图16b，上图)。相比之下，在肿瘤组织中未检测到显著水平的结合hsa但不结合fap或cd40的阴性对照分子(图16b，下图)。这些数据证实了肿瘤定位和蛋白质#7的积累是由fap和/或cd40特异性结合结构域介导的。在用阴性对照处理过的肿瘤中观察到的任何微小信号可能是由肿瘤微环境中白蛋白的存在以及阴性对照分子与其的结合引起的，或者仅仅是由于导致分子扩散的组织渗透性。[0521]体内组织分布研究(其中将放射性标记的蛋白质#7或对照蛋白注射到mc38-fap荷瘤小鼠中)显示，本发明的多特异性结合蛋白、蛋白质#7特异性地在肿瘤组织(图16c，左图)中积累，但不在其他器官诸如肌肉(图16c，右图)、骨髓、肝和肾中积累(数据未示出)。与spect/ct研究一致，仅在脾脏中观察到一些肿瘤外积累，最可能是因为cd40在该淋巴器官中表达(数据未示出)。重要的是，结合hsa但不结合fap或cd40的放射性标记的阴性对照蛋白不在肿瘤或任何其他组织中积累。这证实了蛋白质#7的肿瘤定位和积累经由fap和/或cd40特异性结合介导的机制发生。[0522]结论[0523]本实施例中呈现的数据提供了实验证据，表明本发明的多特异性结合蛋白可以fap和/或cd40依赖性方式在肿瘤组织中优先定位并积累。这些结果与fap特异性锚蛋白重复结构域可经由与表达肿瘤的fap的结合有效介导多特异性结合蛋白的肿瘤定位和积累的发现一致。[0524]实施例9：本发明的多特异性结合蛋白的肿瘤抑制依赖于肿瘤中的fap表达[0525]实施例6显示出蛋白质#7(具有n末端his标签；as598)在体内具有活性并且基本上抑制fap阳性肿瘤的进展。在本实施例中，使用具有低fap表达的同基因小鼠模型提供蛋白质#7的fap依赖性作用机制的进一步证据。具体地，使用在体内生成具有非常低的fap表达水平的肿瘤的未转染mc38-wt细胞系进行功效研究。[0526]材料和方法：[0527]肿瘤实验：如图17a示意性所示进行肿瘤实验。将雌性同基因小鼠(c57bl/6j)用mc38-wt结肠癌肿瘤细胞皮下接种到胁腹区域(第0天)。在第7天，基于约77mm3的肿瘤大小将小鼠随机分成处理组。将测试制品(蛋白质#7(具有n末端his标签；as598)和抗cd40抗体)根据如表11所示的预定方案腹膜内(i.p.)施用于荷瘤小鼠。每4天以彼此等摩尔的浓度施用测试制品。每3至4天通过卡尺测量来监测肿瘤生长，直到个体小鼠由于伦理肿瘤体积限制而终止。[0528]表11.研究设计-实验组[0529][0530]n：动物数量[0531]肿瘤接种：在标准异氟烷麻醉下，用0.1mlpbs中的1×106个mc38-wt肿瘤细胞皮下接种到小鼠的胁腹中。[0532]肿瘤测量：肿瘤接种后一周进行两次肿瘤测量。用卡尺测量肿瘤的长度和宽度。用下式计算肿瘤体积：v＝(l×w×w)/2[0533]随机化：在第7天，基于“匹配分布”随机化方法(studydirectortm软件)进行随机化。[0534]观察结果和数据收集：接种肿瘤细胞后，每天检查动物的发病率和死亡率。在常规监测时，检查动物的肿瘤生长和处理对行为的任何影响，诸如活动性、食物和水消耗、体重增加/损失和任何其他异常。记录个体动物的死亡率和观察到的临床征象。[0535]统计分析。使用kruskal-wallis非参数检验进行统计学分析，之后与媒介物相比对所有组进行dunn’s多重比较检验。当*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001时，认为结果是显著的。[0536]结果和结论：[0537]如图17b所示，在该faplow肿瘤模型中，与媒介物相比，蛋白质#7未显示出任何统计意义上显著的抗肿瘤功效，因此提供了蛋白质#7的fap依赖性作用机制的进一步证据。不同地，抗cd40抗体(其体内活性与肿瘤微环境中fap的存在无关)如预期抑制肿瘤进展，因此证实mc38-wt肿瘤细胞系对cd40激动剂的敏感性。[0538]实施例10：本发明的多特异性结合蛋白的长期抗肿瘤作用[0539]本实施例描述了一项研究，其中对携带mc38-fap肿瘤的小鼠进行处理，之后进行更长时间的随访，以便进一步研究本发明的多特异性结合蛋白的完全治疗潜力。[0540]材料和方法[0541]肿瘤实验：基本上如先前实施例6中针对研究pd1035和图14b所述进行肿瘤实验，但在这种情况下，随时间推移监测小鼠，并且仅当它们显示出如政府批准的动物方案中定义的痛苦征象时或当肿瘤超过由2000mm3的预定肿瘤大小定义的终点时处死。将测试制品(蛋白质#7(具有n末端his标签；as598)和蛋白质#7的非fap结合变体(as608；具有n末端his标签(seqidno:57)的seqidno:67)，作为阴性对照分子)根据如表12所示的预定方案施用于荷瘤小鼠。每3至4天通过卡尺测量来监测肿瘤生长，直到个体小鼠由于伦理肿瘤体积限制而终止。[0542]表12.研究设计-实验组[0543][0544]n：动物数量[0545]肿瘤接种和随机化：在标准异氟烷麻醉下，用0.2mlpbs中的9×106个mc38-fap肿瘤细胞皮下接种到小鼠的胁腹中。当肿瘤达到约300mm3的平均大小时，如先前所述将小鼠随机化。[0546]肿瘤测量：肿瘤接种后一周进行两次肿瘤测量。用卡尺测量肿瘤的长度和宽度。用下式计算肿瘤体积：v＝(l×w×w×π)/6[0547]观察结果和数据收集：在常规监测时，检查动物的肿瘤生长和处理对行为的任何影响，诸如活动性、食物和水消耗、体重增加/损失和任何其他异常。记录个体动物的死亡率和观察到的临床征象。[0548]结果和结论[0549]结果提供了蛋白质#7能够抑制和排斥mc38-fap肿瘤并赋予针对肿瘤复发的长期保护的证据。mc38-fap肿瘤在最后一次用蛋白质#7处理后约20天不再可检测到(图18a)。此外，用蛋白质#7处理过的小鼠在接种后存活至少200天(即整个测量期)，表明蛋白质#7的抗肿瘤作用是持久且长期的(图18b)。相比之下，用结合cd40靶标但不结合fap靶标的阴性对照处理过的mc38-fap肿瘤的进展与媒介物组相似(图18a)，并且小鼠死亡或必须以与媒介物组相似的速率处死(图18b)。这些数据证实了蛋白质#7在体内的抗肿瘤作用机制的fap依赖性。总之，这些数据提供了本发明的多特异性结合蛋白可以在mc38-fap肿瘤小鼠模型中以fap依赖性方式引起强效且持久的抗肿瘤活性的证据。[0550]实施例11：通过本发明的多特异性结合蛋白诱导保护性抗肿瘤免疫记忆[0551]携带确立的mc38-fap肿瘤的小鼠在用蛋白质#7处理后能够排斥肿瘤至不可检测的大小，如图18所示。用mc38-fap肿瘤细胞再次攻击相同的无肿瘤小鼠，以便研究由蛋白质#7诱导的可能的抗肿瘤免疫记忆。[0552]材料和方法[0553]肿瘤实验：基本上如先前在实施例6中针对研究pd1035和图14b和在实施例10中针对图18b所述进行肿瘤实验和处理，并且在用mc38-wt或mc38-fap肿瘤细胞(分别为0.2mlpbs中的1或9×106个细胞/小鼠)再次攻击之前，监测用蛋白质#7处理过的小鼠约120天。同时，用完全相同的肿瘤细胞攻击原初小鼠。每3至4天通过卡尺测量来监测肿瘤生长，直到个体小鼠由于伦理肿瘤体积限制而终止。[0554]结果和结论[0555]在初始的弱肿瘤生长后，先前用蛋白质#7处理过的所有小鼠完全排斥经再次攻击的mc38-fap肿瘤(图19a)，表明存在免疫抗肿瘤记忆应答。有趣的是，在用mc38-wt肿瘤细胞再次攻击的小鼠中观察到相同的现象(图19a)，表明蛋白质#7有助于建立免疫记忆，其不限于fap相关抗原，而是更广泛地涉及肿瘤抗原。此外，用mc38-wt或mc38-fap肿瘤细胞接种的原初对照组清楚地显示出使用过的肿瘤细胞的致瘤能力(图19b)，因此证实了图19a所示的经再次攻击的小鼠中肿瘤生长的不存在是由于免疫介导的抗肿瘤应答。总之，获得了实验证据，表明本发明的多特异性结合蛋白具有诱导保护性抗肿瘤免疫记忆的能力，而且该免疫记忆不限于mc38-fap肿瘤模型中的fap相关抗原。[0556]实施例12：cd40特异性结合蛋白所结合的人肿瘤坏死因子受体超家族成员5(hcd40)的复合物的x射线结构分析[0557]本研究的目的是使用x射线晶体学来生成和分析本发明的cd40特异性结合蛋白所结合的重组hcd40的复合物。用于该结构分析的cd40特异性结合蛋白是具有seqidno:3的氨基酸序列的蛋白。[0558]材料和方法[0559]蛋白质产生。在存在阻断糖基化的衣霉素的情况下在hi5细胞中表达hcd40。经由his-trap、thb消化、阴性his-trap和sec纯化来自培养上清液的蛋白质。将纯化的hcd40与cd40特异性蛋白(seqidno:3)以1:1.2的比率混合。经由sec在10mmhepes/naohph7、150mmnacl中从hcd40:蛋白复合物中除去过量的蛋白。将样品浓缩至36.7mg/ml。该过程产生纯度大于95％的均质蛋白质，如根据考马斯染色的sds-page判断的。[0560]结晶。将纯化的蛋白质用于结晶试验中，所述结晶试验采用大约1200种不同条件的标准筛选，以及使用文献数据鉴定的结晶条件。使用标准策略优化最初获得的条件，系统地改变严重影响结晶的参数，诸如温度、蛋白质浓度、滴比等。还通过系统地改变ph或沉淀剂浓度来精化这些条件。[0561]最终结晶条件：[0562]30％w/vpeg4k[0563]0.24mliso4[0564]0.1mtrisph＝8.50[0565]0.35mnabr[0566]数据收集和处理。将晶体快速冷冻并在100k的温度处测量。使用低温条件在swiss光源(sls,villigen,switzerland)下从与配体蛋白质(seqidno:3)结合的hcd40的复合物晶体中收集x射线衍射数据。晶体属于空间群c2。使用程序autoproc、xds和autoproc、aimless处理数据。蛋白质的数据收集和处理统计在下表13中列出。[0567]表13[0568][0569][0570]1swiss光源(sls,villigen,switzerland)[0571]2括号中的值是指最高分辨率组。[0572][0573]其中ih,i是h的第i次测量的强度值[0574]其中ih,i是h的第i次测量的强度值[0575]5由独立反射计算[0576]6精度指示[0577]结构建模和精化。通过分子置换获得确定和分析结构所需的相位信息。将先前解析的hcd40的结构用作搜索模型。根据标准方案分别用coot和软件包ccp4进行随后的模型构建和精化。对于自由r因子(一种交叉验证最终模型的正确性的量度)的计算，将约4.9％的测量反射从精化程序中排除(参见下表14)。进行tls精化(使用refmac5、ccp4)，这使得r因子更低且电子密度图的质量更高。应用自动生成的本地ncs约束(更新的refmac5版本的关键字“ncsrlocal”)。用grade(globalphasinglimited)进行配体参数化和相应文库文件的生成。通过将水分子置于用refmac5在3.0处轮廓化的fo-fc图的峰值中，并用coot的验证工具检查所有水，用coot的“findwaters”算法建立水模型。可疑水的列表的标准为：b因子大于2fo-fc图小于1.2σ，到最近接触点的距离小于或大于3.5a。手动检查可疑水分子以及配体结合位点中的可疑水分子(到配体的距离小于)。最终模型的ramachandran图显示，所有残基中92.2％在最有利区域中，7.8％在额外允许区域中，并且0.0％在宽松允许区域中。在不允许区域中没有发现残基(表14)。最终结构和精化过程的统计结果在下表14中列出。[0578]表141[0579][0580]1如refmac5中定义的值，无sigma截止值[0581]2测试集包含4.9％的测量反射[0582]3与几何目标值的均方根偏差[0583]4用moleman计算[0584]5用procheck计算[0585]结果[0586]将该结构解析并精化至最终分辨率为使用x射线晶体学进行结构分析揭示了蛋白(seqidno:3)与cd40受体(seqidno:51)的富含半胱氨酸的结构域(crd)1(氨基酸23-59)结合，并且它在与cd40配体(cd40l)的结合位点相反的一侧与cd40受体结合，表明darpin蛋白与cd40l之间不存在直接结合位点竞争(图21a和图21b)。cd40受体的crd1结构域远离细胞膜定位。[0587]据报道，强效的cd40激动剂抗体结合cd40受体的膜远端表位(yu等人，cancercell33,664-675e664(2018))。类似地，本实施例中描述的x射线晶体学研究显示cd40特异性结合蛋白(seqidno:3)与远离细胞膜的cd40受体的crd1相互作用。如已经针对cd40激动剂抗体所提出的，更远离细胞膜的表位可导致更少的空间位阻，从而允许更好地接近包含定位剂分子的cd40特异性结合蛋白(诸如包含seqidno:5或seqidno:6的氨基酸序列的重组蛋白质)以及更有效地聚集，因此更有效地活化cd40受体。此外，cd40特异性结合蛋白(seqidno:3)与crd1之间的相互作用区域被证明与cd40l的结合位点相反，表明本发明的结合蛋白与cd40l之间不存在直接结合竞争。不竞争cd40l的化合物可与配体具有加和或协同作用，从而使得更好地活化受体(参见例如，yu等人，同前；challa等人，allergy54,576-583(1999)；pound等人，intimmunol11,11-20(1999))。[0588]按照本说明书内引用的参考文献的教导内容最彻底地理解本说明书。本说明书内的实施方案提供了对本发明实施方案的说明，并且不应理解为限制本发明的范围。技术人员容易认识到，本发明涵盖许多其他实施方案。本公开中引用的所有出版物、专利和genbank序列均全文以引用方式并入。在以引用方式并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何此类材料。对本文任何参考文献的引用不是承认此类参考文献是本发明的现有技术。[0589]本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下实施方案涵盖。当前第1页12当前第1页12